ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2014 года по МПК A61K36/714 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости анемических состояний и их влияние на продолжительность и качество жизни пациентов [1, 2], является основанием широкого применения гемостимулирующих средств в медицинской практике.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].

Недостатком данных средств является зачастую их невысокая эффективность и высокая частота побочных эффектов [3, 4].

Задачей решаемой настоящим изобретением является расширение арсенала высокоэффективных гемостимулирующих средств.

Поставленная задача достигается применением суммы дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского в качестве гемостимулирующего средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве гемостимулирующего средства суммы дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского.

Используемое оригинальное средство суммы дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского было разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г.Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г.Иркутск). Дитерпеновые алкалоиды извлекались из сырья (травы аконита байкальского) в виде свободных оснований экстракцией хлороформом, отделялись и идентифицировались по стандартной методике [5].

В практической медицине для лечения анемических состояний, представляющих собой как самостоятельные заболевания, так и патологический синдром, встречающийся при различных нозологиях, наиболее широкое распространение получили средства на основе рекомбинантных форм естественных регуляторов гемопоэза (цитокинов): эритропоэтина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гранулоцитомакрофагального колоние-стимулирующего фактора [1-3]. При этом белковая природа указанного вещества предопределяет существование единственно возможного - парентерального пути его введения в организм и значительного риска развития побочных эффектов и осложнений [4, 5], обусловленных иммуногенностью данных факторов роста.

В то же время в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН была показана принципиальная возможность и высокая эффективность управления функциями мезенхимальных стволовых клеток с помощью дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского [6]. При их пероральном приеме обнаружено выраженная стимуляция стромальных родоначальник клеток кожи, сопровождаемая ускорением процесса регенерации поверхностных тканей [6].

При этом влияние дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского на процессы регенерации кроветворной ткани и возможность стимуляции гемопоэза за счет активации родоначальных клеток крови не известны. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения суммы дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции гемопоэза, для специалиста является не очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 62 мышах линии СВА, Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (2002) [7].

Пример 1

Используемое оригинальное средство получали из травы аконита байкальского. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и загружалась в перколятор. Через 2 часа после загрузки заливают в него 2000 мл хлороформа. Экстракцию хлороформом проводили на лабораторной установке непрерывного действия, состоящей из перколятора, пленочного испарителя и прямого холодильника. Непрерывную циркуляцицию растворителя проводили со скоростью 2 л/ч. Продолжительность исчерпывающей экстракции составляла 5 дней. Сконцентрированный хлороформный экстракт из перколятора сливался через нижний кран перколятора и концентрировался в испарителе. Полученный хлороформный экстракт алаклоидов очищали от неалкалоидных соединений экстракцией водным раствором серной кислоты. Дальнейшую очистку суммы алкалоидов проводили повторной хлороформной экстракцией из сернокислого извлечения после нейтрализации и подщелачивания его до рН=9-10. Для избавления от следов щелочи его промывали 50 мл воды. Затем хлороформный экстракт фильтровали через осушитель (15 г безводного сульфата натрия). На последней стадии полученную сумму алкалоидов упаривали досуха. Выход продукта составлял 0,23%. Получено растительное средство, содержало сумму алкалоидов: напеллин, зонгорин, мезаконитин, гипаконитин и N-окись 12-эпинапеллина. Полученные алкалоиды разбавляли дистиллированной водой и доводили их канцентрацию до 0,0005%.

Пример 2

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [7].

Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинно введения раствора 5-фторурацила (5-ФУ) в ¹/₂ максимально переносимой дозы (МПД) (114 мг/кг). Начиная со следующего дня после введения цитостатика мыши опытной группы получали per os 0,0005% - водный раствор суммы алкалоидов по 0,05 мг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме (0,2 мл).

На 5, 8-е и 12-е сут после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции СО2. У опытных и контрольных мышей общепринятыми методами определяли содержание ретикулоцитов в периферической крови, а также показатели костномозгового кроветворения (общее количество миелокариоцитов, миелограмма) [8]. Содержание коммитированных клеток - предшественников эритропоэза (КОЕ-Э) и стромальных механоцитов (КОЕ-Ф) в костном мозге, а также продукцию эритропоэтически активных субстанций (ЭПА) прилипающими и неприлипающими элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) определяли с помощью культуральных методов in vitro [8].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В случаях отклонения распределения вариант в выборках от нормального для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента введение 5-ФУ приводило к развитию глубокой продолжительной депрессии эритроидного ростка кроветворения. На протяжении всего сроки исследования отмечалось падение содержания эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани и количества ретикулоцитов в периферической крови (до 10,2% и 0,0% от фона на 5-е сут соответственно). Вместе с тем имела место выраженная компенсаторная реакция со стороны пула кроветворных предшественников. Регистрировалось возрастание числа костномозговых КОЕ-Э (табл.1), связанное с повышением продукции гемопоэтинов (ЭПА) прилипающими и неприлипающими миелокариоцитами. Кроме того, было выявлено возрастание функциональной активности мезенхимальных прекурсоров (табл.2), играющее важную роль в восстановлении поврежденного данным цитостатическим агентом ГИМ [9].

Введение алкалоидов приводило к значительному повышению интенсивности восстановления процессов эритропоэза. Наблюдалось увеличение содержания эритрокариоцитов в костном мозге, которое на 8-е сут эксперимента достигало уровней фоновых показателей и составляло 190,4% от аналогичных значений у животных цитостатического контроля (табл.1). Отражением ускорения регенерации гемопоэтической ткани явилось появление значительного количества ретикулоцитов в периферической крови на 5-е сут (35,63% от фона) и возрастание их числа в остальные сроки наблюдения: до 1151,0% и 237,7% от контроля на 8-е и 12-е сут соответственно.

Исследование механизмов гемостимулирующего действия алкалоидсодержащего препарата выявило зависимость формирования картины крови и костного мозга от состояния пула костномозговых родоначальных клеток. Введение раствора исследуемого фармакологического вещества сопровождалось резким увеличением содержания эритроидных прекурсоров в гемопоэтической ткани на 5-е и 12-е сут опыта (до 132,6% и 347,6% от цитостатического контроля соответственно) (табл.1).

При этом реакция со стороны кроветворных предшественников во многом определялась изменением секреторной функции стромальных элементов ГИМ. В ходе эксперимента регистрировалось возрастание выработки эритропоэтически активных субстанций прилипающими миелокариоцитами на 5, 8-е сут исследования. В то же время алкалоиды аконита байкальского не влияли на мобильную фракцию нуклеаров костного мозга. Выработка ЭПА неприлипающими клетками микроокружения оставалась на уровне контрольных значений (табл.2).

Кроме того, в ходе углубленного изучения влияния исследуемой смеси веществ на локальные механизмы регуляции эритропоэза была установлена еще одна особенность фармакологического действия алкалоидов в отношении стромальных прогениторных клеток костного мозга. Введение препарата на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии приводило к снижению уровня содержания фибробластных КОЕ на 5 сут опыта в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой (табл.2). Исходя из сведений литературы [6] о стимулирующем влиянии алкалоидов аконита байкальского на мезенхимальные предшественники с преимущественной активацией процессов их дифференцировки, следует, что развитие выявленного феномена могло явиться результатом ускорения созревания данных родоначальных элементов. При этом соответствие динамики изменений изучаемого параметра таковой в цитостатическом контроле (табл.2), когда имеет место значительное участие КОЕ-Ф в регенерации ГИМ [9]. указывает на компенсаторный характер вызываемых препаратом сдвигов. Причем, развитие описанной реакции со стороны мезенхимальных прекурсоров, вероятно, послужило основой описанного выше (стимуляция секреции ЭПА прилипающими миелокариоцитами) повышения роли стромального компонента ГИМ в восстановлении подавленного 5-ФУ эритропоэза за счет образования de novo функционально активных прилипающих миелокариоцитов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженных гемостимулирующих свойствах суммы дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского при их пероральном использовании. При этом механизмом ускорения регенерации кроветворной ткани является активация родоначальных гемо поэтических клеток за счет как прямого действия на них алкалоидов [6], так и в результате возрастания фидерной способности стромального компартмента ГИМ. Кроме того, выявлена важная роль изменения функциональной активности фибробластных предшественников в реализации гемостимулирующих эффектов предлагаемого средства.

Цитируемая литература:

1. Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol.15. - P.825-827.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: ОО «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

3. Волкова М.А.. Ширин А.Д. Эритропоэтин в лечении анемии при онкологических заболеваниях // Гематол. и трансфузиол. - 1997. - Т.42. - №6. - С.33-36.

4. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857

5. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А, Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов // Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г., С.79-84.

6. Зюзьков Г.Н,, Крапивин А.В., Нестерова Ю.В,, Поветьева Т.Н., Жданов В.В, Суслов Н.И., Фомина Т.И.. Удут Е.В., Мирошниченко Л.А,, Симанина Е.В., Семенов А.А., Кравцова С.С., Дыгай А.М. Механизмы регенераторного действия дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского // Бюл, эксперим. биол. и медицины. - 2012. - №6. - С.823-827.

7. Дыгай А.М., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1 (9). - С.29-32.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

9. Dygai А.М., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V., et al. Effect of Transplantation of Peripheral Blood Mononuclears Obtained Using Granulocytic Colony-Stimulating Factor and Hyalu-ronidase on Regeneration of Hemopoietic Tissue during Myelosuppression // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009. - Vol.148. - №1. - P.120-125.

Таблица 1. Динамика содержания эритроидных клеток в костном мозге, ретикулоцитов в периферической крови, КОЕ-Э в костном мозге мышей линии CBA/CaLac после введения дистиллированной воды (1) либо суммы алкалоидов (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ¹/₂ МПД, (X±m; Р) Сроки исследования, сутки Группы Эритроидные клетки
(×10⁶/‰бедро) Ретикулоциты (%о) КОЕ-Э (×10⁵ нуклеаров) до введения   1,77±0,32 36,00±2,05 22,00±3,02 5 1 0,18±0,05* 0 51,67±3,57* 2 0,31±0,08* 12,83±2,77 68.50±247*# 8 1 1,04±0,16 3,33±0,76* 73,33±4,89* 2 1,98±0,30# 38,33±1,26# 40,00±7,61# 12 1 0,59±0,08* 14,33±0,49* 20,33±2,91 2 0,81±0,21* 34,00±1,03# 70,67±7,52*# Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Таблица 2. Динамика уровней эритропоэтической активности в супернатантах от неприлипающих, прилипающих кариоцитов костного мозга, содержания КОЕ-Ф в костном мозге мышей линии CBA/CaLac после введения дистиллированной воды (1) либо суммы алкалои-дов (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ¹/₂ МПД, (X±m; Р) Сроки исследования, сутки Группы ЭПА от прилипающих миелокариоцитов ЭПА от неприлипающих миелокариоцитов КОЕ-Ф (на 2,5×10⁵ миелокариоцитов) до введения   2,33±0,33 4,0±0,73 9,00±0,73 5 1 4,33±0,67* 6,33±0,67 16,00±1,98* 2 4,17±0,65*# 13,00±1,90*# 9,33±0,67# 8 1 4,33±1,09 9,00±0,58 7,17±0,79 2 4,50±0,96 12,17±1,5*# 8,17±1,01 12 1 2,50±0,72 6,0±1,32* 3,33±0,84* 2 2,17±0,40 9,51±1,69# 1,83±0,48* Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к гемостимулирующему средству. Применение суммы дитерпеновых алкалоидов травы аконита байкальского: напеллин, зонгорин, мезаконитин, гипаконитин и N-окись 12-эпинапеллина, полученных экстракцией хлороформом, в качестве гемостимулирующего средства. Вышеописанное средство обладает выраженным гемостимулирущим действием. 2 табл., 2 пр.

Применение суммы дитерпеновых алкалоидов травы аконита байкальского: напеллин, зонгорин, мезаконитин, гипаконитин и N-окись 12-эпинапеллина, полученных экстракцией хлороформом, в качестве гемостимулирующего средства.