Способ оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий Российский патент 2020 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к аллергологии и иммунологии, в частности к способам оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

Предлагаемый способ может быть использован при изучении сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, изолированных от реагирующих на туберкулин животных.

При проведении аллергического диагностического исследования, с использованием туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (далее ППД для млекопитающих), в благополучных по туберкулезу хозяйствах, регистрируются случаи, когда здоровые животные реагируют на вводимый ППД для млекопитающих. Лабораторное изучение причин проявления аллергической реакции на ППД для млекопитающих, демонстрирует в организме животных наличие атипичных микобактерий [Найманов А.Х. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулез, паратуберкулез) / А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин.- М.: «Зооветкнига», 2014. - 235 с.]. В свою очередь, изучение причины проявления аллергической реакции на ППД для млекопитающих осуществляют путем оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий.

Известен способ оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, используемый для подтверждения причины аллергической реакции на ППД для млекопитающих, в благополучных по туберкулезу хозяйствах [Наставление по диагностике туберкулеза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации. Москва. - 2002. - 60-61 с.], который выбран за прототип. При реализации способа, атипичные микобактерий, выделенные из материала от животного, реагирующего на ППД для млекопитающих, подкожно вводят 2 морским свинкам, в дозе 1 мг/мл. Спустя 21-30 дней, после введения атипичных микобактерий, морских свинок исследуют симультанной аллергической пробой, с аллергеном очищенным комплексным из атипичных микобактерий (далее КАМ), в дозе 10 ЕД/0,1 мл и ППД для млекопитающих, в дозе 5 МЕ/0,1 мл, инъецируя разведения внутрикожно, в предварительно депилированные участки кожи, на боках животного с левой и правой сторон. Аллергическую реакцию, учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция характеризуется гиперемией кожи и образованием припухлости диаметром 5 и более миллиметров, иногда с некрозом в месте введения КАМ и ППД для млекопитающих. Обнаружение аллергической реакции на один или оба препарата свидетельствует о сенсибилизирующих свойствах изучаемых атипичных микобактериях.

Недостатками этого способа являются невозможность оценить сенсибилизирующие свойства различных видов атипичных микобактерий, обусловленные тем, что:

- различные виды атипичных микобактерий характеризуются различной сенсибилизирующей способностью, при использовании дозировки 1 мг/мл [Найманов А.Х. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулез, паратуберкулез) / А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин. - М.: «Зооветкнига», 2014. - 235 с.];

- временной интервал, используемый для оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий (менее 28-30 дней) является недостаточным, для развития аллергической реакции на ППД для млекопитающих, у морских свинок [Европейская Фармакопея 7-е издание, том 1. Совет Европы Страсбург, с. - 3944];

- использование одной дозы КАМ и одной дозы ППД для млекопитающих не позволяет характеризовать разные виды атипичных микобактерий с неодинаковой сенсибилизирующей способностью.

Технической задачей является повышение точности способа оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий.

Основной задачей, при разработке заявленного способа, являлось определение двух доз КАМ и двух доз ППД для млекопитающих эквивалентные по биологической активности, позволяющие по интенсивности аллергической реакции у морских свинок оценить сенсибилизирующие свойства атипичных микобактерий.

Техническая задача достигается способом оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, включающем подкожное введение 2-3 морским свинкам альбиносам, или морским свинкам с белыми боками, исследуемого вида атипичных микобактерий в дозе 1 мг/мл. Отличительной особенностью предлагаемого технического решения является то, что спустя 30-35 дней, после сенсибилизации морских свинок исследуемыми атипичными микобактериями, проводят постановку симультанной аллергической пробы, с использованием двух доз КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл, инъецируемые внутрикожно в правую боковую поверхность кожи морских свинок, а также двух доз ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл и 5 МЕ/0,1 мл, инъецируемые внутрикожно в левую боковую поверхность кожи морских свинок. Через 24 часа после введения двух доз КАМ и двух доз ППД для млекопитающих проводят определение значений интенсивности аллергической реакции на две дозы КАМ и две дозы ППД для млекопитающих и сравнение значений интенсивности аллергической реакции максимальной дозы КАМ и максимальной дозы ППД для млекопитающих между собой, а также сравнение значений интенсивности аллергической реакции минимальной дозы КАМ и минимальной дозы ППД для млекопитающих между собой.

Большая интенсивность аллергической реакции на две дозы КАМ в сравнении с значениями интенсивности аллергической реакции на две дозы ППД для млекопитающих характеризует исследуемый вид атипичных микобактерий обладающий сенсибилизирующей способностью.

Большая интенсивность значений аллергической реакции на максимальную дозу КАМ, в сравнении с интенсивностью значений максимальной дозы ППД для млекопитающих при отсутствии аллергической реакции на минимальную дозу КАМ и минимальную дозу ППД для млекопитающих свидетельствует, что исследуемый вид атипичных микобактерий характеризуется низкой сенсибилизирующей способностью.

КАМ представляет собой иммунобиологический препарат, в состав которого входят белковые соединения атипичных микобактерий комплекса М. avium-intracellulare. КАМ характеризуется более широким антигенным спектром, в сравнении с препаратами, изготовленными с использованием одного вида микобактерий. Поэтому КАМ позволяет выявить сенсибилизацию обусловленную различными видами атипичных микобактерий.

ППД для млекопитающих представляет собой иммунобиологический препарат, состоящий из видовых белковых соединений микобактерий бычьего вида. ППД для млекопитающих, при внутрикожном введении животным, позволяет выявлять сенсибилизацию, обусловленную типичными микобактериями.

Вместе с тем, учитывая, что ППД для млекопитающих содержит незначительное количество родовых антигенов других видов микобактерий при исследовании на туберкулез может регистрироваться перекрестная аллергическая реакция, обусловленная сенсибилизацией животного организма атипичными микобактериями, дифференцировку, которой возможно осуществить, используя симультанную аллергическую пробу с ППД для млекопитающих и КАМ.

Заявленное изобретение от прототипа отличается тем, что оценку сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий проводят через 30-35 дней, после сенсибилизации морских свинок исследуемыми атипичными микобактериями, а постановку симультанной аллергической пробы проводят с использованием двух доз КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл, инъецируемые внутрикожно в правую боковую поверхность кожи морских свинок, а также двух доз ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл и 5 МЕ/0,1 мл, инъецируемые внутрикожно в левую боковую поверхность кожи морских свинок.

Одновременное использование двух доз КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл а также двух доз ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл и 5 МЕ/0,1 мл, согласно предлагаемого способа предпочтительнее, чем при использовании одной дозы КАМ 10 ЕД/0,1 мл и одной дозы ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл, согласно прототипа. Так использование двух доз КАМ и двух доз ППД для млекопитающих позволяет характеризовать атипичные микобактерий с различной сенсибилизирующей способностью, при их введении морским свинкам в количестве 1 мг/мл.

Способ осуществляется следующим образом. Приготавливают на физиологическом растворе суспензию атипичных микобактерий в концентрации 1 мг/мл. Полученную суспензию в дозе 1 мг/мл., подкожно инъецируют 2-3 морским свинкам альбиносам, или морским свинкам с белыми боками. Через 30-35 суток, после введения морским свинкам суспензии атипичных микобактерий, на боковых поверхностях справа и слева удаляют шерсть на участках размером 100 × 40 мм. После этого справа внутрикожно инъецируют дозу КАМ 125 ЕД/0,1 мл, через 30 мм инъецируют дозу КАМ 25 ЕД/0,1 мл Слева внутрикожно инъецируют дозу ППД для млекопитающих 25 МЕ/0,1 мл, через 30 мм инъецируют дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл Через 24 часа, после введения двух доз КАМ и двух доз ППД для млекопитающих, проводят оценку интенсивности аллергической реакции, сравнивая значения, полученные на максимальную дозу КАМ и максимальную дозу ППД для млекопитающих между собой и значения, полученные на минимальную дозу КАМ и минимальную дозу ППД для млекопитающих между собой.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Проводится изучение сенсибилизирующих свойств разных видов атипичных микобактерий: М. scrofulaceum, М. intracellulare, М. fortuitum. Для этого каждый вид атипичных микобактерий (М. scrofulaceum, М. intracellulare, М. fortuitum) в дозе 1 мг/мл, подкожно инъецировали 15 морским свинкам, массой 350-400 грамм (5 морским свинкам инъецировали М. scrofulaceum; 5 морским свинкам инъецировали М. intracellulare; 5 морским свинкам инъецировали М. fortuitum). Через 30 дней, после инъекции разных видов атипичных микобактерий, 9 морским свинкам (3 морским свинкам, которым инъецировали М. scrofulaceum; 3 морским свинкам, которым инъецировали М. intracellulare; 3 морским свинкам, которым инъецировали М. fortuitum) согласно предлагаемого способа, на боковых поверхностях, справа и слева удаляли шерсть на участках размером 100 × 40 мм. После удаления шерсти, справа инъецировали две дозы КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл, расстояние между инъекциями соответствовало 30 мм. Слева инъецировали две дозы ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл и 5 МЕ/0,1 мл, расстояние между инъекциями соответствовало 30 мм. Другим 6 морским свинкам (2 морским свинкам, которым инъецировали М. scrofulaceum; 2 морским свинкам, которым инъецировали М. intracellulare; 2 морским свинкам, которым инъецировали М. fortuitum), согласно прототипа, удаляли шерсть справа и слева на боковых поверхностях тела животного размером 30×30 мм и внутрикожно справа инъецировали КАМ, в дозе 10 ЕД/0,1 мл, а слева ППД для млекопитающих, в дозе 5 МЕ/0,1 мл Через 24 часа, после введения разведений КАМ и разведений ППД для млекопитающих, у всех животных осуществили оценку интенсивности аллергической реакции. Результаты исследования см. табл. 1.

При оценке сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий М. scrofulaceum по способу, описанному в прототипе видно, что у одной морской свинки аллергическая реакция как на одну дозу КАМ 10 ЕД/0,1 мл, так и на одну дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл не выявлялась, что не позволяет охарактеризовать исследуемый вид атипичных микобактерий по данной морской свинке. В то время как у второй морской свинки аллергическая реакция выявлялась только на одну дозу КАМ, что предполагает наличие сенсибилизирующих свойств исследуемого вида атипичных микобактерий. Таким образом, способ изучения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий реализованный на двух морских свинках, согласно прототипа, является не точным.

При оценке сенсибилизирующих свойств микобактерий М. scrofulaceum, по предлагаемому способу видно, что аллергическая реакция у всех используемых морских свинок выявлялась на две дозы КАМ и одну дозу ППД для млекопитающих. При сопоставлении значений аллергической реакции на максимальную дозу КАМ 125 ЕД/0,1 мл и на максимальную дозу ППД для млекопитающих 25 МЕ/0,1 мл между собой видно, что интенсивность аллергической реакции больше на максимальную дозу КАМ 125 ЕД/0,1 мл При сопоставлении значения аллергической реакции на минимальную дозу КАМ 25 ЕД/0,1 мл и минимальную дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл видно, что значение интенсивности аллергической реакции больше на минимальную дозу КАМ 25 ЕД/0,1 мл Полученные результаты свидетельствуют о сенсибилизирующих свойствах исследуемого вида атипичных микобактерий. Точность предлагаемого способа в сравнении с прототипом, выше.

При оценке сенсибилизирующих свойств микобактерий М. intracellulare по способу, описанному в прототипе видно, что у одной морской свинки аллергическая реакция как на одну дозу КАМ 10 ЕД/0,1 мл, так и на одну дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл не выявлялась, что не позволяет охарактеризовать исследуемый вид атипичных микобактерий по данной морской свинке.

В то время как у второй морской свинки аллергическая реакция выявлялась только на одну дозу КАМ 10 ЕД/0,1 мл, что предполагает наличие сенсибилизирующих свойств. Таким образом, способ изучения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий реализованный на двух морских свинках, согласно прототипа, является не точным.

При оценке сенсибилизирующих свойств микобактерий М. intracellulare по предлагаемому способу видно, что аллергическая реакция выявлялась на две дозы КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл и две дозы ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл и 5 МЕ/0,1 мл, у двух используемых морских свинок, а также на две дозы КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл и одну дозу ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл, у одной морской свинки. При сопоставлении значения аллергической реакции на максимальную дозу КАМ 125 ЕД/0,1 мл, и на максимальную дозу ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл между собой видно, что интенсивность аллергической реакции больше на максимальную дозу КАМ 125 ЕД/0,1 мл При сопоставлении аллергической реакции на минимальную дозу КАМ 25 ЕД/0,1 мл и минимальную дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл видно, что у всех животных интенсивность аллергической реакции больше на минимальную дозу КАМ.

Полученные результаты свидетельствуют о сенсибилизирующих свойствах исследуемого вида атипичных микобактерий. Точность предлагаемого способа в сравнении с прототипом, выше.

При оценке сенсибилизирующих свойств микобактерий М. fortuitum по способу, описанному в прототипе видно, что у всех морских свинок аллергическая реакция на одну дозу КАМ 10 ЕД/0,1 мл, и на одну дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл не выявлялась, что не позволяет охарактеризовать исследуемый вид атипичных микобактерий.

При оценке сенсибилизирующих свойств микобактерий М. fortuitum по предлагаемому способу видно, что у всех морских свинок аллергическая реакция выявлялась только на две дозы КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл При сопоставлении аллергической реакции на максимальную дозу КАМ 125 ЕД/0,1 мл и на максимальную дозу ППД для млекопитающих 25 МЕ/0,1 мл видно, что интенсивность аллергической реакции больше на максимальную дозу КАМ. При сопоставлении аллергической реакции на минимальную дозу КАМ 25 ЕД/0,1 мл и минимальную дозу ППД для млекопитающих 5 МЕ/0,1 мл видно, что интенсивность аллергической реакции больше на минимальную дозу КАМ. Полученные результаты свидетельствуют о сенсибилизирующих свойствах исследуемого вида атипичных микобактерий. Точность предлагаемого способа, в сравнении с прототипом, выше.

Предложенный способ прост в исполнении, является более точным и информативным в сравнении с прототипом.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий. Для этого осуществляют подкожное введение 2-3 морским свинкам-альбиносам, или морским свинкам с белыми боками, исследуемого вида атипичных микобактерий в дозе 1 мг/мл. Последующую оценку сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий проводят через 30-35 дней после сенсибилизации. Проводят постановку симультанной аллергической пробы с использованием двух доз аллергена очищенного комплексного из атипичных микобактерий (КАМ) и двух доз туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. Оценку интенсивности аллергической реакции на две дозы КАМ и две дозы ППД проводят через 24 часа. Сравнивают значения интенсивности аллергической реакции на максимальные и минимальные дозы КАМ и ППД для млекопитающих между собой. Отсутствие аллергической реакции на минимальную дозу КАМ и минимальную дозу ППД для млекопитающих свидетельствует о низкой сенсибилизирующей способности исследуемого вида атипичных микобактерий. Изобретение обеспечивает повышение точности способа оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий. 1 табл., 1 пр.

Способ оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, включающий подкожное введение 2-3 морским свинкам-альбиносам, или морским свинкам с белыми боками, исследуемого вида атипичных микобактерий в дозе 1 мг/мл, отличающийся тем, что оценку сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий проводят через 30-35 дней, после сенсибилизации морских свинок, путем постановки симультанной аллергической пробы, с использованием двух доз КАМ -125 ЕД/0,1 мл и 25 ЕД/0,1 мл. инъецируемых внутрикожно в правую боковую поверхность кожи морских свинок, а также двух доз ППД для млекопитающих -25 МЕ/0,1 мл и 5 МЕ/0,1 мл, инъецируемых внутрикожно в левую боковую поверхность кожи морских свинок, определение через 24 часа значений интенсивности аллергической реакции на две дозы КАМ и две дозы ППД для млекопитающих и сравнение значений интенсивности аллергической реакции максимальной дозы КАМ и максимальной дозы ППД для млекопитающих между собой, а также сравнение значений интенсивности аллергической реакции минимальной дозы КАМ и минимальной дозы ППД для млекопитающих между собой, большая интенсивность значений аллергической реакции на две дозы КАМ в сравнении со значениями интенсивности аллергической реакции на две дозы ППД для млекопитающих характеризует исследуемый вид атипичных микобактерий, обладающий сенсибилизирующей способностью, большая интенсивность значений аллергической реакции на максимальную дозу КАМ в сравнении с интенсивностью значений максимальной дозы ППД для млекопитающих при отсутствии аллергической реакции на минимальную дозу КАМ и минимальную дозу ППД для млекопитающих свидетельствует, что исследуемый вид атипичных микобактерий характеризуется низкой сенсибилизирующей способностью.