Способ дифференциации M. avium subsp. paratuberculosis от других видов микобактерий на сенсибилизированных этими видами микобактерий морских свинках Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к аллергологии и иммунологии, в частности к способам усиления сенсибилизирующих свойств различных видов микобактерий и может быть использовано в ветеринарной и медицинской практиках при изучении сенсибилизирующих свойств микобактерий и дифференциации М. avium subsp. paratuberculosis (MAP) от других видов микобактерий.

Паратуберкулез - хроническая инфекционная болезнь, в основном жвачных животных, чаще всего протекающая латентно, характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов и как следствие - сопровождающаяся расстройством работы желудочно-кишечного тракта (диареей), потерей продуктивности, прогрессирующим истощением - вплоть до летального исхода.

Паратуберкулез остается одной из недостаточно изученных, сложно контролируемых инфекций. Инкубационный период длится от 6 месяцев до 15 лет, возможны случаи самоизлечения, т.е. клиническая картина может не проявиться в течение всей жизни животного. При этом латентно больные животные могут стать носителями МАР, и периодически выделяя возбудителя во внешнюю среду, создавать условия для распространения паратуберкулеза в стаде.

Некоторые авторы сравнивают проблему паратуберкулеза с «верхушкой айсберга» (айсберг-эффект), когда на один клинический случай приходятся десятки случаев инфицированных животных в латентной форме [Н.П. Овдиенко и соавт., 2007; А.И. Завгородный и соавт. 2010; А.Х. Найманов и соавт., 2018, 2022].

В 1912 году T.W. Twort, Y.Z. Ingram выделили возбудителя из подвздошной кишки больной коровы и назвали его Mycobacterium enteridis chronicae bovis. В дальнейшем возбудитель заболевания был квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а болезнь названа паратуберкулезом. После исследований с применением молекулярно-генетических методов было установлено, что гены М. avium и М. paratuberculosis на 99% гомологичны. Впоследствии, по предложению M.F. Thorel et al. (1990), возбудитель паратуберкулеза стали считать подвидом микобактерий птичьего вида - Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP).

Микобактерий паратуберкулеза «вездесущи» в окружающей внешней среде, их обнаруживают в кишечнике, фекалиях, молоке, крови крупного рогатого скота. Тем не менее выявить эти микобактерий у животных и во внешней среде достаточно сложно, так как они не могут быть идентифицированы при бактериоскопии, а только молекулярно-генетическими методами [A. Wiczniewska et. al., 2002; R. Greenstein, 2003; В.И. Литвинов и соавт., 2008].

При паратуберкулезе нет высокоэффективных методов диагностики, лечения и вакцинопрофилактики. Большим препятствием в разработке эффективных методов диагностики является отсутствие биологической модели для воспроизведения болезни. Многочисленные попытки воспроизвести паратуберкулез у лабораторных животных не увенчались успехом.

По мнению многих исследователей ни один из существующих методов диагностики паратуберкулеза не обладает 100% эффективностью, поэтому рекомендуется применять комплексный подход к диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота [J. Larson, 2002].

В соответствии 28 издания «Кодекса здоровья наземных животных МЭБ» от 2019 года при паратуберкулезе нет рекомендуемых тестов, а в качестве альтернативных тестов предлагается внутрикожная туберкулиновая проба и иммуноферментный анализ.

В «скрытости» инфекции, низкой чувствительности и специфичности методов диагностики, сложности выделения, культивирования и идентификации возбудителя в отсутствии возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных - заключаются основные сложности в установлении диагноза на паратуберкулез.

Паратуберкулез крупного рогатого скота регистрируют во многих странах мира. По данным ООН, болезнь признана серьезной проблемой современности со значительными экономическими последствиями. Экономический ущерб слагается из снижения продукции животноводства, потери молочной продуктивности, истощения, бесплодия, выбраковки или гибели больных животных.

В настоящее время паратуберкулез остается менее изученной инфекцией, чем другие хронические инфекционные болезни животных.

Уровень техники

Известен способ оценки сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, являющийся наиболее близким аналогом предлагаемого способа, включающий введение культуры атипичных микобактерий подкожно двум морским свинкам в дозе 1 мг/мл. Спустя 21-30 дней после введения культуры микобактерий морских свинок исследуют симультанной аллергической пробой с КАМ (сокращенно КАМ - комплексный аллерген из атипичных микобактерий) в дозе 10 ЕД и ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 25 ТЕ (что соответствует дозе выраженной в эквивалентных единицах активности международного стандарта используемого в настоящее время 5 ME) в объеме 0,1 мл физиологического раствора или растворителя микобактериальных аллергенов.

Указанные разведения аллергенов вводят внутрикожно с левой и правой стороны в депилированные участки кожи на боках животного. Реакцию учитывают через 24-48 часов. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи и образованием припухлости диаметром 5 мм или более, иногда с некрозом в центре. Обнаружение реакции на один или оба препарата свидетельствует о сенсибилизирующих свойствах изучаемой культуры атипичных микобактерий [Наставление по диагностике туберкулеза животных. Утверждена Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 2002 г. стр. 60-61].

Недостатком этого способа сенсибилизации является низкая сенсибилизирующая способность нетуберкулезных непатогенных микобактерий для морских свинок (кроме микобактерий относящиеся к патогенным видам М. bovis и М. tuberculosis).

Технической проблемой является необходимость создания способа усиления сенсибилизации морских свинок различными видами микобактерий с целью повышения информативности и точности способа оценки сенсибилизирующих свойств микобактерий паратуберкулеза, расширение арсенала способов усиления сенсибилизации морских свинок

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является усиление сенсибилизации морских свинок различными видами микобактерий, повышение сенсибилизирующей роли различных видов микобактерий для последующий оценки уровня сенсибилизации разными видами микобактериальных аллергенов, расширение арсенала способов усиления сенсибилизации морских свинок.

Основной задачей при разработке заявленного способа являлся подбор оптимальной дозы, места введения различных видов микобактерий, адъюванта и микобактериальных аллергенов, позволяющих по интенсивности проявления кожной реакции ГЗТ оценить аллергическую реактивность сенсибилизированных микобактериями морских свинок и провести дифференциацию М. avium subsp. paratuberculosis от родственных видов микобактерий с низкой сенсибилизирующей способностью.

При аллергическом исследование сенсибилизированных М. avium морских свинок симультанной пробой с ППД для млекопитающих и ППД для птиц лучшие результаты исследований в виде большей интенсивности аллергических реакций выявляются у сенсибилизированных М. avium морских свинок.

При исследовании сенсибилизированных М. avium subsp. paratuberculosis морских свинок симультанной пробой с ППД для млекопитающих и Параавиум лучшие результаты выявляются у сенсибилизированных М. avium subsp. paratuberculosis морских свинок.

Способ усиления сенсибилизации морских свинок различными видами микобактерий в адъюванте для оценки сенсибилизирующих свойств различных видом микобактерий и дифференциации М. avium supspecies paratuberculosis включающий подкожное ведение различных видов микобактерий морским свинкам, оценку сенсибилизирующих свойств микобактерий через 30 суток методом симультанной пробы с ППД для млекопитающих, инъецируемые внутрикожно в боковую поверхность справа и аллерген предназначенный для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин - слева определением через 24 часа интенсивности аллергических реакций и сравнением значений интенсивности этих реакций на оба аллергена.

Подкожное введение морским свинкам осуществляют на расстояние 3-5 см в четыре места в области спины - холка и крестец. Изучаемые виды микобактерий вводятся морским свинкам в дозе 5 мг в составе адъюванта, включающего 15 частей ланолина и 85 частей вазелинового масла на одно животное, а в качестве аллергена, предназначенного для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин используют ППД для птиц

Аллергические исследования зараженных (сенсибилизированных) морских свинок проводят через 30 суток, методом внутрикожного введения в область боковой поверхности брюшка с правой и левой стороны (в депилированные от шерсти участки кожи) ППД туберкулина для млекопитающих и ППД туберкулина для птиц. Учет и оценку аллергических реакций определяют по проявлению и интенсивности проявления реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Это проводят через 24 часа после внутрикожного введения аллергенов.

Аллергические исследования сенсибилизированных морских свинок можно проводить в симультанной пробе (в одновременном введении) с разными аллергенами: 1. ППД для млекопитающих и ППД для птиц; 2. ППД для млекопитающих и КАМ; 3. ППД для млекопитающих и Параавиум (аллерген, в котором используют туберкулопротеины штамма микобактерий птичьего вида М. avium №22-82 и туберкулопротеины штамма М. avium supspecies paratuberculosis №19698 АТСС в равных объемах 50:50 в эквивалентной активности с суммарным содержанием белка - 1 мг белка в 2 мл растворителя).

Для оценки сенсибилизирующих свойств различных видов микобактерий используют культуры микобактерий в количестве 5 мг, в составе адъюванта, включающего 15 частей ланолина, 85 частей минерального масла в соотношении 15:85-0,5 мл. Использование адъюванта позволяет пролонгировать сенсибилизацию животных и усилить иммунный ответ на подкожное введение различных видов микобактерий.

В связи с тем, что в дифференциальной диагностике микобактериальных инфекций симультанной аллергической пробой основное значение имеет не количество реагирующих животных на тот или другой аллерген, а интенсивность проявления реакций (минимальный размер аллергической реакции 5 мм.) на введение этих аллергенов, то проявление кожной реакции ГЗТ на микобактериальные аллергены свидетельствует о сенсибилизирующих свойствах изучаемой культуры. Максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ на ППД для птиц или Параавиум в сравнении с ППД для млекопитающих у сенсибилизированных морских свинок свидетельствует о принадлежности изучаемой культуры к М. paratuberculosis.

Дифференциация микобактерий М. avium supspecies paratuberculosis осуществляется применением симультанной пробы с ППД млекопитающих и Параавиум сенсибилизированным морским свинкам и оценкой реакции через 24 часа по диаметру припухлости (большее увеличение диаметра припухлости на Параавиум чем на ППД для млекопитающих указывает на сенсибилизацию морских свинок микобактериями паратуберкулеза).

Оценку сенсибилизирующих свойств микобактерий проводят с помощью симультанной туберкулиновой пробы с ППД для млекопитающих и ПАРААВИУМ. Указанные аллергены вводят внутрикожно с левой и правой стороны в депилированные участки кожи на боках животного. Реакцию учитывают через 24 часа. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи и образованием припухлости диаметром 5 мм или более, иногда с некрозом в центре. Обнаружение реакции на один или оба препарата свидетельствует о сенсибилизирующих свойствах изучаемой культуры микобактерий.

Осуществление изобретения

Пример 1. Исследование сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинок

В лаборатории хронических инфекций на среде Левенштейна-Йенсена были выращены 5 культур микобактерий: М. bovis БЦЖ, М. avium, M. fortuitum, M. scrofulaceum и M. avium subsp. paratuberulosis, в течение 35 суток, при температуре 37°С. По истечении указанного времени с поверхности питательной среды культуры микобактерий в количестве по 5 мг (3-х недельная культура) из расчета на одну морскую свинку внесли в отдельные стерильные пластиковые пробирки В пробирки добавили адъювант (15 частей ланолина и 85 частей минерального масла) из расчета 0,5 см³ адъюванта на 5 мг микобактерий. Каждый полученный вариант культуры микобактерий и адъюванта гомогенизировали и инъецировали подкожно на расстояние 3-5 см в четыре места в области спины (2 в область холки и 2 в области крестца) морским свинкам, массой 300-350 гр.

Через 30 суток после введения микобактерий в составе адъюванта морским свинкам на боковых поверхностях брюшка справа и слева депилировали шерсть размером 90×40 мм и внутрикожно инъецировали справа - ППД для млекопитающих, слева - комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ) в установленных дозах. Результаты исследования через 24 часа после введения аллергенов указаны в таблицах 1-2.

Исследования были осуществлены в двух сериях опытов. В первой серии опытов (результаты представлены в таблице 1) в пяти группах морских свинок, сенсибилизированных микобактериями различных видов с адъювантом. Оценку иммунологической реактивности морских свинок осуществляли, используя ППД для млекопитающих и КАМ. Во второй серии опытов (результаты исследования представлены в таблице 2) в пяти группах морских свинок, сенсибилизированные различными микобактериями с адъювантом, оценку иммунологической реактивности морских свинок осуществляли, используя ППД для млекопитающих, ППД для птиц и комплексный аллерген Параавиум. Для этого через 30 суток после введения микобактерий морским свинкам на боковых поверхностях брюшка справа и слева депилировали шерсть и внутрикожно инъецировали микобактериальные аллергены.

Из данных таблицы видно, что в первой группе морских свинок, которым инъецировали микобактерий М. avium, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у животных выявлена на КАМ, чем на ППД для млекопитающих.

Во второй группе морских свинок, которым инъецировали микобактерий М. bovis БЦЖ, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у животных выявлена на ППД для млекопитающих, чем на КАМ.

В третьей группе морских свинок, которым вводили М. paratuberculosis, большая интенсивность аллергических реакций ГЗТ выявлена у животных на КАМ, чем на ППД для млекопитающих.

В четвертой группе морских свинок, которым вводили М. scrofulaceum, и в пятой группе морских свинок, которым вводили М. fortuitum, большая интенсивность аллергических реакций ГЗТ выявлена также на КАМ, чем на ППД для млекопитающих.

Полученные результаты исследований показывают, что при подкожном методе сенсибилизации морских свинок различными культурами микобактерий в адъюванте усиливается интенсивность проявления аллергических реакций на внутрикожное введение аллергенов.

Ответная реакция ГЗТ строго специфична, так как зараженные М. bovis животные реагируют с большей интенсивностью реакций ГЗТ на ППД для млекопитающих, а сенсибилизированные непатогенными для морских свинок микобактериями реагируют с большей интенсивностью аллергических реакций на комплексный аллерген из атипичных микобактерий.

Из данных таблицы видно, что в первой группе морских свинок, которые были сенсибилизированы М. avium, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у животных выявлена на ППД туберкулин для птиц, что свидетельствует о большей сенсибилизации М. avium и специфичности ППД для птиц.

Во второй группе морских свинок, которым инъецировали М. bovis БЦЖ, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у животных выявлена на ППД туберкулин для млекопитающих, что свидетельствует о большей сенсибилизации М. bovis и специфичности ППД для млекопитающих.

В третьей группе морских свинок, которым инъецировали М. paratuberculosis, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у животных выявлена на комплексный аллерген Параавиум, что свидетельствует о большей сенсибилизации М. avium subsp. paratuberculosis и специфичности Параавиум.

В четвертой и пятой группах морских свинок, которым подкожно вводили атипичные микобактерий М. scrofulaceum и М. fortuitum, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ не выявлена ни на один аллерген, что свидетельствует о гетерологичности используемых аллергенов в отношении исследуемых культур микобактерий.

Так, интенсивность аллергических реакций составила в среднем: на ППД для млекопитающих 11,3 мм, на ППД для птиц 9,4-13,8 мм, на Параавиум 10,6-13,7 мм. Тем не менее, проявление интенсивности реакций у сенсибилизированных атипичными микобактериями животных было выше на ППД для птиц и Параавиум.

Представленные данные таблицы доказывают, что группа морских свинок, сенсибилизированная М. avium subsp. paratuberculosis, реагировала на комплексный аллерген Параавиум реакцией 15-18 мм (в среднем 16,8 мм), на ППД для птиц 8-11 мм (в среднем 9,5 мм), на ППД для млекопитающих 7-9,5 мм (в среднем 8,1 мм), то есть комплексный аллерген Параавиум обладает большей специфичностью, чем ППД туберкулин для птиц и КАМ при исследовании сенсибилизированных М. avium subsp. paratuberculosis морских свинок.

Проявление кожной реакции ГЗТ на микобактериальные аллергены свидетельствует о сенсибилизирующих свойствах изучаемых культур и принадлежности их к роду микобактерий. Большая интенсивность аллергических реакций на ППД для птиц свидетельствует о принадлежности культуры микобактерий к М. avium. Большая интенсивность аллергических реакций на Параавиум свидетельствует о принадлежности культуры микобактерий к М. avium subsp. paratuberculosis.

Изобретение относится к аллергологии и иммунологии, в частности к способу дифференциации М. avium supsp. paratuberculosis от других видов микобактерий. Для этого морским свинкам подкожно вводят микобактерии, оценивают сенсибилизирующие свойства микобактерий через 30 суток методом симультанной пробы с ППД для млекопитающих, посредством внутрикожной его инъекции в боковую поверхность брюшка - справа, и аллергена, предназначенного для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, в боковую поверхность брюшка - слева, определяют через 24 часа интенсивность аллергических реакций и сравнивают значения интенсивности этих реакций на оба аллергена. При этом подкожное введение культур микобактерий осуществляют в четыре точки в области холки и крестца в дозе 5 мг в составе адъюванта, включающего 15 частей ланолина и 85 частей вазелинового масла в объеме 0,5 мл на одно животное. В качестве аллергена, предназначенного для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, используют комплексный аллерген Параавиум, состоящий из туберкулопротеинов штамма микобактерий птичьего вида М. avium 22-82 и туберкулопротеинов штамма М. avium supspecies paratuberculosis 19698 АТСС в равных объемах 50:50 в эквивалентной активности с суммарным содержанием белка - 1 мг белка в 2 мл растворителя. Дифференциация осуществляется по диаметру припухлости – большее увеличение диаметра припухлости на «Параавиум», чем на ППД для млекопитающих указывает на сенсибилизацию морских свинок микобактериями паратуберкулеза. Изобретение обеспечивает дифференциацию М. avium supsp. paratuberculosis от других видов микобактерий. 1 пр., 2 табл.

Способ дифференциации М. avium supsp. paratuberculosis от других видов микобактерий на сенсибилизированных морских свинках, включающий подкожное ведение микобактерий, оценку сенсибилизирующих свойств микобактерий через 30 суток методом симультанной пробы с ППД для млекопитающих, посредством внутрикожной его инъекции в боковую поверхность брюшка - справа, и аллергена, предназначенного для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, в боковую поверхность брюшка - слева, определение через 24 часа интенсивности аллергических реакций и сравнение значений интенсивности этих реакций на оба аллергена, отличающийся тем, что подкожное введение культур микобактерий осуществляют в четыре точки в области холки и крестца в дозе 5 мг в составе адъюванта, включающего 15 частей ланолина и 85 частей вазелинового масла в объеме 0,5 мл на одно животное, а в качестве аллергена, предназначенного для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, используют комплексный аллерген Параавиум, состоящий из туберкулопротеинов штамма микобактерий птичьего вида М. avium 22-82 и туберкулопротеинов штамма М. avium supspecies paratuberculosis 19698 АТСС в равных объемах 50:50 в эквивалентной активности с суммарным содержанием белка - 1 мг белка в 2 мл растворителя, при этом дифференциация осуществляется по диаметру припухлости - большее увеличение диаметра припухлости на «Параавиум», чем на ППД для млекопитающих указывает на сенсибилизацию морских свинок микобактериями паратуберкулеза.