ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS Российский патент 2002 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к медицине и касается создания новых лекарственных средств из бактерий рода Bacillus.

Традиционная терапия бактериальных заболеваний включает широкое использование антибиотических препаратов. Однако указанные препараты часто токсичны, обладают неспецифическим бактерицидным действием, в том числе подавляют эндогенную микрофлору, что приводит к развитию различных осложнений, например дисбактериозов. Поэтому в последнее время предложены новые антибактериальные препараты, обладающие выраженной активностью против патогенных и условно-патогенных бактерий и не нарушающие микробиоценозов человека. Хорошим лечебным эффектом обладают препараты на основе бактерий рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных, гнойно-воспалительных, урогенитальных заболеваний, обладающие сравнимой с антибиотиками эффективностью и не дающие осложнений в виде аллергий и дисбактериозов (1-3).

В состав препаратов-пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus входят штаммы, обладающие разным спектром антибактериальной и антигрибной активности. Эффективность препаратов определяется широтой спектра и силой антибактериальной активности входящего в препарат штамма.

Ближайшим аналогом изобретения является лечебно-профилактический биопрепарат Бактиспорин на основе антагонистически активного штама В.subtilis 3H для лечения широкого круга заболеваний, выпускаемый в ампулах и используемый перорально в виде раствора (4).

Недостатком препарата бактиспорин является отсутствие биологической эффективности в отношении штаммов родов Pseudomonas, Streptococcus, Paratyhv, которые часто являются причиной развития острых кишечных инфекций, дисбиозов или отягощают их течение.

Задача, решаемая изобретением, - создание нового препарата-пробиотика с широким спектром антагонистической активности, в том числе в отношении штаммов родов Pseudomonas, Streptococcus, Paratyhv, применение которого возможно с антибиотиками в целях предотвращения развития дисбактериоза.

Это достигается тем, что в качестве основы биопрепарата используют штамм Bacillus subtilis 11В. Штамм депонирован под номером ВКМ В-2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999.

Культура штамма характеризуется следующими свойствами: В.subtilis ВКМ В-2218 Д - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На мясопептонном агаре (МПА), сусло-агаре дают обильный рост. На МПА - образует серовато-белые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки и осадка. Через 18 часов роста в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки, размером 2-3•0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. Клетки подвижны. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры овальные, размер 0,9•0,6 мкм, расположены в клетке эксцентрично.

Культура ферментирует глюкозу, β-галактозу, лактозу, сахарозу и мальтозу. Не разлагает маннит, инозит, сорбит и арабинозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат натрия с глюкозой, пропионат и малонат натрия не использует, слабо растет в анаэробных условиях. Характеризуется наличием аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, отсутствием фенилаланилдезамилазы, орнитиндекарбоксилазы. Образует ацетилметилкарбинол. Редуцирует нитраты, не образует газ на среде с нитратами в анаэробных условиях. Не образует индол и сероводород.

Штамм Bacillus subtilis 11B характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к ряду антибиотиков.

Препарат содержит в качестве основы живые клетки Bacillus subtilis 11В и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Биомасса Bacillus subtilis 11В - 1•10⁹-5•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл растворителя - 92-95
Наполнитель - 5-8
В качестве растворителя можно использовать физиологический раствор, дистиллированную или кипяченую воду. В качестве наполнителя препарат может содержать 5% лактозы или 8% сахарозо-желатиновой смеси (7% сахарозы и 1% желатина). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата.

Пример. На основе штамма B.subtilis 11B с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток в составе препарата.

Вариант 1. Препарат, содержащий, мас.%:
Биомасса B. subtilis 11B - 1•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 8
Вариант 2.

Препарат, содержащий, мас.%:
Биомасса B. subtilis 11B - 1•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 93
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 7
Вариант 3. Препарат, содержащий, мас.%:
Биомасса B. subtilis 11В - 5•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 94
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 6
Вариант 4. Препарат, содержащий, мас.%:
Биомасса B.subtilis 11В - 10•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 95
Наполнитель - сахарозо-желатиновая смесь - 5
Вариант 5. Препарат, содержащий, мас.%:
Биомасса B.subtilis 11B - 5•10¹⁰ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 95
Наполнитель - лактоза - 5
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные флаконы, высушивали лиофильно, укупоривали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками. Проверяли безвредность полученных вариантов препарата на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.

Препарат характеризуется безвредностью (табл.1).

Для определения безвредности содержимое флакона разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Испытание показало, что все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.

Препарат характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов (табл. 2).

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе 2. Посевы инкубировали в термостате при 37^oС в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37^oС по величине зон отсутствия роста тест-культур.

Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе 2 без исследуемой культуры.

Из данных табл. 1 следует, что оптимальным количеством живых микробных клеток в одной дозе препарата является 1-5•10⁹. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Препарат обладает устойчивостью к целому ряду антибиотиков (табл. 3).

Чувствительность препарата к антибиотикам определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА наливали 1 мл клеточной суспензии препарата в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку. Чашки выдерживали в термостате при температуре (37±1)^oС в течение (18±2) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.

Из полученных данных следует, что препарат устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), а также к стрептомицину, полимиксину, гентамицину и рифампицину.

Эффективность заявляемого препарата в оптимальных концентрациях микробных клеток (1-5)•10⁹ для нормализации микробиоценоза кишечника оценена при лечении 15 больных с острыми кишечными инфекциями (ОКИ) и хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта (затяжное течение ОКИ, сальмонеллез, хронический колит, энтероколит, ферментопатия, дисбактериоз кишечника на фоне хронического гастрита, холецистопанкреатита, хронического гепатита) с бактериально подтвержденным дефицитом бифидофлоры. Препарат назначали по 1 дозе два раза в день в течение 10 суток. Результаты исследования микрофлоры кишечника у больных до начала и через 7-10 дней после окончания лечения представлены в табл. 4.

Из табл. 4 следует, что дисбактериоз был обусловлен как снижением нормофлоры (бифидобактерий, лактобацилл), так и увеличением условно-патогенной микрофлоры (УПМ). Терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении УПМ - 97,3% и восстановлении нормофлоры - 90%. Показаны его абсолютная безвредность и хорошая переносимость.

Источники информации
1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека // А.с. 1722502. - SU. - А 61 К 39/02, публ. 30.03.92.

2. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин // Патент 2035185, RU. - А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. 14.

3. Белявская В. А., Сорокулова И.Б., Масычева В.А. Рекомбинантные пробиотики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всеросссийской научно-практической конф. - М. - 1996. - С. 7.

4. Михайлова Н. А. , Кузнецова Т.П., Кунягина О.В. Лечебно-профилактический препарат Бактиспорин// Патент 2130316, А 61 К 35/66, приор. 23.01.97.

Изобретение относится к медицине. Биопрепарат содержит штамм Bacillus subtilis 11В ВКМ В-2218Д в ИБФМ РАН, растворитель и наполнитель. Биопрепарат обладает более высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к целому ряду антибиотиков. 4 табл.

Лечебно-профилактический биопрепарат, включающий живую микробную массу Bacillus subtilis, растворитель и наполнитель, отличающийся тем, что он содержит биомассу B. subtilis 11В (ВКМ В-2218Д в ИБФМ РАН) при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Биомасса Bacillus subtilis 11В живых микробных клеток - (1-5)•10⁹ в 1 мл растворителя - 92 - 95
Наполнитель - 5 - 8