СПОРОВЫЙ ПРОБИОТИК КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Описание патента на изобретение RU2388813C1

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению нового пробиотика из бактерий рода Bacillus, предназначенного для ингибирования развития патогенных бактерий и вирусов.

Традиционная терапия бактериальных заболеваний включает широкое использование антибиотических препаратов. Они часто являются токсическими и обладают неспецифическим бактерицидным действием, в том числе подавляют эндогенную микрофлору, что приводит к развитию различных осложнений, например дисбактериозам.

В настоящее время предложены новые антибактериальные препараты, обладающие выраженной активностью против патогенных и условно-патогенных бактерий и не нарушающие микробиоценозов.

К таким препаратам, обладающим хорошим лечебным эффектом, относятся препараты на основе бактерий рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных, гнойно-воспалительных, урогенитальных заболеваний и не дающих осложнений в виде аллергий и дисбактериозов.

Известен профилактический биопрепарат субалин, который содержит биомассу Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 при следующем соотношении компонентов, об.%:

Биомасса Bacillus subtilis ВКПМВ-4759 (1×109-1×1010 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора) 92-98 Наполнитель 2-8 (1).

Известен также лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus subtilis 11 В (ВКМ В-2218Д и ИБФМ РАН) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биомасса Bacillus subtilis 11 В (1-5×109 живых микробных клеток в 1 мл растворителя) 92-98 Наполнитель 5-8 (2).

Терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении условно-патогенной микрофлоры и восстановлении нормофлоры. Доказаны его абсолютная безвредность и хорошая переносимость (2).

В задачу исследований входило - создание пробиотика комплексного действия, который характеризовался более выраженной антагонистической и бактерицидной активностью в отношении болезнетворных микроорганизмов за счет амилолитической активности.

Поставленную задачу удалось достичь благодаря тому, что в состав предложенного пробиотика ввели культуру B.subtilis 3А (№282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича), характеризующуюся высокими антагонистической и амилолитической активностями.

Технический результат изобретения заключается в расширении спектра антагонистической активности по отношению к болезнетворным микроорганизмам и устойчивости к ряду антибиотиков, повышении бактерицидной активности в отношении различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Предлагаемый штамм B.subtilis 3А (№282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича) характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки: грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2-3×0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в центре клетки. При спорообразовании клетки не раздуваются.

Культурально-морфологические свойства. Штамм B.subtilis 3А (№282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича) хорошо растет на простых питательных средах. На МПА после инкубации в течение 24 часов при температуре (37±1)°С штамм образует колонии от беловато-бежевого до желтого цвета с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, сухие или вязкой консистенции, может образовать до 50% гладких блестящих круглых колоний или колоний неправильной формы.

На мясопептонном бульоне (МПБ) растет в виде беловатой пленки и придонного осадка, вызывая помутнения среды. Оптимальная температура роста микроба (37±1)°С.

Ферментативные свойства. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, манит. Не разлагает лактозу. Не образует индол, сероводород. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Продуцирует каталазу, протеазу, желатиназу, амилазу. Не образует лецитиназу, липазу, уреазу. Изучаемая культура характеризуется отсутствием гемолитической активности (табл.1).

Таблица 1 Физиолого-биохимические свойства штамма B.subtilis 3А Свойства B.subtilis 3А 1 2 Рост в анаэробных условиях - Ферментация Глюкозы + арабинозы + ксилозы + маннита + Утилизация цитрата + пропионата - Гидролиз крахмала + мочевины - Редукция нитратов + Образование газа из NO3- в анаэробных условиях Обесцвечивание метиленовой сини + Аргининдигидролаза - Лецитиназа - Гиалуронидаза - Гемолитическая активность - Образование глобул поли-β-оксимасляной кислоты на глюкозном агаре Лизоцимная активность +

Как свидетельствуют данные, секционированный штамм Bacillus subtilis 3А характеризуется типичными для этого вида физиолого-биохимическими признаками, которые могут обусловить широкий диапазон положительного действия при применении.

Антибиотикочувствительность. Исследования антибиотикоустойчивости штамма В.subtilis 3А в отношении антибиотиков и антибиотических веществ, широко применяемых в практике здравоохранения, показали, что штамм обладает устойчивостью к ампициллину, бензилпенициллину, азтреонаму, цефтазидиму, цефтизоксиму и полимиксину Е (табл.2).

Таблица 2 Антибиотикочувствительность штамма B.subtilis 3А Изучаемый препарат Диаметр зон задержки роста культур, мм B.subtilis 3А Амоксициллин 18±0,1 Ампициллин 10±0,3 Мезлоциллин 20±0,3 Метициллин 18±0,1 Оксациллин 14±0,3 Бензилпенициллин 8±0,1 Азтреонам 0 Имипенем 36±0,4 Моксалактам 12±0,3 Цефалотин 32±0,5 Цефамандол 37±0,1 Цефоперазон 16±0,1 Цефотаксим 14±0,2 Цефтазидим 8±0,2 Цефтизоксим 0 Цефтриаксон 18±0,3 Амикацин 20±0,2 Гентамицин 24±0,2 Канамицин 23±0,1 Тобрамицин 24±0,3 Ванкомицин 12±0,1 Клиндамицин 10±0,3 Тетрациклин 24±0,3 Хлорамфеникол 16±0,2 Полимиксин Е 10±0,1 Нитрофурантоин 16±0,2 Триметоприм 24±0,1 Норфлоксацин 24±0,2

Антагонистическая активность. Штамм Bacillus subtilis 3A наибольшую антагонистическую активность проявляет к тест-штаммам S.aureus (от 19,9 до 24,9 мм) и Candida albicans (до 36,5 мм), несколько ниже к - S.sonnei, S.flexneri (табл.3). Следует отметить, что штамм не проявляет антагонистическую активность в отношении представителей нормальной микрофлоры - бифидо-, лактобактерий и кишечной палочки.

Таблица 3 Специфическая активность В.subtilis 3А Тест-культуры Зона задержки роста тест-культур, мм 1 2 Campylobacter coli 382 15±3.2 С.coli 412 17±2.6 С.coli 413 18±1.3 С.coli 602 17±1.2 C.jejuni 11 gb 25±3.4 C.jejuni 381 16±1.1 C.jejuni 385 19±1.5 С.jejuni 417 19±2.7 С.jejuni 418 20±2.4 С.jejuni 433 19±1.3 С.jejuni 457 21±1.5 Escherichia coli 11 15±1.3 E.coli 12 14±1.2 E.coli 28 15±2.1 E.coli 29 14±2.6 E.coli 77 14±2.5 E.coli 144 14±2.8 E.coli 157 17±3.4 E.coli 223-224 11±1.1 E.coli 281-282 15±2.0 E.coli 683 24±2.5 E.coli 795 17±1.7 E.coli K-63 10±1.3 E.coli 0111 13+1.1 E.coli M-17 2±0.5 Enterobacter sp.30 30±2.4 Enterobacter sp.233 14±2.6 Klebsiella pneumoniae 1245 10±2.3 Klebsiella sp.5 10±2.1 Klebsiella sp.15 10±2.8 Klebsiella sp.24 10±1.5 Klebsiella sp.25 10±1.3 Proteus mirabilis 24 a 25+3.1 P.mirabilis 177 12±1.3 P.mirabilis 505 18±2.4 P.vulgaris 72 19±1.7 P.vulgaris 162 16±1.5 P.vulgaris 177 25±3.2 P.vulgaris 181 15±1.4 P.vulgaris 226 19±1.8 P.vulgaris 364 15±1.5 P.vulgaris 365 15±2.3 P.vulgaris 491 25±3.8 Salmonella abortus-equi 202 12±1.4 S.derby 1519 16±2.6 S.greiz 1190 19±5.3 S.newport 5751 11±1.7 S.paratyphi 2606 12±1.4 S.reading 5270 14±2.9 S.stanley 5266 15±1.2 S.typhi 4446 20+2.5 S.typhimurium 11 13±1.6 S.typhimurium A56 12±1.8 S.typhimurium 178 10±2.3 S.typhimurium 184 14±4.7 S.typhimurium 193 11±1.3 S.weslaco 247/49 13±1.2 Shigella flexneri 170 24±1.7 S.flexneri 337 23±2.6 S.sonnei 32 11±1.8 S.sonnei 36 14±1.5 S.sonnei 151 14±2.7 S.sonnei 185 25±5.4 S.sonnei 186 19±1.5 S.sonnei 191 21±1.3 S.sonnei 197 15±3.1 S.sonnei 211 23±1.0 S.sonnei 321 28±3.4 S.sonnei 513 19±1.7 S.sonnei 853 23±2.4 S.sonnei 5063 25±5.9 S.sonnei 5069 20±1.8 Candida albicans 690 30±3.6 Lactobacillus fermentum 90T-S4 0 L. plantarum 8P-A3 0 Staphylococcus aureus 2 19±1.4 S.aureus 11 19±1.6 S.aureus 12 21±1.1 S.aureus 13 19±1.5 S.aureus 15 20±1.9 S.aureus 19 38±2.3 S.aureus 22 38+2.1 S.aureus 29 23±1.8 S.aureus 33 39±1.6 S.aureus 54 16±1.9 S.aureus 58 21±1.7 S.aureus 108 15+1.9 S.aureus 301 22±1.5 S.aureus 6365 21±1.3 S.aureus 6367 21±1.2 S.aureus 14B 22±1.8 S.aureus 17В 24+2.7 S.aureus 18B 19±1.6 S.aureus 22B 19±1.9 S.aureus 31В 19±1.6 S.aureus 209 32±3.5 S.aureus 1479 30±2.2 S.aureus 1623 20±2.5 S.aureus "Лоссман" 18±2.1 S.aureus "Никифоров" 19±2.7 S.aureus "Филиппов" 18±3.1 S.epidermidis 1-3 16±1.4 S.epidermidis 685 23±2.3 Streptococcus faecium 375-3 12±1.2 Yersinia enterocolitica 296 18±1.1 Y.pseudotuberculosis 67 20±2

Как видно из данных, представленных в таблице 3, штамм В.subtilis 3А характеризуется широким спектром высокой антагонистической активности в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов и, в то же время, не влияет на бактерии - представителей нормальной микрофлоры.

Продукцию биологически активных веществ (БАВ) штаммом В.subtilis 3А изучали методом диффузии в агар. О продукции БАВ судили по зонам задержки роста тест-культур.

Таблица 4 Спектр биологической активности штамма В.subtilis 3А Тест-культура Зона задержки роста тест-культур, мм S.aureus 209 13±1.8 S.aureus 3Ч 14±2.0 E.fecalis 115Ч 17±1.9 E.coli 22Ч 9±1.1 Enterobacter ssp.3Ч 10±1.4 Candida albicans 5Ч 16±2.0 Helicobacter pylori 2 14±1.3 H.pylori 1 11±0.7 H.pylori 5 15±1.4 H.pylori 38 12±1.2 H.pylori 11 13±0.9 H.pylori 54 16±1.7

Тест-культуры в концентрации 108 КОЕ/мл засевали на поверхность агаризованной среды (100 мкл суспензии/чашку). Сверлом (диаметр 6 мм) в агаре делали лунки, в которые вносили по 100 мкл лизата культуры В.subtilis 3A. Чашки культивировали при 37°С в течение 24-48 часов. Активность препарата определяли по зонам угнетения роста штаммов.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что пробиотический штамм В.subtilis 3А продуцирует биологически активные вещества широкого спектра специфического действия.

Безопасность пробиотического штамма

Изучали острую и хроническую токсичность штамма В.subtilis 3А. Опыты проводили на белых мышах массой 10-12 г. При изучении острой токсичности животным вводили культуру В.subtilis 3А внутривенно, внутрибрюшинно и перорально в различных концентрациях. При изучении хронической токсичности животным вводили культуру перорально по 106 микробных клеток ежедневно в течение 10 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор. В таблице 5 представлены данные о действии максимальных доз, вводимых мышам при изучении острой токсичности. Результаты изучения хронической токсичности культуры представлены в таблице 6.

Таблица 5 Изучение острой токсичности пробиотического штамма Изучаемые культуры Способ введения Доза (количество микробных клеток), млрд Количество животных всего заболело пало выжило В.subtilis 3А в/вено
в/брюшинно
перорально
5
10
100
10
10
10
0
0
0
0
0
0
10
10
10

Таблица 6
Изучение хронической токсичности штамма
Изучаемые культуры Способ и курс введения Доза (количество микробных клеток) Количество животных всего заболело пало выжило В.subtilis NS перорально, 10 дней 106 10 0 0 10

Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней.

Через 1 и 7 суток по 5 животных из каждой группы умерщвляли глубоким эфирным наркозом и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, а также отбирали различные органы для гистологического изучения: печень, почки, легкие, селезенку, кишечник, мезентериальные лимфатические узлы, головной мозг, тимус, мягкие ткани в области глотки (последние только при оральном введении). Материал фиксировали в растворе формалина, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Проводили в таком же объеме гистологические исследования органов контрольных животных.

В течение всего периода наблюдения животные были здоровы, хорошо поедали пищевые рационы, поведенческие реакции не нарушены, шерстный покров не изменен. Макроскопическое и гистологическое изучение внутренних органов животных не выявило никаких патологических изменений даже в группах животных, получавших максимальное количество бактериальных клеток.

Таким образом, штамм В.subtilis 3А характеризуется высокой степенью безопасности для животных.

Пример 1

Штамм В.subtilis 3А на среде Громыко (МПА+сусло-агар 1:1) при 37°С в течение 48 часов. Бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и прогревали при 121°С в течение 15 мин. Полученный лизат разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности). В другом варианте бактерии смывали с поверхности агара 7%-ным раствором NaCl и разводили физиологическим раствором до получения вариантов с различной концентрацией клеток (по оптическому стандарту мутности).

Вариант 1

Лизат биомассы штамма В.subtilis 3А - 1×109 КОЕ/мл

Вариант 2

Лизат биомассы штамма В.subtilis 3A - 1×1010 КОЕ/мл

Вариант 3

Лизат биомассы штамма В.subtilis 3A - 1×1011 КОЕ/мл

Вариант 4

Биомасса штамма В.subtilis 3A - 1×109 КОЕ/мл

Вариант 5

Биомасса штамма В.subtilis 3A - 1×1010 КОЕ/мл

Вариант 6

Биомасса штамма В. subtilis 3A - 1×10 КОЕ/мл

Изучали антагонистическую активность полученных вариантов препарата в отношении тест-культур (Таблица 7).

Таблица 7 Антагонистическая активность различных вариантов пробиотика Варианты препарата Зона подавления роста тест-культур, мм Staphylococcus aures Salmonella typhimurium Shigella zonnei Candida albicans 1 25 11 9 20 2 28 12 10 22 3 26 10 10 19 4 26 12 10 23 5 29 13 12 25 6 27 11 12 24

Как видно из данных, приведенных в таблице 7, оптимальным количеством микробных клеток в 1 мл препарата является - В.subtilis 3A - 1×109-1×1010 КОЕ/мл, как живых клеток, так и их лизатов. Дальнейшее увеличение количества бактериальных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Предложенный штамм В.subtilis 3A депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером В.subtilis №282 (04.04.2007).

I. Получение живого препарата

Пример 2. Получение жидкого препарата

При стационарной технологии культивирование штамма ведется на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38°С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончании инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, осуществляют стабилизатором, разливают во флаконы.

При промышленной технологии культивирование штамма ведется в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38°С в течение от 10-18 ч. Процесс считается законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончании инкубации в выращенную культуру добавляют стабилизатор, разливают во флаконы.

Пример 3. Получение препарата в форме лиофилизата

При стационарной технологии культивирование штамма ведется на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38°С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончании инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, осуществляют защитной средой, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

При промышленной технологии культивирование штамма ведется в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38°С в течение от 10-18 ч. Процесс считается законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончании инкубации в выращенную культуру добавляют стабилизатор, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

В качестве защитной среды может содержать, например, сахарозо-желатиновую среду, молоко, желатозу, сахарозу, лактозу.

Пример 4. Получение препарата в таблетированной форме

Выращенную культуру штамма В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами и прессуют на ротационных прессах. При формировании таблеток может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, лактозу, сахарозу, стеарат кальция, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п.

На стабильность изучено 10 экспериментальных серий таблетированного препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В.subtilis 3A в таблетках составляет не менее 109-7 КОЕ/дозе (соответственно). После хранения таблеток на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 109-7 КОЕ/дозе.

Пример 5. Получение препарата в форме суппозиториев

Выращенные культуры штаммов В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями и отливают на свечных машинах. При получении суппозитории или свечи в качестве наполнителя содержат, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.

На стабильность изучено 10 экспериментально-производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В.subtilis 3A в суппозиториях составляет не менее 109-7 КОЕ/ суппозиторий (соответственно). После хранения суппозиториев на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 109-7 КОЕ/суппозиторий.

Пробиотик может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметилцеллюлозе, гидроксиэтилцеллюлозе, хитоне и т.п.

Проверяли все полученные варианты и формы препарата на безвредность на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.

Препарат характеризуется безвредностью.

Для определения безвредности содержимое флакона разводили в 0,5 мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не меньше 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение 5 суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Препарат характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона растворяли в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе №2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 ч, а затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500 - миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур.

Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе №2 без исследуемой культуры.

Из полученных данных следует, что оптимальным количеством живых клеток в одной дозе препарата является 1-5×109. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

II. Получение инактивированного препарата

Для получения лизатов клеток суспензию (полученную стационарной (А) или промышленной (Б) технологии) автоклавируют при температуре (110±1)°С 1 атм 10-30 мин.

Пример 6. Полученную суспензию лизатов контролируют на подлинность и микробиологическую чистоту. Затем суспензию разливают дозатором в стерильные флаконы по 2, 5, 10 мл, герметично закрывают стерильной пластмассовой пробкой с резьбой и фасуют в потребительскую упаковку.

Таблица 8 Варианты нормоспорина с разной оптической плотностью Способ получения Вариант Количество оптических единиц в мл А. на плотной среде МПА 1.А 1×109 ОE/мл 2.А 1×108 ОЕ/мл 3.А 1×107 ОE/мл Б. в жидкой среде МПБ 1.Б 1×109 ОE/мл 2.Б 1×108 ОЕ/мл 3.Б 1×107 ОЕ/мл

Пример 7. Получение препарата в форме лиофилизата

В полученные лизаты клеток добавляют защитную среду, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

В качестве защитной среды может содержать, например, сахарозо-желатиновую среду, молоко, желатозу, сахарозу, лактозу.

Пример 8. Получение препарата в таблетированной форме

Полученные лизаты клеток штамма В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами и прессуют на ротационных прессах. При формировании таблетка может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, лактозу, сахарозу, стеарат кальция, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п. На стабильность изучено 10 экспериментальных серий таблетированного препарата.

Пример 9. Получение препарата в форме суппозиториев

Полученные лизаты клеток штамма В.subtilis 3A после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями и отливают на свечных машинах. При получении суппозитории или свечи в качестве наполнителя содержат, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.

На стабильность изучено 10 экспериментально-производственных серий препарата.

Пробиотик может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметилцеллюлозе, гидроксиэтилцеллюлозе, хитоне и т.п.

Пример 10. Бактерицидную активность в отношении тест-штаммов на плотных средах определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных изучаемым препаратом, измеряя зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.

Исследование показало, что наибольшие показатели бактерицидной активности были у вариантов 1А и 1Б, средние - 2А и 2Б, низкие - 3A и 3Б. При изучении бактерицидной эффективности нормоспорина вариантов 1А, 1Б, 2А и 2Б выявлено, что самые высокие показатели активности препарат проявляет в отношении грибов рода Кандида, стафилококков, энтерококков (табл.9).

Воздействие разных вариантов нормоспорина на условно-патогенные бактерии определяли методом серийных разведений в жидкой среде Гаузе №2. Выявлено, что варианты 3A и ЗБ также были менее эффективны в отношении изучаемых тест-штаммов. Показано, что нормоспорин варианты 1А, 2А, 1Б, 2Б проявляет высокий бактерицидный эффект в отношении грибов рода Кандида, энтерококка и стафилококка (табл.10).

На основании экспериментов по изучению бактерицидной активности в последующих исследованиях был использован нормоспорин в вариантах 1А и 1Б.

Изучали бактерицидную активность Нормоспорина 1А к клиническим изолятам Н.pylori. Исследования проводили методом диффузии в агар на среде Мюллер-Хинтон. Нормоспорин характеризовался высокой бактерицидной активностью в отношении исследованных тест-штаммов Н.pylori (табл.11).

Таблица 11 Бактерицидная активность Нормоспорина 1А в отношении штаммов Helicobacter pylori Тест-штаммы Н.pylori Зоны задержки роста тест-культур, мм 1382 11±1.2 1079 13±1.1 АМ А900211 10±0.7 Azm1 P079 16±1.5 9008 704F 12±1.3 Az 1099 12±1.1 DG 1021 11±0.8 SS1 14±1.3 AA9002 11 11±1.0 1470 10±0.6 1289 15±1.3 815C3 16±1.4 704RG 9001 12±0.7 704AD 9001 211 14±1.3 1060 11±0.7 SM1028 Az 15±1.4 A 12211 12±1.2 Azm A9002 11 13±0.9 NC 012 455 16±1.7 AT 9008 704F 9 10±0.4 J99 12±1.0

Предложенный штамм Bacillus subtilis 3A депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером В.subtilis №282 (04.04.2007).

Предложенный штамм Bacillus subtilis 3A характеризуется высокой амилолитической активностью и обладает по сравнению с исходным штаммом более широким спектром антагонистической активности по отношению к болезнетворным микроорганизмам и устойчивостью к ампициллину, бензилпенициллину, азтреонаму, цефтазидиму, цефтизоксиму и полимиксину Е.

Лизаты штамма Bacillus subtilis 3A обладают бактерицидной активностью в отношении различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, энтерококков, грибов рода Кандида, хеликобактерий).

Предложенный пробиотик апробирован с положительным результатом в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии в апреле 2007 г.

Пробиотик найдет применение при лечении больных детей и взрослых при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и дисбиозов различной этиологии в лечебно-диагностических учреждениях амбулаторной и стационарной сети.

Убедительно просим экспертизу назвать предложенный пробиотик «НОРМОСПОРИН», согласно утвержденной документации.

Источники информации

1. Патент РФ №2035185, A61K 35/66, 1992 г.

2. Патент РФ №2181596, A61K 35/74, 2002 г.

Похожие патенты RU2388813C1

название год авторы номер документа
ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ПРОТИВ ВИРУСНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ "ТОКСИСПОРИН", СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА 2011
  • Волков Михаил Юрьевич
  • Буяновская Наталья Яковлевна
RU2471864C1
БИОПРЕПАРАТ БАЛИС ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 2010
  • Далин Михаил Викторович
  • Лазовская Алла Леоновна
  • Воробьева Зоя Глебовна
  • Кравцов Эдуард Георгиевич
  • Васильева Елена Александровна
  • Анохина Ирина Викторовна
  • Яшина Наталия Вячеславовна
  • Мефёд Кирилл Михайлович
  • Кульчицкая Марина Александровна
  • Слинина Клавдия Николаевна
RU2454238C1
БИОПРЕПАРАТ "ИРИЛИС" ВЕТЕРИНАРНОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2003
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Осипова И.Г.
  • Васильева Е.А.
  • Евлашкина В.Ф.
  • Харитонова Е.Ю.
  • Трофимов С.Г.
  • Остроумов Ю.И.
  • Доронин А.Н.
RU2264453C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis 1719-ПРОДУЦЕНТ АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ В ОТНОШЕНИИ БОЛЕЗНЕТВОРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, А ТАКЖЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ, АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 2005
  • Михайлова Наталья Александровна
  • Гатауллин Айрат Гафуанович
RU2298032C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS "ПАШКОВ" - ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ, ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ И ВИРУСОВ 2009
  • Гринько Ольга Михайловна
  • Михайлова Наталья Александровна
  • Пашков Евгений Петрович
  • Буданова Елена Вячеславовна
RU2405821C1
БИОПРЕПАРАТ "ИРИЛИС" НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ДИСБИОЗА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ И ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА 2003
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Осипова И.Г.
  • Васильева Е.А.
  • Калинин С.П.
  • Терешкина Н.В.
  • Харитонова Е.Ю.
  • Саркисов С.Э.
RU2264454C2
ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS 2001
  • Байгузина Ф.А.
  • Алсынбаев М.М.
  • Штроман Г.А.
  • Кулагин В.Ф.
  • Осипова И.Г.
  • Байгузина С.Н.
RU2181596C1
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬЮ 2010
  • Денисов Евгений Николаевич
  • Кузнецова Татьяна Николаевна
RU2444366C1
ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ДИСБИОЗОВ И БИОПРЕПАРАТ БИСПОРИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ДИСБИОЗОВ 2002
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Смирнов Валерий Вениаминович
  • Осипова И.Г.
  • Прудников А.О.
RU2219238C1
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ 1999
  • Байгузина Ф.А.
  • Кузнецова Т.Н.
  • Баданова С.Ч.
RU2172175C1

Реферат патента 2010 года СПОРОВЫЙ ПРОБИОТИК КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению нового лекарственного средства, предназначенного для ингибирования патогенных и условно-патогенных бактерий и вирусов. Споровый препарат включает, в мас.%: биомассу штамма Bacillus subtilis №282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)×108-1010 КОЕ в 1 мл растворителя или лизаты биомассы штамма Bacillus subtilis №282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)×108-1010 КОЕ в растворителе - 92-95 и наполнитель - 5-8. В задачу исследований входило - получить пробиотик с более выраженной амилолитической и антагонистической активностями в отношении болезнетворных микроорганизмов. Это обеспечивает расширение спектра антагонистической активности по отношению к болезнетворным микроорганизмам и устойчивость к ряду антибиотиков, повышение бактерицидной активности в отношении различных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. 11 табл.

Формула изобретения RU 2 388 813 C1

Споровый препарат - пробиотик комплексного действия, включающий, мас.%:
биомасса Bacillus subtilis №282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)·108-1010 КОЕ в 1 мл растворителя или лизат биомассы штамма Bacillus subtilis №282 ГИСК им. Л.А.Тарасевича (1-5)·108-1010 КОЕ в 1 мл растворителя 92-95 наполнитель 5-8

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2388813C1

ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS 2001
  • Байгузина Ф.А.
  • Алсынбаев М.М.
  • Штроман Г.А.
  • Кулагин В.Ф.
  • Осипова И.Г.
  • Байгузина С.Н.
RU2181596C1
ШТАММЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТОВ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВИРУСНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ 1997
  • Щелкунов С.Н.
  • Петренко В.А.
  • Рязанкина О.И.
  • Репин В.Е.
  • Андреева И.С.
  • Ильичев А.А.
  • Белявская В.А.
  • Сандахчиев Л.С.
  • Серпинский О.И.
  • Сиволобова Г.Ф.
  • Синяков А.Н.
  • Перминова Н.Г.
  • Тимофеев И.В.
  • Леляк А.И.
  • Ноздрин Г.А.
  • Катковский Л.П.
  • Данилюк Н.К.
  • Масычева В.И.
RU2142287C1
ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ СУБАЛИН 1992
  • Смирнов В.В.
  • Резник С.Р.
  • Сорокулова И.Б.
  • Сандахчиев Л.С.
  • Петренко В.А.
  • Ильичев А.А.
  • Белявская В.Н.
  • Тимофеев И.В.
RU2035185C1
Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека 1989
  • Смирнов Валерий Вениаминович
  • Резник Семен Рафаилович
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Вьюницкая Валентина Алексеевна
  • Слабоспицкая Алла Тимофеевна
  • Берилло Эльвира Андреевна
  • Скорикова Ирина Григорьевна
  • Чаплинский Владимир Яковлевич
  • Тофан Анатолий Васильевич
SU1722502A1

RU 2 388 813 C1

Авторы

Осипова Ирина Григорьевна

Сорокулова Ирина Борисовна

Хорошева Татьяна Васильевна

Даты

2010-05-10Публикация

2008-11-05Подача