СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЛИОБЛАСТОМЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано для дооперационной диагностики глиобластомы у больных с внутримозговыми опухолями.

Известен способ дооперационной неинвазивной диагностики опухолей головного мозга методом КТ/МРТ исследований (Р.И. Габуния. Компьютерная томография в клинической диагностике: руководство для врачей. «Медицина», 1995; М. Hofer, CT Teaching Manual: a Systematic Approach to CT Reading, «Thieme», 2005; M.A.Brown, R.C.Semelka. MRI, 1995 г.; R.H.Hashemi, W.G.Bradley. C.J.Lisanti, MRI: The Basics, 2004). Наибольшей информативностью из широко распространенных методик является МРТ головного мозга. Пациенту, которому установлен диагноз интракраниального объемного образования, в ходе проведения компьютерной томографии всегда требуется уточнение диагноза с помощью магнитной резонансной томографии. Указанные методики нейровизуализации позволяют получать достаточно информации о локализации, структуре, протяженности, границах, характере роста и васкуляризации опухоли. При помощи МРТ можно дифференцировать внутри - и внемозговые опухоли, хотя в редких случаях такая дифференциальная диагностика бывает затруднительной. Что же касается дифференцировки внутримозговых опухолей (т.е. распределение первичных внутримозговых опухолей по степени злокачественности), то при помощи МРТ можно лишь высказывать предположения о гистопринадлежности опухоли по наличию тех или иных признаков.

Наиболее близким к заявленному является способ стереотаксической биопсии (СТБ), проводимой в условиях навигационного контроля, который может с высокой долей вероятности дифференцировать глиобластому от прочих внутримозговых опухолей (Р.Chandrasoma, M.L.J.Apuzzo. Stereotactic Brain Biopsy. 1989 г.; E.S.Connolly. Fundamentals of Operative Techniques in Neurosurgery. 2002 г.). Данная методика является инвазивной. Для проведения СТБ в условиях навигационного контроля на дооперационном этапе больным проводят томографическое исследование КТ/МРТ непосредственно накануне предстоящего вмешательства. Полученная информация переносится на навигационную станцию, и уже после этого проводится непосредственно процедура биопсии. Описанные при СТБ осложнения (кровотечение, развитие инфекционных процессов, нарастание имевшихся у больных неврологических расстройств) отмечены в 3% случаев. Техника навигационной СТБ относится к "минимально-инвазивной хирургии" и позволяет свести риск операции к минимуму. Однако в ходе биопсии возможен забор небольшого по объему участка ткани (~0,4-0,5 мм³), что вызывает сложности для проведения последующего гистологического исследования, и требуется дополнительное иммуногистохимическое исследование. Глиобластомы имеют разнородную структуру, что затрудняет выявление малигнизированных участков с помощью СТБ.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики глиобластомы головного мозга на основе исследования цитотоксической активности интерферон (ТОР)-альфа индуцированных дендритных клеток для дооперационной диагностики данной опухоли.

Поставленная задача решается за счет того, что из периферической венозной крови получают INF-альфа индуцированные дендритные клетки, определяют их цитотоксическую активность и при активности ниже 12% диагностируют глиобластому.

Решение поставленной задачи позволяет неинвазивно диагностировать наличие глиобластомы на дооперационном этапе, что дает возможность в каждом конкретном случае с учетом общего исходного состояния больного определить объем необходимого оперативного вмешательства и планировать допустимую степень радикальности удаления опухоли, чтобы предотвратить усугубление состояния больного и максимально возможно продлить срок его жизни. Такая диагностика также позволяет определить тактику дальнейшей комбинированной терапии, в т.ч. целесообразность проведения таких адъювантных методик, как комбинированная иммунотерапия и антиангиогенная терапия.

Технический результат достигается за счет включения в комплекс диагностических исследований определения цитотоксической активности INF-альфа индуцированных дендритных клеток, которая по нашим данным катастрофически снижена у пациентов с глиобластомой головного мозга.

Способ осуществляется следующим образом. На дооперационном этапе больному с подозрением на внутримозговую опухоль проводят КТ и МРТ обследование. В результате получают информацию о локализации опухоли. Затем у больного на дооперационном этапе (за 7-8 дней до операции) производится забор периферической венозной крови (20 мл) в вакутейнеры с гепарином. Мононуклеарные клетки (МНК) получают из указанной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина. Дендритные клетки генерируются путем культивирования прилипающей фракции МНК в 6-луночных планшетах в течение 3 суток в среде RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 5% сыворотки плодов коровы, в присутствии GM-CSF 1000 Ед/мл и INF-α 1000 Ед/мл с последующим дозреванием в течение 24 часов с липополисахаридом 10 мкг/мл.

Цитотоксическую активность дендритных клеток оценивают по выходу ³H-тимидина из разрушающихся опухолевых клеток линии НЕр-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека), в результате их лизиса в присутствии дендритных клеток. Для этого клетки линии НЕр-2 предварительно метят Н-тимидином (1 мКю/лунку) в течение 18 часов, отмывают и культивируют в 96-луночных планшетах (1×10³/лунку) с дендритными клетками в соотношении 20:1. Через 18 часов клетки переносят на фильтры и оценивают радиоактивность на β-счетчике. Жизнеспособные НЕр-2 клетки с высокомолекулярной ДНК задерживаются на фильтре, тогда как лизированные опухолевые клетки с фрагментированной ДНК удаляются с фильтра в процессе харвестирования. Количество клеток оценивается по количеству получаемых импульсов ³H-тимидина в минуту. Процент цитотоксичности рассчитывается по общепринятой формуле [1 - (импульс/мин в культурах с дендритными клетками / импульс/мин в контрольных культурах] × 100% (N.Vanderheyde, E.Aksoy, Z.Amraoui, et.al. Tumoricidal activity of monocyte-derived dendritic cells: Evidence for a Caspase-8-dependent, Fas-associated death domain-independent mechanism. J. Immunol., October 1, 2001; 167 (7): 3565-3569). Контролем служат клетки-мишени без добавления дендритных клеток. При цитотоксической активности дендритных клеток ниже 12% диагностируется глиобластома.

Примеры конкретного выполнения.

Больной Р. 46 лет, поступил в клинику нейрохирургии Новосибирского НИИТО 19.01.2010 с жалобами на слабость в правой руке и ноге, периодические головные боли, снижение памяти. Из анамнеза известно, что считает себя больным с конца декабря 2009 года, когда за неделю до нового года на фоне «полного здоровья» больной отметил появление слабости в правой руке и ноге, слабость постепенно нарастала, возникли затруднения при ходьбе. За помощью в поликлинику по месту жительства больной обратился 01.01.2010, когда слабость в правых конечностях стала настолько выраженной, что он с трудом передвигался. Осмотрен дежурным терапевтом, в поликлинику вызвана бригада скорой медицинской помощи, с диагнозом острое нарушение мозгового кровообращения в бассейне левой средней мозговой артерии больной направлен и госпитализирован в неврологическое отделение первой городской больницы. Начато консервативное лечение, без особого эффекта. 04.01.2010 выполнена мультисрезовая компьютерная томография головного мозга, по заключению которой имеется объемное образование левой гемисферы мозга. Рекомендовано проведение МРТ головного мозга, указанное исследование проведено 05.01.2010, заключение: дополнительное объемное образование в левом таламусе кистозно-солидной структуры с масс-эффектом и перифокальным отеком мозговой ткани, с патологическим ободковым накоплением контрастного вещества. Вторичная асимметрия боковых желудочков. Пациент направлен на консультацию к нейрохирургу ННИИТО, рекомендовано проведение оперативного лечения. Накануне госпитализации произведен забор периферической крови для генерации дендритных клеток. Показатели у больного были следующие: имп./мин в культурах с дендритными клетками - 12557, имп./мин в контрольных культурах без дендритных клеток - 12330 имп./мин. Цитотоксическая активность рассчитывалась по формуле: [1 - (имп./мин в культурах с дендритными клетками / имп./мин в контрольных культурах] х 100%. По результатам исследования цитотоксическая активность дендритных клеток у данного больного составила 0%, что в соответствии с критериями нашей диагностики указывало на наличие глиобластомы.

19.01.2010 пациент госпитализирован в нейрохирургическое отделение ННИИТО для проведения оперативного лечения. Общее состояние больного средней степени тяжести, обусловлено течением основного заболевания. Оценка по шкале Карновского 70 балов. В неврологическом статусе при поступлении: сознание ясное. Поведение адекватное. Положение активное. Ориентирован в месте, времени, собственной личности. Запахи различает. Острота зрения обычная. Цветоощущение полное. Поля зрения без изменений. Зрачки равные, прямая и содружественная реакции на свет. Конвергенция ослаблена слева, аккомодация сохранена. Глазные щели равные, деликатное ограничение отведения левого глазного яблока в остальном движения глаз в полном объеме. Изменений чувствительности на лице нет. В покое лицо симметричное, парезов мимической мускулатуры нет. Острота слуха справа и слева обычная. Нистагма нет. Глотание и фонация не нарушены. Положение плеч, лопаток, головы в покое без особенностей. Поднимание плеч, повороты головы - выполняет. Положение языка в ротовой полости и при высовывании по средней линии. Объем движений в правых конечностях ограничен из-за выраженной слабости, движения в левых конечностях в полном объеме. Сила в конечностях: справа в ноге 3 балла, в руке проксимально 2 балла, дистально 3 балла (правосторонний гемипарез). Тонус мышц в правых конечностях снижен. Сухожильные рефлексы живые, D>S. Кожные рефлексы симметрично снижены. Патологических рефлексов и менингеальных симптомов нет. В позе Ромберга - исследование не проводилось. Пальценосовую и пяточно-коленную пробы справа выполняет со значительным мимопопаданием, слева выполняет удовлетворительно. Отмечает гипестезию в правой руке и ноге, других нарушений чувствительности нет. Функция тазовых органов не нарушена. Соматически стабилен.

Учитывая показатели цитотоксической активности дендритных клеток, поставлен диагноз - глиобластома. С учетом возраста и состояния больного принято решение о субтотальном удалении опухоли.

20.10.2010 выполнена операция по плану: костно-пластическая трепанация в левой теменной области с удалением костного лоскута, микрохирургическое удаление внутримозговой опухоли в области левого таламуса под нейронавигационным контролем. Пластика ТМО аллотранплантатом. После операции больной соматически стабилен. Гистологическое исследование (№165-178/2010) подтвердило наличие глиобластомы.

Больная Е. 71 года поступила в клинику нейрохирургии Новосибирского НИИТО 28.09.2009 с предварительным диагнозом внутримозговой опухоли левой лобной доли. При поступлении предъявляла жалобы на онемение правой кисти, невозможность поднятия правой руки из-за слабости в ней, слабость в ногах, больше слева, затруднение при ходьбе из-за слабости в ногах, постоянный звон в ушах, боли в затылочной области справа и шее справа при движениях. Из анамнеза известно: в феврале 2008 года внезапно возникли острые боли в правых кисти и предплечье, иррадиирующие в правое плечо, шею и правую лопатку, онемение и снижение чувствительности в правой кисти и нижней трети предплечья, звон в ушах. Боли купировались самостоятельно, онемение и снижение чувствительности в правой кисти, звон в ушах сохранились. Появилась слабость в правой руке, невозможность полного отведения руки в плечевом суставе. Обратилась в поликлинику по месту жительства. Был поставлен диагноз остеохондроз шейного отдела позвоночника. Проводилось лечение без эффекта. Через полгода с момента появления указанных жалоб появилась слабость в ногах, больше слева, затруднение при ходьбе. В течение месяца беспокоят боли в затылочной области и шее справа при движениях головы, мелькание мушек перед левым глазом при взгляде влево. Была направлена в ЦРБ г.Барнаула, где выполнено МРТ головного мозга. Заключение от 12.08.2009: определяется округлое образование в левой теменной области, плотно прилегающее к твердой мозговой оболочке, с ровными четкими контурами с множественными кистозными очагами распада с перифокальным отеком левого полушария, сдавлением заднего рога и тела левого бокового желудочка, незначительным смещением срединных структур головного мозга (внутримозговая опухоль: глиобластома?). Пациентка направлена в НИИТО для оперативного лечения. В день поступления у больной произведен забор периферической крови для определения цитотоксической активности дендритных клеток. Получены следующие показатели: имп./мин в культурах с дендритными клетками - 532 имп./мин, имп./мин в контрольных культурах без дендритных клеток - 650 имп./мин. Вычисления проводились по выше указанной формуле. По результатам исследования цитотоксическая активность составила 19%, что указывает на отсутствие глиобластомы.

Общее состояние больной удовлетворительное. Оценка по шкале Карновского 90 баллов. В соматическом статусе больная стабильна, к предстоящей операции толерантна. В неврологическом статусе: сознание - ясное, поведение адекватное, ориентирована во времени, пространстве, своей личности. Правильно излагает анамнез. ЧМН: запахи различает. Острота зрения снижена. Цветоощущение полное. Зрачки среднего размера, равные. Фотореакции сохранены, живые. Конвергенция и аккомодация сохранены. Глазные щели равные, движения глаз в полном объеме. Нистагма нет. Язык по средней линии. Фонация, глотание не нарушены. Правосторонний гемипарез. Снижение болевой и тактильной чувствительности в правой кисти и нижней трети правого предплечья. Тонус в правой верхней конечности повышен. Тонус в правой нижней конечности несколько повышен. Рефлексы с рук средней живости, без убедительной разности сторон. С ног рефлексы средней живости с 2-х сторон. В позе Ромберга устойчива. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. Патологические знаки не определяются. Менингеальных симптомов нет. Функции тазовых органов не нарушены.

В плановом порядке выполнена операция: резекционная трепанация в лобно-теменной области слева. Удаление опухоли задней лобной области слева. Интраоперационно обнаружено, что указанная опухоль является менингиомой, что также подтверждено гистологическим исследованием (№4069-4078/2009): типическая менингиома смешанного строения. Таким образом, гистологические исследования подтвердили отсутствие глиобластомы.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ дооперационной диагностики глиобластомы головного мозга. Проводят КТ и МРТ обследование. Из периферической венозной крови получают INF-альфа индуцированные дендритные клетки и определяют их цитотоксическую активность. При активности ниже 12% диагностируют глиобластому. Изобретение обеспечивает неинвазивную диагностику глиобластомы на дооперационном этапе. Эта диагностика позволяет определить целесообразность проведения таких адъювантных методик, как комбинированная иммунотерапия и антиангиогенная терапия. 2 пр.

Способ дооперационной диагностики глиобластомы головного мозга путем КТ и МРТ обследования, отличающийся тем, что из периферической венозной крови получают INF-альфа индуцированные дендритные клетки, определяют их цитотоксическую активность и при активности ниже 12% диагностируют глиобластому.