ПРИМЕНЕНИЕ 5-МЕТИЛ-1,3-БЕНЗДИОЛА ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ В ИЗГОТОВЛЕНИИ ЛЕКАРСТВА И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПРОДУКТА ПИТАНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ДЕПРЕССИИ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/05 A61K31/351 A61K31/85 A61K31/7032 A61P25/24 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к применению 5-метил-1,3-бензолдиола или его производных или фармацевтических композиций, содержащих их, в изготовлении лекарств или функциональных продуктов питания (functional foods).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Депрессия представляет собой широко распространенное психическое расстройство, которое затрагивает до 20% общей численности населения. Общими считаются следующие симптомы депрессии: персистирующее или рекуррентное депрессивное настроение, тревога, беспокойство, расстройства сна, аномальная стрессовая реакция и функциональное когнитивное нарушение.

Благодаря нейрофармакологии в течение последних десятилетий разработано большое количество общепринятых животных моделей для оценки активности антидепрессантов. Наиболее широко используемыми моделями являются тест принудительного плавания и тест "подвешивания за хвост" на грызунах. В последние годы в многочисленных исследованиях было показано, что постоянное пребывание в темноте, недостаток сна и непрогнозируемый хронический легкий стресс являются этиологическими моделями возникновения депрессии. Эти модели лежат в основе исследования антидепрессантов. Несмотря на то что патогенез депрессии все еще окончательно не выяснен, изменения в гиппокампальной синаптической пластичности (например, долговременная потенциация) и ее роль в когнитивной функции могут представлять собой один из ключевых механизмов, лежащих в основе депрессии.

5-Метил-1,3-бензолдиол (общеизвестный как орцинол) обычно используют в качестве ингибитора термической полимеризации в процессе пиролиза промежуточных соединений для органического синтеза. Кроме того, он является реагентом для специфического определения РНК. 5-Метил-1,3-бензолдиол и его производные часто используют в качестве антиоксидантов, и они в значительной степени обладают антибактериальной активностью. До сих пор не сообщалось об их применении в снижении депрессии, тревоги, беспокойства, расстройств сна, аномальных стрессовых реакций или функционального когнитивного нарушения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению 5-метил-1,3-бензолдиола или его производных или фармацевтических композиций, содержащих их, в изготовлении лекарств или функциональных продуктов питания для лечения или предупреждения депрессии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к 5-метил-1,3-бензолдиолу или его производным для лечения депрессии или родственных ей заболеваний и причины этих заболеваний.

Соединения по настоящему изобретению представляют собой 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные, представленные формулой I:

где R¹ и/или R² представляют собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, маннозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил, пропионил, бензоил, циннамоил, сукцинил, метил, этил, пропил, бутил или бензил.

Более предпочтительно, соединения по настоящему изобретению представляют собой 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные, представленные формулой II:

где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, маннозил, 2,3,4,6,-тетра-O-ацетил-βD-глюкопиранозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил, пропионил, бензоил, циннамоил, сукцинил, метил, этил, пропил, бутил или бензил.

Более предпочтительно, когда R¹ представляет собой водород; β-D-глюкопиранозил; β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил. В этих случаях соединение формулы II является орцинолом, орцинол-1-О-β-О-глюкопиранозидом или орцинол-1-О-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозидом.

Более предпочтительно, соединения по настоящему изобретению представляют собой производные 5-метил-1,3-бензолдиола, представленные формулой III:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил, пропионил, бензоил, циннамоил, сукцинил, метил, этил, пропил, бутил или бензил.

В особенности, R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил или рамнопиранозил.

Более предпочтительно, соединения по настоящему изобретению представляют собой производные 5-метил-1,3-бензолдиола, представленные формулой IV:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил, пропионил, бензоил, циннамоил, сукцинил, метил, этил, пропил, бутил или бензил.

Предпочтительно, R² представляет собой 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил или ацетил.

Депрессия, как описано в четвертом издании руководства по Диагностике и статистике психических расстройств (DSM-IV), опубликованном Американской ассоциацией психиатров, и в десятом издании Международной классификации болезней (ICD-10), включает разные подтипы психических заболеваний и расстройств, включая: (1) депрессию и расстройства настроения, такие как депрессия, мания, смешанная мания и гипомания; (2) депрессивные расстройства, такие как депрессивное расстройство и плохое настроение; (3) другие аффективные расстройства, например, вызываемые ухудшением состояния здоровья, которые включают разные психические заболевания или подтипы расстройств с признаками депрессивных расстройств, и аффективные расстройства, вызываемые приемом веществ (например, вызывающих зависимость лекарственных средств) или терапией (такой как хирургия, лучевая терапия или химиотерапия); (4) биполярное расстройство или биполярное аффективное расстройство, которое включает два или более эпизодов депрессии и гипомании и чередующиеся эпизоды мании и депрессии.

Помимо симптомов депрессии, описанных в DSM-IV и ICD-10, настоящее изобретение также включает лечение и предупреждение расстройств циркадного ритма, расстройств сна, хронического стресса, тревоги, острого индуцированного стрессом нарушения или функционального когнитивного нарушения или расстройства.

Помимо депрессии настоящее изобретение также включает терапию и предупреждение заболеваний, ассоциированных с расстройствами циркадного ритма, расстройствами сна, хроническим стрессом, тревогой, острым индуцированным стрессом нарушением или функциональным когнитивным нарушением или расстройством. В дополнение к этому настоящее изобретение также включает предупреждение и терапию отчаяния (например, суицидальные мысли и поведение), расстройств настроения и аномальной острой стрессовой реакции.

Расстройства сна и циркадного ритма: расстройство сна, очень распространенное заболевание у пациентов с депрессией, представляет один из составляющих параметров рейтинговых шкал при оценке степени депрессии. Расстройства циркадного ритма имеют отношение к наиболее важной физиологической функции. В норме циркадный ритм запускается благодаря чередованию света и темноты. Разница во времени, время года, образ жизни или природа наследственности могут приводить к расстройствам циркадного ритма, которые затем могут выражаться в таких нарушениях высшей мозговой функции, как депрессия и функциональное когнитивное нарушение. В соответствии с DSM-IV или ICD-10 расстройства сна подразделяются на три основные категории: (1) диссомнии, такие как инсомния, гиперсомния, нарколепсия, ассоциированные с дыханием расстройства сна и ассоциированные с циркадным ритмом расстройства сна; (2) парасомнии, такие как ночной кошмар, паника во сне и лунатизм; (3) ассоциированные с состоянием здоровья расстройства сна и расстройства сна, вызываемые приемом веществ (например, вызывающих зависимость лекарственных средств), или терапией (такой как хирургия, лучевая терапия или химиотерапия).

Тревога представляет собой очень распространенный симптом у пациентов с депрессией. Она является одним из критериев для оценки степени депрессии. Тревожные расстройства включают две основные категории: (1) панические расстройства, например агорафобию, специфические панические расстройства (такие как боязнь конкретных животных, конкретной окружающей среды или переливания крови, социальная фобия или обсессивно-компульсивное расстройство), посттравматическое стрессовое расстройство, острое стрессовое расстройство и диссеминированное тревожное расстройство; и (2) ассоциированные с состоянием здоровья тревожные расстройства и расстройства, вызываемые приемом веществ (например, вызывающих зависимость лекарственных средств), или терапией (такой как хирургия, лучевая терапия или химиотерапия). Приподнятый крестообразный лабиринт и замирание представляют собой широко используемые модели грызунов для оценки противотревожной активности лекарственных средств.

В биологических системах стресс определяют как любое состояние, которое вносит серьезные нарушения в физиологический или психологический гомеостаз организма. Считается, что стресс является одним из основных факторов, ухудшающих многие заболевания или приводящих ко многим заболеваниям, таким как психическое заболевание и когнитивные функциональные расстройства. Вызывающие стресс события могут включать ряд повседневных событий и варьируют от человека к человеку. Прием некоторых веществ, например, вызывающих зависимость лекарственных средств, или прохождение такой терапии, как хирургия, обычно приводит к аномальным стрессовым реакциям. Широко используемые биологические индикаторы для оценки стресса включают уровни кортикостероидов (таких как кортикостерон у грызунов и кортизол у людей), которые могут приводить к релевантному острому индуцированному стрессом нарушению, такому как нарушение гиппокампальной синаптической пластичности, а также научения и памяти. В экспериментах на животных широко используемые стрессовые методы включают "удар электрическим током по лапам" (footshock) и "подвешенную платформу" (elevated platform).

Когнитивная деятельность является одной из наиболее важных высших мозговых функций. Она относится к научению, памяти, речи, мышлению и настроению. По-видимому, депрессия представляет собой вид когнитивного расстройства, и пациенты, страдающие от нее, автоматически имеют негативное мышление и настроение. В 1949 г. Хеб (Hebb) предложил такую идею, что изменение синапсов является основой научения и памяти. В 1973 г. эта гипотеза была подтверждена в экспериментах Блиссом (Bliss) с коллегами, которые открыли гиппокампальную долговременную потенциацию (LTP). Однако, до сих пор никакое лекарственное средство, напрямую регулирующее LTP, не было использовано для лечения депрессии в клинике. Более хорошие и более быстрые куративные эффекты могут быть достигнуты посредством разработки лекарственных средств, модифицирующих синаптическую пластичность, в лечении депрессии, родственных ей симптомов и ее причин.

5-Метил-1,3-бензолдиол или его производные можно использовать непосредственно в свободной форме или в виде фармацевтических композиций. Описываемые фармацевтические композиции содержат 0,1-99% в массовом отношении 5-метил-1,3-бензолдиола или его производных в фармацевтически приемлемых эксципиентах.

Использованный в данном описании термин "фармацевтические носители и/или эксципиенты" означает одно или более чем одно из следующего: твердого вещества, полутвердого или жидкого разбавителя, наполнителя или вспомогательного вещества любого типа. Фармацевтические композиции 5-метил-1,3-бензолдиола или его производных изготавливают таким образом, чтобы они содержали различные фармацевтически приемлемые эксципиенты или приемлемые пищевые добавки в соответствии с общеизвестными в области фармацевтики и пищевой промышленности методиками. Фармацевтически приемлемые эксципиенты или приемлемые пищевые добавки включены в спреи, аэрозоли, жидкости, такие как инъекционные растворы, суспензии, эмульсии и сиропы, и твердые вещества, такие как таблетки, капсулы и гранулы, или порошок, растворенный или суспендированный в жидкости.

В настоящем изобретении способы введения включают инъекцию или инфузию (внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную или подкожную) и пероральное, сублингвальное введение и введение через слизистую.

Эффективная дозировка активных компонентов (5-метил-1,3-бензолдиола или производных) для лечения или предупреждения вышеупомянутых заболеваний, их причин и симптомов составляет для взрослого от 0,1 мг/ сутки до 12 г/ сутки, а оптимальная дозировка для взрослого составляет 50-200 мг/ сутки.

Настоящим изобретением показано, что 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные, фармацевтические композиции, содержащие их, применяемые в изготовлении лекарств и функциональных продуктов питания для лечения или предупреждения депрессии, обеспечивают новый выбор для лечения или предупреждения депрессии и симптомов, предполагающих депрессию, таких как тревога, стресс и когнитивное нарушение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В следующих далее примерах описываются подробности в отношении соединений и способов для понимания и выполнения изобретения, но эти примеры не предназначены для ограничения изобретения и их никоим образом не следует истолковывать как ограничивающие данное изобретение, изложенное в формуле изобретения, которая следует далее. Соединения, описанные в настоящем изобретении, полученные любыми другими способами, и их применения для лечения депрессии, симптомов, предполагающих депрессию, и этиологических причин депрессии включены в настоящее изобретение.

Орцинол (OR), орцинол-1-О-β-D-глюкопиранозид (ORG) и орцинол-1-О-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозид (ORGG) могут быть экстрагированы из Curculigo orchioides Garr. Другие производные орцинола могут быть получены в соответствии с общеизвестными методиками. Конкретный способ приведен ниже.

1. Орцинол может взаимодействовать с соответствующим продуктом ацетилирования сахаров; чтобы R¹ и/или R² представляли собой β-D-глюкопиранозил, β-О-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил, соответствующие соединения могут быть получены посредством взаимодействия орцинола с указанным продуктом ацетилирования сахаров в метаноле в условиях защиты от попадания света и с добавлением бромистоводородной кислоты и уксусной кислоты при перемешивании в течение 1-5 ч при комнатной температуре. Получают ацетилированные орцинол-гликозиды. Соответствующие ацетилированные орцинол-гликозиды обрабатывают метилатом натрия в метаноле в течение 1-5 ч при комнатной температуре, получая соответствующие орцинол-гликозиды.

2. Чтобы R¹ и R² представляли собой ацил, орцинол или орцинол-гликозиды растворяют в пиридине с добавлением ангидридов или ацилхлоридов соответствующих карбоновых кислот и 10-20%-ного 4-диметиламинопиридина и перемешивают в течение 3-5 ч при 60-120°С. Смесь выливают в воду и затем экстрагируют хлороформом, получая неочищенный продукт, который очищают далее с получением ацилированных продуктов.

3. Чтобы R¹ и R² представляли собой алкил, орцинол или орцинол-гликозиды растворяют в тетрагидрофуране или диметилсульфоксиде с добавлением гидрида натрия и перемешивают в течение 30-60 мин. После добавления соответствующего донора алкила (алкилогена) реакционную смесь далее перемешивают в течение 3-5 ч, затем выливают в воду и экстрагируют хлороформом, получая неочищенный продукт, который очищают далее с получением алкилированных продуктов.

ПРИМЕР 1

Экстракция и выделение орцинол-1-О-β-D-глюкопиранозида, орцинола и орцинол-1-О-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозида

Curculigo orchioides Garr. собирали, сушили в тени или на солнце и превращали в порошок.

Порошкообразный материал (20 кг) экстрагировали 3 раза, используя 90%-ный этанола (200 кг) при кипячении с обратным холодильником, каждый раз в течение 2 ч. Экстракты объединяли и концентрировали примерно до 30 кг и фильтровали после осаждения в течение 12 ч. Неочищенные экстракты затем хроматографировали на колонке из макропористой смолы D-101 (масса смолы составляла 20 кг) и элюировали последовательно с помощью 100 кг дистиллированной воды, 60 кг 70%-ного этанола и 60 кг 90%-ного этанола. 70%-ный этанольный элюат и 90%-ный этанольный элюат собирали по отдельности и упаривали досуха, получая высушенный 70%-ный этанольный элюат (340 г) и высушенный 90%-ный этанольный элюат (60 г).

Полученный 70%-ный этанольный элюат (340 г) растворяли в метаноле и адсорбировали на 400 г силикагеля. После проведения сушки при комнатной температуре твердое вещество распыляли и просеивали, подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (2,1 кг, 200-300 меш) и элюировали смесью хлороформ-метанол-вода (от 90:10:1 до 70:30:3, об./об./об.), получая 26 фракций. Каждая фракция составляла 1500 мл. Фракции 2-3 объединяли, концентрировали и кристаллизовали из этанола, получая орцинол (5 г). Фракции 9-15 объединяли, концентрировали и кристаллизовали из этанола, получая орцинол-1-O-β-D-глюкопиранозид (50 г). Фракции 22-26 объединяли, концентрировали и кристаллизовали из этанола, получая орцинол-1-O-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозид (10 г).

Определение структуры: оптическое вращение измеряли, используя поляриметр SEPA-300; спектры UV-VIS (в УФ и видимой области) получали с использованием спектрометра UV-210A; ИК-данные собирали на спектрометре FTS-135 от Bio-Rad, используя таблетки KBr; спектры ядерного магнитного резонанса (¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР) снимали на спектрометре DRX500 от Bruker в CDCI₃ с использованием TMS (тетраметилсилана) в качестве внутреннего стандарта. Использовали материалы для колоночной хроматографии и силикагель для тонкослойной хроматографии от Makall Group Co. Ltd. (Qingdao, China).

Название: орцинол-1-О-β-D-глюкопиранозид.

Молекулярная формула: С₁₃Н₁₈О₇. Молекулярная масса: 286. Описание: светло-желтый порошок. [α]_D - 63,03° (с 5,95; метанол); УФ (метанол): λ_max (log ε) 279 (3.19), 273 (3.21), 219 (3.99), 203 (4.58); ИК (KBr): v_max 3495, 3385, 1620, 1596, 1175, 1076, 1032 см^-1; FAB-MS (-): m/z 285 [(М-1)^-, 100], 123 [(M-1-glc)^-, 87];

¹Н-ЯМР (CD₃OD, 400 МГц) δ_H: 6.41 (1Н, s, Н-2), 6.36 (1Н, s, Н-6), 6.29 (1Н, s, Н-4), 4.84 (1Н, d, J=7,3 Гц, Н-1'), 2.22 (3Н, s, H-7);

¹³С-ЯМР (CD₃OD, 100 МГц) δ_C: 160.1 (s, C-1), 111.4 (d, C-2), 159.2 (s, С-3), 102.4 (s, C-4), 141.3 (s, C-5), 110.0 (d, C-6), 21.6 (q, C-7), 102.5 (d, С-1'), 75.0 (d, C-2'), 78.1 (d, С-3'), 71.6 (d, C-4'), 78.2 (d, C-5'), 62.7 (t, C-6').

Название: орцинол.

Молекулярная формула: С₇Н₈О₂. Молекулярная масса: 124. Описание: белый порошок со светло-желтым оттенком. УФ (метанол): λ_max (log ε) 281 (3.20), 275 (3.22), 204 (4.59);

ИК (KBr): v_max 3313, 1629, 1601, 1512, 1477, 1332, 1208, 1148, 1032, 973 см^-1;

EI-MS (70 эВ): m/z 125 [(М+1)⁺, 8], 124 [М⁺, 100], 123 [(М-1)⁺, 55], 107 [(М+1-18)⁺, 7], 95 (12), 77(8);

¹Н-ЯМР (CD₃OD, 400 МГц) δ_Н: 6.14 (2Н, brs, Н-2, 6), 6.10 (1Н, brs, H-4), 2.16 (3Н, s, H-7);

¹³С-ЯМР (CD₃OD, 100 МГц) δ_C: 159.2 (s×2, C-1, 3), 108.7 (d×2, C-2, 6), 108.7 (s, C-4), 141.2 (s, C-5), 21.5 (q, C-7).

Название: орцинол-1-O-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозид.

Молекулярная формула: C₁₉H₂₈O₁₂. Молекулярная масса: 448. Описание: белый аморфный порошок. Т.пл.: 117-119°С; FAB-MS (-) (m/z): 447 [М-1]^-, 123 [М-1-2 glc]; ¹Н-ЯМР (400 МГц, CD₃OD) δ_H: 6.43 (1Н, brs, Н-2), 6.40 (1Н, brs, Н-4), 6.28 (1Н, brs, Н-6), 4.82 (1Н, d, J=7,30 Гц, Н-Г), 4.40 (1Н, d, J=7,73 Гц, Н-1"), 2.21 (3Н, s, H-7);

¹³С-ЯМР (125 МГц, CD₃OD) δ_C: 160.0 (s, С-1), 102.0 (d, С-2), 159.2 (s, С-3), 111.2 (d, C-4), 141.3 (s, C-5), 109.8 (d, C-6), 21.7 (s, C-7), 102.1 (d, C-1'), 74.8 (d, C-2'), 77,7 (d, С-3'), 71.3 (s, С-4'), 77.5 (d, С-5), 69.6 (t, C-6'), 104.6 (d, C-1”), 75.2 (d, C-2”), 77,8 (d, С-3”), 71.5 (d, C-4”), 77.9 (d, C-5”), 62.6 (t, C-6”).

ПРИМЕР 2

Получение 1,3-О-диацетилорцинола

В 100 мл круглодонную колбу загружали пиридин (40 мл) и орцинол (1,24 г; 0,01 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и по каплям добавляли уксусный ангидрид (3 мл). После перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре реакционную смесь выливали в 200 мл ледяной воды. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Органические слои объединяли, промывали 3 раза 5%-ной соляной кислотой, 3 раза насыщенным водным NaHCO₃ и 3 раза насыщенным хлоридом натрия, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха под вакуумом. Неочищенные продукт подвергали колоночной хроматографии на силикагеле и элюировали смесью петролейный эфир/ацетон (90:10, об./об.), получая 1,3-О-диацетилорцинол (1,87 г; выход 90%).

Название: 1,3-О-диацетилорцинол.

Молекулярная формула: C₁₁H₁₂O₄.

Молекулярная масса: 208.

Описание: бесцветное масло.

Структурные данные для 1,3-О-диацетилорцинола:

ESI-MS (+) m/z:231 [M+Na]⁺;

ИК (KBr) v_max: 1769, 1602, 1592, 1466, 1434, 1369, 1292, 1198, 1124, 1036 см^-1;

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ_Н: 6.78 (2Н, s, J=1,9 Гц, Н-4, 6), 6.71 (1Н, d, J=1,9 Гц, Н-2), 2.30 (3Н, s, H-7), 2.19 (s, 6H);

¹³С-ЯМР (CDCI₃) δ_C: 169.0 (s, СН₃ СО), 169.0 (s, СН₃ СО), 150.9 (s, C-1), 150.9 (s, C-3), 140.3 (s, C-5), 119.7 (d, C-4), 119.7 (d, C-6), 112.5 (d, C-2), 21.2 (q, C-7), 20.9 (q, CH₃CO), 20.9 (q, CH₃CO).

ПРИМЕР 3

Получение 3-О-ацетил-орцинол-1-О-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозида

Орцинол (286 мг) растворяли в пиридине (20 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и по каплям добавляли уксусный ангидрид (2,5 г; 25 ммоль). После перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре реакционную смесь выливали в 50 мл ледяной воды. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Органические слои объединяли, промывали 3 раза 5%-ной соляной кислотой, 3 раза насыщенным водным NaHCO₃ и 3 раза насыщенным хлоридом натрия, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха под вакуумом. Неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, получая 3-O-ацетил-орцинол-1-O-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозид (421 мг, выход 85%).

Название: 3-О-ацетил-орцинол-1-О-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозид.

Молекулярная формула: C₂₃H₂₈O₁₂. Молекулярная масса: 496. Описание: белый аморфный порошок. ESI-MS (+) m/z: 519 [M+Na]⁺; ИК (KBr) v_max: 1759, 1625, 1590, 1373, 1241, 1211 см^-1;

¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ_H: 6.68 (1Н, s, J=1,9 Гц), 6.63 (1Н, s, J=1,9 Гц), 6.54 (1Н, s, J=1,9 Гц), 5.30-5.22 (m, 2H), 5.14 (t, 1H, J=9,7 Гц), 5.06 (1Н, d, J=7,5 Гц), 4.28-4.14 (m, 2Н), 3.89-3.85 (m, 1Н), 2.31 (s, 3H), 2.27 (s, 3Н), 2.08 (s, 3Н), 2.05 (s, 3Н), 2.04 (s, 3Н), 2.03 (s, 3Н);

¹³С-ЯМР (CDCl₃) δ_C: 170.6 (s, СН₃ СО), 170.2 (s, СН₃ СО), 169.4 (s, CH₃ CO), 169.3 (s, CH₃ CO), 169.3 (s, CH₃ CO), 157.2 (s, C-3), 151.1 (s, C-1), 140.6 (s, C-5), 117.2 (d, C-6), 115.1 (d, C-4), 107.6 (d, C-2), 98.8 (s, C-1'), 72.6 (d, C-3'), 72.0 (d, C-5'), 71.0 (d, C-2'), 68.2 (d, C-4'), 62.0 (t, C-6'), 21.5 (q, C-7), 21.1 (q, CH₃CO), 20.6 (q, CH₃CO×4).

ПРИМЕР 4

Получение орцинол-1-тетра-О-ацетил-рамнопиранозы

Тетра-О-ацетил-рамнопиранозу (36 г) растворяли в смеси (100 мл) бромистоводородной кислоты и уксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч в условиях защиты от попадания света. Реакционную смесь выливали в 500 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (3×500 мл). Органические слои объединяли, промывали 3 раза водой, 3 раза 5%-ным водным NaHCO₃ и 3 раза насыщенным хлоридом натрия, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха под вакуумом, получая тетра-О-ацетил-рамнопиранозил-бромид.

Орцинол (12,4 г) растворяли в хлороформе (20 мл). Реакционную смесь перемешивали и добавляли 5%-ный раствор гидроксида натрия (20 мл). Когда температура поднималась до 50°С, по каплям добавляли раствор тетра-О-ацетил-рамнопиранозил-бромида (0,12 моль), растворенный в хлороформе. Реакционную смесь перемешивали при 50°С до полного завершения реакции, затем выливали в 150 мл ледяной воды. рН подводили до 7, используя 5%-ную соляную кислоту. Смесь экстрагировали этилацетатом. Органические слои объединяли, промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха под вакуумом. Неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии на силикагеле и элюировали смесью этилацетат-петролейный эфир (5:1, об./об.), получая орцинол-1-тетра-О-ацетил-рамнопиранозу (1,87 г; выход 90%).

ПРИМЕР 5

Получение орцинол-1-рамнопиранозы

Метилат натрия (0,18 г) добавляли к раствору орцинол-1-тетра-О-ацетил-рамнопиранозы (4,14 г) в метаноле (20 мл). После перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре реакционную смесь нейтрализовали 5%-ной соляной кислотой. Метанол удаляли под вакуумом после добавления дистиллированной воды (50 мл). Смесь экстрагировали н-бутанолом (3×50 мл). Органические слои объединяли, промывали насыщенным хлоридом натрия, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали досуха под вакуумом. Неочищенный продукт кристаллизовали из этанола, получая орцинол-1-рамнопиранозу.

ПРИМЕР 6

Орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид, полученный в соответствии с ПРИМЕРОМ 1, растворяли в воде для инъекций. После стерильной фильтрации (фильтрация через 0,2-0,45 мкм фильтр) раствор разливали во флаконы, герметично закрывали и стерилизовали, получая инъекционный раствор орцинол-1-O-β-D-гликопиранозида.

ПРИМЕР 7

Орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид, полученный в соответствии с ПРИМЕРОМ 1, растворяли в стерильной воде для инъекций. Раствор фильтровали посредством вакуумной фильтрации, используя воронку Бюхнера, фильтровали с применением прецизионного фильтра (фильтрация через 0,2-0,45 мкм фильтр) в стерильных условиях, разливали в ампулы и герметично укупоривали после лиофилизации, получая лиофилизированный порошок орцинол-1-O-β-D-гликопиранозида для инъекций.

ПРИМЕР 8

Орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид, полученный в соответствии с ПРИМЕРОМ 1, смешивали с эксципиентами, получая порошок орцинол-1-O-β-D-гликопиранозида для инъекций. Весовое отношение первого к последнему составляло 9:1.

ПРИМЕР 9

Орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид получали в соответствии с ПРИМЕРОМ 1. Таблетки, капсулы и гранулы готовили путем смешивания орцинол-1-O-β-D-гликопиранозида с эксципиентами в весовых соотношениях соединения и эксципиентов от 1:5 до 1:10.

ПРИМЕР 10

Орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид получали в соответствии с ПРИМЕРОМ 1. Пероральный жидкий орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид готовили в соответствии с традиционными методами.

ПРИМЕР 11

Орцинол-1-O-β-D-гликопиранозид получали в соответствии с ПРИМЕРОМ 1. Капсулы и гранулы готовили путем смешивания орцинол-1-O-β-D-гликопиранозида с эксципиентами в весовом соотношении 5:1.

ПРИМЕР 12

Смешивали орцинол-1-О-β-D-гликопиранозид (12,4 г), полученный в соответствии с ПРИМЕРОМ 1, крахмал (600 г), лактозу (200 г), ментол (5 г) и карбоксиметил-крахмала натриевую соль (183 г) и затем готовили пастилки в качестве функционального продукта питания.

Для лучшего понимания сущности изобретения изучали фармакологические эффекты фармацевтических композиций, содержащих орцинол или его производные и фармацевтические носители или эксципиенты. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными подробностями.

Эксперимент 1

Фармакологическое исследование ORG и OR

1. Антидепрессантные эффекты ORG и OR с зависимостью доза-эффект в тесте "подвешивания за хвост" (TST) и тесте принудительного плавания (FST) на крысах и мышах

1.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming и крыс Sprague-Dawley (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов возраст мышей составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Крысы весили 250-300 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблицах 1-5. Орцинол (OR), орцинол-1-О-β-D-глюкопиранозид (ORG), орцинол-1-O-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозид (ORGG), 1,3-О-диацетилорцинол (OR-2Ac) и 3-О-ацетил-орцинол-1-О-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозид (ORG-5Ac) получали согласно Примерам 1, 2 и 3. Животных разделяли на экспериментальную группу, получающую разные дозы, группу, получающую носитель, и две группы положительного контроля, представляющие собой группу, получающую имипрамин (Sigma, № партии 106k1588), и группу, получающую венлафаксин (Wuhan Yuancheng Co., Ltd., № партии 200701001).

Лекарственные средства: ORG растворяли в изотоническом растворе. Что касается положительных контролей, то имипрамин или венлафаксин суспендировали в изотоническом растворе, содержащем 0,5% СМС-натрия (карбоксиметилцеллюлозы натриевая соль), посредством обработки ультразвуком. Доза имипрамина или венлафаксина составляла 15 мг/кг. Объем для i.g. (внутрижелудочной) или i.p. (внутрибрюшинной) инъекции составлял 0,1 мл/10 г для мышей и 1 мл/100 г или 0,1 мл/100 г для крыс.

FST на мышах: прибор состоял из цилиндра (высотой 24 см × 15 см в диаметре), заполненного водой на 17 см, при температуре 24±2°С. Все лекарственные средства и носители вводили за 24 ч и 5 ч перед началом FST. Время неподвижности мышей в пределах последних 4 мин суммарного 6-минутного периода регистрировали вручную.

FST на крысах: в каждом эксперименте проводили два сеанса плавания. Сначала в течение 15 мин выполняли предварительный сеанс плавания и время неподвижности в пределах первых 5-минутных периодов времени регистрировали вручную. Если время неподвижности было слишком большим или слишком маленьким, крысу отбраковывали. Все лекарственные средства и носители вводили дважды на момент времени 0 и через 19 ч после предварительного сеанса плавания. Через двадцать четыре часа после предварительного сеанса плавания регистрировали вручную время неподвижности в пределах 5-минутного тест-сеанса.

TST на мышах: все лекарственные средства и носители вводили за 24 ч и 5 ч перед началом TST. Мышей подвешивали с помощью самоклеящейся ленты, присоединяя их за хвосты на расстоянии 2 см от кончика хвоста к горизонтальной перекладине, размещенной на 50 см выше пола камеры для тестирования. Время неподвижности в пределах 6 мин регистрировали вручную.

Анализ данных: результаты выражали в виде среднего значения ± SEM (стандартная ошибка среднего) и анализировали, используя программное обеспечение SPSS 11. Сравнения между группами проводили, используя однофакторные анализы дисперсии (ANOVA) с последующим тестом касательно наименьшей значимой разности (LSD). Уровень значимости устанавливали как Р<0,05. Величины ED₅₀ рассчитывали, используя программное обеспечение GraphPad Prism.

1.2. Результаты

1.2.1. Антидепрессантный эффект ORG (i.g.) no FST на крысах

Таблица 1 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG (i.g.) в FST на крысах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 1 мл/100 г 30 179,50±5,32   ORG 0,0625 10 187,20±11,97 0,60 0,125 20 181,50±8,19 0,86 0,1875 20 138,90±13,31* 0,006 0,25 20 121,05±9,44* <0,001 0,5 20 113,70±6,74* <0,001 1 20 96,87±7,40* <0,001 2 20 91,60±7,06* <0,001 4 20 84,40±9,20* <0,001 8 20 94,30±9,86* <0,001 16 20 91,40±11,36* <0,001 32 19 107,26±10,74* <0,001 64 20 105,90±19,77* <0,001 128 20 103,00±17,42* <0,001 Венлафаксин 15 10 100,80±9,84* <0,001 Имипрамин 15 29 92,72±7,09* <0,001 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

Оценивали зависимость эффекта от дозы ORG, перорально введенного крысам. ORG уменьшал время неподвижности, и этот эффект значительно зависел от дозы (Таблица 1). Доза наилучшей эффективности составляла 4 мг/кг, a ED₅₀ составляла примерно 0,22 мг/кг.

1.2.2. Антидепрессантный эффект ORG (i.g.) no FST на мышах

В настоящем исследовании ORG вводили i.g. за 24 ч и 5 ч перед началом FST. Время неподвижности уменьшалось, и этот эффект значительно зависел от дозы (Таблица 2). Доза наилучшей эффективности составляла 3 мг/кг, a ED₅₀ составляла примерно 0,22 мг/кг.

Таблица 2 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG (i.g.) в FST на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 108 178,50±3,04   ORG 0,093 40 169,35±4,32 0,26 0,186 30 155,30±9,19* 0,01   0,3725 30 137,57±6,41* <0,001 0,75 60 139,45±7,04* <0,001 1,5 60 127,23±6,63* <0,001 3 78 114,41±6,23* <0,001 6 70 129,76±5,99* <0,001 12 70 122,71±5,56* <0,001 24 70 121,57±6,13* <0,001 48 69 135,36±4,60* <0,001 96 50 145,34±5,39* <0,001 Венлафаксин 15 78 134,28±3,76* <0,001 Имипрамин 15 79 131,20±3,91* <0,001 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

1.2.3. Антидепрессантный эффект ORG (i.g.) no TST на мышах

ORG вводили i.g. за 24 ч и 5 ч перед началом TST. Время неподвижности уменьшалось, и этот эффект значительно зависел от дозы (Таблица 3). Доза наилучшей эффективности составляла 12 мг/кг, a ED₅₀ составляла примерно 0,73 мг/кг.

Таблица 3 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG (i.g.) в TST на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 38 161,18±5,47   ORG 0,1875 40 161,70±6,89 0,95 0,375 40 155,68±6,77 0,52 0,5 30 125,30±6,93* <0,001 0,75 30 117,33±6,56* <0,001 1,5 30 109,27±6,81* <0,001 3 30 98,07±5,95* <0,001 6 30 89,73±5,02* <0,001 12 30 77,67±5,33* <0,001 24 30 91,03±7,44* <0,001 48 20 100,20±10,46* <0,001 96 19 107,68±8,85* <0,001 Венлафаксин 15 20 102,85±9,34* <0,001 Имипрамин 15 40 105,65±5,71* <0,001 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

1.2.4. Антидепрессантный эффект OR (i.p.) по FST на мышах

В этом исследовании OR вводили i.p. за 24 ч и 5 ч перед началом FST. Время неподвижности уменьшалось (Таблица 4).

Таблица 4 Влияние OR (i.p.) на время неподвижности в FST на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 9 156,56±19,78   OR 10 10 82,40±10,64* 0,005 Имипрамин 15 13 96,38±12,04 0,15 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

1.2.5. Антидепрессантный эффект производных ORG (i.p.) no FST на мышах

В этом исследовании производные ORG (ORGG, OR-2Ac и ORG-5Ac) вводили внутрибрюшинной (i.p.) инъекцией за 24 ч и 5 ч перед началом FST. Все производные ORG уменьшали время неподвижности мышей в модели FST (Таблица 5).

Таблица 5 Влияние производных ORG (i.p.) на время неподвижности в FST на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 10 213,60±3,77   ORGG 10 10 184,20±11,29* 0,012 OR-2AC 10 10 170,10±6,37* <0,001 ORG-5AC 10 10 178,90±9,61* 0,003 Имипрамин 15 10 146,00±6,46* <0,001 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

1.3. Терапевтический индекс (TI) антидепрессантной активности ORG

В тесте острой токсичности, когда мышам Kunming вводили ORG в дозе 1750 мг/кг, в насыщающей концентрации, в этологическом и гистологическом исследовании никакого отклонения от нормы обнаружено не было. Таким образом, средняя токсическая доза (TD₅₀) ORG превышала 1750 мг/кг.

Терапевтический индекс (TI) для ORG на мышах в FST равен TD₅₀/ED₅₀ = >1750 мг/кг/0,22 мг/кг = >7955.

Терапевтический индекс (TI) для ORG на мышах в TST равен TD₅₀/ED_5O = >1750 мг/кг/0,73 мг/кг = >2397.

Эксперимент 2

Зависимость от времени антидепрессантного эффекта ORG в тесте принудительного плавания (FST) на мышах

2.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблицах 6-8. ORG получали, как описано в Примере 1. Животных разделяли на экспериментальные группы, получающие разные дозы, и контрольные группы, получающие носитель.

2.1.1. Введение и план эксперимента

ORG растворяли в изотоническом растворе (NS) в разных концентрациях. Все лекарственные средства и их носители вводили перорально в объеме 0,1 мл/10 г.

2.1.2. Частота введения

Животных обрабатывали ORG (3 мг/кг) или NS 1-5 раз перорально в течение 24 ч. Время неподвижности регистрировали через 5 ч после последней обработки ORG.

2.1.3. Сравнение разных доз и частоты введения

Мышей обрабатывали один раз, используя ORG в дозе 6 мг/кг, или дважды, используя ORG в дозе 3 мг/кг, в пределах 24 ч. Время неподвижности регистрировали через 5 ч после последней обработки ORG.

2.1.4. Влияние ORG на антидепрессантную активность (время начала и сохранение продолжительности действия)

Мышей обрабатывали ORG (3 мг/кг). Через девятнадцать часов после введения давали следующую дозу ORG (3 мг/кг).

Время неподвижности регистрировали через 2,5 ч, 5 ч, 24 ч, 72 ч и 2 недели после второго введения.

2.1.5. Анализ данных

Результаты выражали в виде среднего значения ± SEM (%). Времена неподвижности групп, получающих NS, принимали за 100% и антидепрессантный эффект для каждой группы рассчитывали относительно группы NS. Более хороший антидепрессантный эффект показан в виде более низкой величины в процентах. Этот метод нормализации позволял проводить сравнения между экспериментальными группами. В качестве статистического анализа применяли однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом. Величина Р<0,05 считалась значимой.

2.2. Результаты

2.2.1. Антидепрессантный эффект ORG при разной частоте введения в пределах 24 ч по FST на мышах

ORG (3 мг/кг) вводили 1-5 раз в пределах 24 ч. Время неподвижности значительно уменьшалось в группах, обработанных 2 или 3 раза ORG (Таблица 6). Результаты показывают, что наилучший лекарственный эффект получали после 2 или 3 раз введения в пределах 24 ч с интервалами 10-19 ч.

Таблица 6 Частота введения и антидепрессантный эффект ORG по FST на мышах Группа Доза (мг/кг) Частота введения в пределах 24 ч Количество животных Неподвижность (% от NS) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS     10 100     3 1 10 83,57±6,66 0,098 ORG 3 2 10 64,98±5,96* 0,001 3 3 10 65,65±9,67* 0,001   3 4 10 89,81±6,50 0,302   3 5 10 91,26±5,93 0,375 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

2.2.2. Сравнение антидепрессантного эффекта для разных частот введения одной и той же конечной дозы в пределах 24 ч

Когда мышей обрабатывали ORG один раз в дозе 6 мг/кг или обрабатывали ORG два раза в дозе 3 мг/кг в пределах 24 ч, времена неподвижности уменьшались во всех группах (Таблица 7). Но более хороший эффект был показан на мышах, обработанных ORG дважды в дозе 3 мг/кг в пределах 24 ч.

2.2.3. Антидепрессантный эффект ORG с быстрым началом и продолжительным сохранением действия в FST

Мыши получали ORG перорально (3 мг/кг). Через девятнадцать часов им давали следующую дозу ORG (3 мг/кг). Время неподвижности регистрировали через 2,5 ч, 5 ч, 24 ч, 72 ч и 2 недели после второго введения. Антидепрессантный эффект ORG быстро проявлялся через 2,5 ч после второго введения. Наилучший эффект проявлялся через 24 ч после второго введения, и этот эффект сохранялся в течение по меньшей мере 72 ч (Таблица 8). Результаты показывают, что ORG обладает быстрым началом проявления антидепрессантного эффекта, который продолжается в течение по меньшей мере 72 ч.

Таблица 8 Зависимость время-ответ для ORG в FST на мышах Группа Доза (мг/кг) Время после последнего введения (ч) Количество животных Неподвижность (% от NS) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS     50 100   ORG 6 2,5 20 73,63±4,21* <0,001 6 5 20 71,92±6,05* 0,001 6 24 20 62,83±6,59* <0,001 6 72 20 77,33±6,07* 0,002 6 2 (недели) 20 99,54±5,54 0,954 *Р<0,05 (однофакторньй ANOVA с последующим LSD-тестом).

Эксперимент 3

Антидепрессантный эффект ORG в модели непрогнозируемого хронического легкого стресса на мышах

Непрогнозируемый хронический легкий стресс (CMS) рассматривается как модель депрессии, имеющая ту же этиологию хронического стресса, который индуцирует депрессию или является причиной депрессии у людей. Ряд непрогнозируемых легких стрессов, таких как ограничение употребления жидкости и пищевых продуктов, ограничение передвижения и плавание, может приводить к тому, что у животных будет отсутствовать ответ на вознаграждение (например, предпочтение сладкому питью). Время неподвижности значительно повышалось в FST и TST после воздействия CMS, что указывает на более тяжелую депрессию. Таким образом, CMS широко используется для оценки влияния антидепрессантов на депрессию, вызываемую стрессом.

3.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблицах 9 и 10. ORG получали, как описано в Примере 1. Животных разделяли на экспериментальные группы, получающие разные дозы, контрольную группу, получающую носитель, и группу, получающую имипрамин (Sigma, № партии 106k1588), в качестве положительного контроля.

Модель CMS: мышей Kunming подвергали следующим хроническим легким стрессам: изменению циркадного ритма, постоянному освещению, холоду, воздействию отсыревшей подстилки (damp bedding), пребыванию в клетках с изменяющимся углом наклона (tilt cages), ограничению употребления пищевых продуктов и жидкости и ограничению передвижения. Каждую мышь, выбранную произвольно, подвергали только одному из этих видов стресса в пределах 24 ч и одним и тем же видом стресса не воздействовали два раза подряд. Стрессовый период продолжался в течение 8 недель. В последнюю неделю ORG вводили перорально один раз в сутки в течение 7 последующих суток. Поведенческий тест проводили через 30 мин после последнего введения. Тестировали следующие параметры: время неподвижности в FST и TST в модели CMS на мышах. Методики FST и TST и анализ данных описаны выше.

3.2. Результаты

3.2.1 Антидепрессантный эффект ORG в FST в модели CMS на мышах

ORG значительно уменьшал время неподвижности в FST, и данные эффекты значительно зависели от дозы (Таблица 9). Наилучшая доза для антидепрессантного эффекта составляла 20 мг/кг, a ED₅₀ составляла 0,81 мг/кг.

Таблица 9 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG в FST в модели CMS на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 28 208,00±5,57     1,25 10 190,90±12,94 0,255   2,5 11 177,00±11,78* 0,033 ORG 5 10 177,50±12,39* 0,043   10 19 170,84±10,48* 0,002   20 20 164,95±11,36* <0,001 Имипрамин 15 10 166,00±13,84* 0,005 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

3.2.2. Антидепрессантный эффект ORG в TST в модели CMS на мышах

ORG значительно уменьшал время неподвижности в TST, и данные эффекты значительно зависели от дозы (Таблица 10). Наилучшая доза для антидепрессантного эффекта составляла 20 мг/кг, a ED₅₀ составляла примерно 4,22 мг/кг.

Таблица 10 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG в TST в модели CMS на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 16 185,25±6,66     1,25 10 171,20±13,02 0,392 ORG 5 10 146,30±11,66* 0,018   10 16 145,31±12,41* 0,006   20 16 140,69±14,14* 0,002 Имипрамин 15 9 131,22±10,61* 0,002 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

3.3. TI для ORG в TST и FST в модели CMS на мышах

При тестировании острой токсичности, когда мышам вводили ORG в дозе 1750 мг/кг, в насыщающей концентрации, в этологическом и гистологическом исследовании отклонений от нормы обнаружено не было. Таким образом, средняя токсическая доза (TD₅₀) ORG превышала 1750 мг/кг.

Терапевтический индекс (TI) для ORG в модели CMS на мышах в FST равен >1750 мг/кг/0,81 мг/кг = >2160.

Терапевтический индекс (TI) для ORG в модели CMS на мышах в TST равен TD_5O/ED₅₀ = >1750 мг/кг / 4,22 мг/кг = >415.

Эксперимент 4

Антидепрессантный эффект ORG в модели постоянной темноты (DD) на мышах

Модель DD представляет собой недавно предложенную этиологическую модель, которую используют для изучения депрессии, ассоциированной с нарушением циркадного ритма. В этой модели циркадный ритм животного меняется в условиях непрерывного увеличения продолжительности периода темноты, что индуцирует или вызывает депрессию. Поэтому в данном исследовании модель DD использовали, чтобы вызвать или индуцировать депрессию, а антидепрессантный эффект ORG затем тестировали в FST и TST.

4.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблицах 11 и 12. ORG получали, как описано в Примере 1. Животных разделяли на экспериментальные группы, получающие разные дозы, контрольные группы, получающие носитель, и группу, получающую имипрамин (Sigma, № партии 106k1588), в качестве положительного контроля.

Модель DD на мышах: мышей содержали в условиях 24 ч непрерывной темноты. Замену подкладки, добавление корма и воды и другие операции проводили при том условии, что интенсивность красного света составляла менее 1,0 люкс. Продолжительность пребывания при таком условии составляла 28 суток. В последнюю неделю ORG вводили перорально один раз в сутки в течение 1 недели. FST и TST проводили через 30 мин после последнего введения. Методы и анализ данных были аналогичны описанным выше.

4.2. Результаты

4.2.1. Антидепрессантный эффект ORG в FST в модели DD на мышах

ORG значительно уменьшал время неподвижности в FST, и данные эффекты значительно зависели от дозы (Таблица 11). Доза наилучшей эффективности составляла 10 мг/кг, a ED₅₀ составляла примерно 1,48 мг/кг.

Таблица 11 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG в FST в модели DD на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 32 193,13±5,57   ORG 1,25 11 180,27±10,36 0,306 2,5 11 174,27±11,89 0,134 5 10 161,70±14,89* 0,016 10 21 151,86±8,89* <0,001 40 10 156,60±13,86* 0,005 Имипрамин 15 11 161,22±13,08* 0,019 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом)

4.2.2. Антидепрессантный эффект ORG в TST в модели DD на мышах

ORG значительно уменьшал время неподвижности в TST, и данные эффекты значительно зависели от дозы (Таблица 12). Доза наилучшей эффективности составляла 20 мг/кг, a ED₅₀ составляла примерно 1,75 мг/кг.

Таблица 12 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG в TST в модели DD на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 16 185,25±6,66   ORG 1,25 10 171,20±13,02 0,392 5 10 146,30±11,66* 0,018 10 16 145,31±12,41* 0,006 20 16 140,69±14,138* 0,002 Имипрамин 15 9 131,22±10,61* 0,002 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

Эксперимент 5

Антидепрессантный эффект ORG в модели депривации сна (SD) на мышах

Расстройство сна является одним из симптомов депрессии. Оно может быть одним из патологических факторов, которые вызывают или индуцируют депрессию. Подобное депрессии поведение, такое как неподвижность, усиливается в результате депривации сна. В таком случае использовали модель SD, чтобы вызвать или индуцировать депрессию, и затем тестировали антидепрессантный эффект ORG в FST и TST в модели SD на мышах.

5.1. Метод эксперимента

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблице 13. ORG получали, как описано в Примере 1. Животных разделяли на экспериментальные группы, получающие разные дозы, контрольную группу, получающую носитель, и группу, получающую имипрамин (Sigma, № партии 106k1588), в качестве положительного контроля.

Модель SD: чтобы проверить модель SD на мышах, использовали модифицированный способ с многочисленными платформами в окружении воды. Мышам на платформах предоставляли свободный доступ к корму и питью. Вместе с тем, как только мышь засыпала, она падала в воду вследствие потери мышечного тонуса. Упавшее животное вновь карабкалось на платформу по качающемуся шесту (tilt pole), который подпирал платформы. Через 72 ч депривации сна вводили ORG перорально за 24 ч и 5 ч перед началом FST. Регистрировали время неподвижности животных. Методы и анализ данных были аналогичны описанным выше.

5.2. Результаты

5.2.1. Антидепрессантный эффект ORG no FST в модели SD на мышах

На третьи сутки трехсуточной депривации сна вводили ORG дважды за 24 ч и 5 ч перед началом FST. ORG значительно уменьшал время неподвижности в FST, и данные эффекты значительно зависели от дозы (Таблица 13). Доза наилучшей эффективности составляла 10 мг/кг, a ED₅o составляла примерно 3,79 мг/кг.

Таблица 13 Зависимость времени неподвижности от дозы ORG в TST в модели SD на мышах Группа Доза (мг/кг) Количество животных Время неподвижности (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 26 189,27±9,67   ORG 1,25 10 198,00±11,43 0,570 ORG 2,5 12 177,67±15,95 0,421 ORG 5 10 160,80±11,64 0,064 ORG 7,5 10 153,00±11,83* 0,019 ORG 10 22 148,23±7,80* 0,001 ORG 20 21 162,67±9,27* 0,029 Имипрамин 7,5 11 150,27±13,17* 0,009 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

5.3. Терапевтический индекс для ORG в модели DD и модели SD на мышах

Средняя токсическая доза (TD₅₀) ORG превышала 1750 мг/кг (см. выше). Терапевтический индекс для ORG в модели DD на мышах в FST равен TD₅₀/ED₅₀ = >1750 мг/кг/ 1,48 мг/кг = >1182. Терапевтический индекс для ORG в модели DD на мышах в TST равен TD₅₀/ED₅₀ = >1750 мг/кг / 1,75 мг/кг = >1000. Терапевтический индекс для ORG в модели SD на мышах в FST равен TD₅₀/ED₅₀ = >1750 мг/кг / 3,79 мг/кг = >462.

Эксперимент 6

Фармакологическое изучение противотревожного эффекта ORG

Замирание, индуцируемое ударом электрическим током по лапам и стрессом, вызываемым условно-рефлекторным страхом, у грызунов широко распространено в качестве моделей для оценки уровня тревожности. Грызуны демонстрируют замирание, когда получают вызывающие отрицательную реакцию раздражители. Замирание, представляющее собой нормальный ответ животных на неизбежное стимулирование страхом, определяется как полное отсутствие движений тела или сохранение скорченной позы. Анксиолитики уменьшают продолжительность замирания животных. Кроме того, для оценки тревожности на грызунах широко используется модель приподнятого крестообразного лабиринта. Оценка тревожности основана на конфликте между стремлением к исследованию нового окружения и страхом высоты, поэтому грызуны невольно тратят больше времени при выборе цели в модели приподнятого крестообразного лабиринта, если они испуганы. Таким образом, реакция при исследовании нового окружения усиливается под действием анксиолитиков и тормозится под действием анксиогенных средств.

6.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблице 14. ORG получали, как описано в Примере 1. Животных разделяли на группы, которым вводят лекарственное средство - ORG в разных дозах, на контрольную группу, получающую носитель, и группу, получающую диазепам (Jinyao Ltd. Co., № партии 106k1588), в качестве положительного контроля.

Замирание, индуцированное ударом электрического тока по лапам: животные получали i.p. инъекцию ORG или носитель за 24 ч и 5 ч перед помещением их в камеру с содержанием в стандартных условиях (Med. Associates, USA) на 10 мин в течение сеанса научения. Через две, 4, 6, 8 и 10 мин после начала сеанса через решетчатый пол камеры выводили удар электрическим током по лапам (0,8 мА, 2 с). В течение последних 5 мин регистрировали продолжительность замирания. Крыс вновь помещали в камеру без удара электрическим током по лапам через 24 ч после первого научения и регистрировали продолжительность замирания.

Приподнятый крестообразный лабиринт (ЕРМ): ЕРМ имел два открытых и два закрытых "рукава" равного размера (30 см длиной × 5 см шириной). Два закрытых рукава были соединены центральной зоной 5 см × 5 см. Весь лабиринт был поднят на высоту 35 см. ORG вводили i.p. за 24 ч и 5 ч перед началом тестирования. Мышей располагали по отдельности в центре лабиринта по направлению к закрытому рукаву. Каждое животное тестировали в течение 5 мин в одном сеансе. Регистрировали количество выходов в открытые рукава, количество выходов в закрытые рукава, общее время, проведенное в открытых рукавах, и общее время, проведенное в закрытых рукавах; начало выхода определяли, как только все конечности оказывались в рукаве. Количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в открытых рукавах, представляли собой основные показатели для оценки уровня тревожности животных: чем больше выходов или продолжительность пребывания, тем меньше уровень тревожности.

Анализ данных: результаты теста выражали в виде среднего значения ± SEM. Использовали однофакторный ANOVA, затем LSD-тест с программным обеспечением SPSS 11. Устанавливали уровень значимости как Р<0,05.

6.2. Результаты

6.2.1. Противотревожный эффект ORG в тесте замирания, индуцированного ударом электрического тока по лапам, на крысах

Продолжительность замирания уменьшалась значительно у крыс, когда им вводили ORG внутрибрюшинно за 24 ч и 5 ч перед началом тестирования (Таблица 14).

Таблица 14 Зависимость ответа от дозы ORG в тесте замирания, индуцированного ударом электрического тока по лапам, на крысах Группа Доза (мг/кг) Количество крыс Продолжительность замирания (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/100 г 10 227,90±20,70   ORG 5 10 203,90±34,09 0,523   20 10 100,70±21,78* 0,002 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

6.2.2. Противотревожный эффект ORG в тесте замирания, индуцированного стрессом, вызываемым условно-рефлекторным страхом, на крысах

Крысы получали ORG i.p. дважды за 24 ч и 5 ч перед получением ударов электрическим током по лапам, и их возвращали в те же условия без удара электрическим током по лапам через 24 ч. Воспроизведение памяти о страхе, индуцированное внешними стимулами, приводит к замиранию, индуцированному стрессом, вызываемым условно-рефлекторным страхом, у крыс. ORG значительно уменьшал продолжительность такого замирания (Таблица 15).

Таблица 15 Зависимость ответа от дозы ORG в тесте замирания, индуцированного стрессом, вызываемым условно-рефлекторным страхом, на крысах Группа Доза (мг/кг) Количество крыс Продолжительность замирания (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/100 г 10 285,40±47,91   ORG 5 10 310,30±66,19 0,776   20 10 95,00±17,73* 0,004 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

6.2.3. Противотревожный эффект ORG в тесте приподнятого крестообразного лабиринта на мышах

ORG, введенный дважды за 24 ч и 5 ч перед проведением теста приподнятого крестообразного лабиринта, значительно увеличивал количество выходов в открытые рукава и общее время, проведенное в открытых рукавах (Таблицы 16 и 17). Этот результат указывает на значительный противотревожный эффект ORG.

Таблица 16 ORG (i.p.) увеличивал общее время, проведенное в открытых рукавах, у мышей Группа Доза (мг/кг) Количество мышей Общее время, проведенное в открытых рукавах (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 10 32,50±8,93     5 10 50,00±8,99 0,151 ORG 20 10 16,50±3,60 0,188   100 10 70,60±11,56* 0,003 Диазепам 2 10 46,90±7,19 0,236 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

Таблица 17 ORG (i.p.) увеличивал количество выходов в открытые рукава у мышей Группа Доза (мг/кг) Количество мышей Количество выходов в открытые рукава (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 10 3,50±0,87     5 10 4,50±0,58 0,279 ORG 20 10 1,80±0,79 0,069   100 10 5,90±0,57* 0,012 Диазепам 2 10 4,80±0,77 0,161 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

Эксперимент 7

Фармакологическое изучение антистрессового эффекта ORG

Стресс определяют в биологических системах как любое состояние, которое вносит серьезные нарушения в физиологический или психологический гомеостаз организма. Считается, что стресс является одним из основных факторов, ухудшающих многие заболевания или приводящих ко многим заболеваниям. Гиппокамп представляет собой (анатомическое) образование мозга, играющее важную роль в научении и памяти, а также в регуляции ответов на стресс. Стресс может приводить к нарушению гиппокампальной синаптической пластичности, нарушению научения и памяти. Концентрация кортикостерона в сыворотке является одним из наиболее общих показателей для оценки уровней стресса.

7.1. Экспериментальные методы

Использовали крыс массой 250-300 г из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. ORG получали, как описано в Примере 1. Использовали флуоксетин от Wuhan Yuancheng Technology Co. (Wuhan, China; № партии: 1004-0801002).

Измерение кортикостерона в сыворотке крови: радиоиммунологический анализ (RIA; DSL 80100; Texas) использовали для определения влияния ORG на концентрацию кортикостерона в сыворотке крови. У животных в не подвергаемой стрессу группе брали образцы крови посредством пункции сердца в условиях анестезии эфиром через 1 ч после инъекции ORG. В подвергаемой стрессу группе через 1 ч после инъекции ORG крыс подвергали в течение 30 мин стрессу с использованием подвешенной платформы и затем таким же образом отбирали образцы. Образцы крови выдерживали в течение 4 ч при комнатной температуре и затем центрифугировали в течение 15 мин (3000 об/мин). Супернатант (сыворотку) собирали и хранили при -20°С.

Метод регистрации долговременной потенциации (LTP) в гиппокампе: регистрировали возбуждающие постсинаптические потенциалы (EPSP) в гиппокампе с целью определения антистрессового эффекта ORG. Стресс ослабляет LTP в СА1-области гиппокампа, и этот эффект может быть снят антистрессовыми лекарственными средствами. Крыс подвергали стрессу посредством удара электрическим током по лапам следующим образом: 1 мА, 2 с, 5 раз с интервалами 2 мин. Готовили гиппокампальные срезы, их инкубировали в течение 1 ч при 34-36°С и затем хранили при комнатной температуре. ORG вводили в омывающую жидкость. EPSP, опосредованные NMDA- (N-метил-D-аспарт) и АМРА-рецепторами (рецептор глутамата, селективно связывающий альфа-аминометилизоксазол-пропионовую кислоту) в СА1-участке, регистрировали после того, как базовая линия оставалась стабильной в течение 20 мин. Затем для индуцирования LTP применяли высокочастотную стимуляцию (HFS, 100 Гц, 100 импульсов, интервал 20 с). EPSP регистрировали в течение 1 ч после HFS.

Анализ данных: данные выражают в виде среднего значения ±SEM, a LTP выражают в виде процента от средней амплитуды последних 10 мин по отношению к базовой линии. Использовали однофакторный ANOVA, затем LSD-тест с программным обеспечением SPSS 11. Устанавливали уровень значимости как Р<0,05.

7.2. Результаты

7.2.1. Антистрессовый эффект ORG (i.p.) в отношении индуцированного острым стрессом повышения уровня кортикостерона в сыворотке крови

Отбирали образцы крови посредством пункции сердца через 1 ч после i.p. инъекции ORG в контрольных группах или после подвергания стрессу в течение 30 мин. ORG значительно уменьшал уровень кортикостерона в сыворотке дозозависимым образом (Таблица 18).

Таблица 18 Зависимость уровня кортикостерона от дозы ORG (i.p.) Группы Доза (мг/кг) Количество животных Концентрация кортикостерона в сыворотке (нг/мл) (среднее значение ± SEM) Величина Р Без стресса + NS 0,1 мл/100 г 16 116,06±27,84   Без стресса + ORG 0,875 8 209,02±52,77 0,197 3,5 8 166,06±41,90 0,649 14 16 70,04±14,75 0,084 28 8 63,13±22,21 0,122 Без стресса + флуоксетин 15 16 167,20±31,35 0,559 30 8 178,14±38,77 0,490 Стресс + NS 0,1 мл/100 г 16 324,30±48,81   Стресс + ORG 0,875 8 349,85±61,75 0,706 3,5 8 263,63±49,14 0,372 14 16 237,63±32,45 0,120 28 8 137,41±26,84* 0,007 Стресс + флуоксетин 15 16 331,35±46,43 0,899 30 8 324,58±58,63 0,997 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

7.2.2. Восстановительный эффект ORG в отношении ослабленной стрессом гиппокампальной LTP

Готовили гиппокампальные срезы от крыс после воздействия на них стресса в виде удара электрическим током по лапам, протокол которого является общепризнанным для исследования ослабления гиппокампальной LTP. В срезах, инкубируемых с ORG в течение 1 ч, регистрировали базовые EPSP в течение 20 мин. ORG восстанавливал ослабленную стрессом LTP и даже значительно увеличивал LTP в дозе 5 мкмоль/л, демонстрируя дозозависимый эффект (Таблица 19).

Приведенные выше результаты показывают, что ORG обладает значительным антистрессовым эффектом и имеет важное клиническое значение в лечении депрессии со стрессовой этиологией.

Таблица 19 Зависимость доза-эффект в гиппокампальных срезах, инкубируемых с ORG, для восстановления ослабленной стрессом LTP Группы Доза Количество срезов Среднее по последним 10 мин (среднее значение ± SEM) Величина Р Контроль   9 134,52±10,71   Контроль + ORG 5 мкМ 11 122,93±3,75 0,453 HFS + NS 0,1 мл/10 г 11 113,22±6,77 0,234 HFS + ORG 50 нМ 9 128,99±7,30 0,732 HFS + ORG 5 мкМ 8 189,56±23,6* 0,002 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

Эксперимент 8

Фармакологическое изучение ORG и усиление научения и памяти

Водный лабиринт Морриса (MWM) широко используют в исследованиях гиппокамп-зависимых научения и памяти и их клеточных и молекулярных механизмов. Общепринято, что MWM является эффективным методом фармакологической оценки научения и памяти. Латентный период реакции избегания (escape latency), стратегию и траекторию движения животных регистрируют автоматически и анализируют с целью исследования их пространственного обучения (spatial learning) и пространственной памяти. После того, как животные научаются избеганию, утопленную платформу удаляют для тестирования способности запоминания целевого квадранта. Проведение более продолжительного периода времени в правильном квадранте указывает на лучшую память.

8.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. Количества животных в каждой группе показаны в Таблицах 20 и 21. ORG получали, как описано в Примере 1. Животных разделяли на группы, которым вводили лекарственное средство - флуоксетин или ORG в разных дозах, и на контрольную группу, получающую носитель. Группы с введением лекарственного средства получали 1,75 мг/кг или 3,5 мг/кг ORG или 15 мг/кг флуоксетина. Животные получали одну i.p. инъекцию лекарственного средства или носителя либо через 30 мин после ежесуточного обучения, либо за 30 мин до тестирования способности запоминания на 8-е сутки.

Водный лабиринт Морриса: MWM проводили в круглом бассейне (100 см в диаметре и глубиной 36 см) с утопленной платформой (10 см × 10 см), которая находилась ниже поверхности воды приблизительно на 1 см. Вокруг бассейна располагали желтые занавески с сигнальными знаками различной формы, развешенными в каждом квадранте. Время, потраченное на обнаружение утопленной платформы, и траекторию движения мыши регистрировали с помощью компьютера. Начиная с 1-х суток и заканчивая 7-ми сутками мышей помещали в бассейн для обнаружения закрепленной утопленной платформы. На 8-е сутки платформу удаляли и подсчитывали время, которое мышь проводила в целевом квадранте за 1 мин свободного плавания.

Анализ данных: результаты теста выражали в виде среднего значения ± SEM. Использовали однофакторный ANOVA, затем LSD-тест с программным обеспечением SPSS 11. Устанавливали уровень значимости как Р<0,05.

8.2. Результаты

8.2.1. Эффект ORG (i.p.) сразу после обучения в тесте MWM

В том случае, когда ORG предоставляли после ежесуточного обучения, воспроизведение пространственного расположения по памяти (время, которое животные проводят в целевом квадранте) значительно усиливалось под действием консолидации памяти (Таблица 20).

Таблица 20 Пространственная память повышалась у мышей с ежесуточным введением ORG после обучения Группа Доза (мг/кг) Количество мышей Время, проведенное в правильном квадранте (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 10 27,10±2,79   ORG 1,75 10 28,18±1,70 0,74 ORG 3,5 10 34,24±2,01* 0,03 Флуоксетин 15 9 32,61±2,20 0,11 *P<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

8.2.2. Эффект ORG (i.p.) перед воспроизведением в тесте MWM

Обучение завершали через 7 суток. Тестирование способности к воспроизведению проводили на 8-е сутки. В том случае, когда ORG вводили за 30 мин до воспроизведения, способность к воспроизведению пространственного расположения по памяти значительно повышалась (Таблица 21).

Таблица 21 Пространственная память повышалась у мышей, которым вводили ORG за 30 мин до воспроизведения Группа Доза (мг/кг) Количество мышей Время, проведенное в правильном квадранте (с) (среднее значение ± SEM) Величина Р NS 0,1 мл/10 г 10 27,95±2,19   ORG 1,75 10 29,38±2,16 0,65 ORG 3,5 10 35,52±2,43* 0,02 Флуоксетин 15 9 29,44±2,14 0,65 *Р<0,05 (однофакторный ANOVA с последующим LSD-тестом).

Эксперимент 9

Тест на токсичность ORG

9.1. Тест на острую токсичность ORG на мышах

9.1.1. Экспериментальные методы

Использовали мышей Kunming (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. В начале экспериментов их возраст составлял 3-4 недели, а масса 25-30 г. ORG получали, как описано в Примере 1. ORG (1750 мг) растворяли в 10 мл NS, получая концентрацию 175 мг/мл. Мышей разделяли на две группы: группа для оценки ORG получала ORG, а контрольную группу обрабатывали носителем (NS). В каждой группе ORG и NS давали перорально в количестве 0,1 мл/10 г.

9.1.2. Результаты

В том случае, когда ORG вводили мышам в дозе 1750 мг/кг в тесте на острую токсичность, наблюдение за внешним видом, поведением, ментальным статусом, аппетитом, волосяным покровом, цветом и дыханием животных проводили в течение 14 суток, и никаких отклонений от нормы обнаружено не было. Все мыши выжили в эксперименте и давали обычное увеличение массы. Никакой значительной разницы между этими двумя группами не было. Всех мышей умерщвляли на 14-е сутки и исследовали сердце, печень, селезенку, легкое, почку, поджелудочную железу, яичник, яичко, тонкий кишечник и другие висцеральные органы посредством патологоанатомического иссечения, и они также не показали никаких очевидных аномалий.

9.2. Тест на подострую токсичность ORG на крысах

9.2.1. Экспериментальные методы

Использовали крыс (номер сертификата: A4CXK(Chuan)2003-16) из Института экспериментальных животных, Государственной больницы провинции Сычуань. Их масса составляла 250-300 г. ORG получали, как описано в Примере 1.

9.2.2. Результаты

ORG (1750 мг/кг), доза которого в 7955 раз превышает ED₅₀ в FST на мышах и в 2397 раз ED₅₀ в TST на мышах, вводили перорально один раз в сутки в течение 14 последующих суток. Наблюдение за внешним видом, поведением, ментальным статусом, аппетитом, волосяным покровом, цветом и дыханием животных проводили в течение 14 суток, и никаких отклонений от нормы обнаружено не было. Все крысы выжили в эксперименте и давали обычное увеличение массы. Никакой значительной разницы между этими двумя группами не было. Всех крыс умерщвляли на 14-е сутки и исследовали сердце, печень, селезенку, легкое, почку, поджелудочную железу, яичник, яичко, тонкий кишечник и другие висцеральные органы посредством патологоанатомического иссечения, и изображения тканевых срезов не показали никаких очевидных аномалий.

Краткое фармакологическое описание 5-метил-1,3-бензолдиола и его производных

Исследовали зависимости антидепрессантных эффектов ORG и его производных от дозы и от времени, используя модели FST, TST, DD, SD и CMS. Результаты показывают, что OR, ORG и его производные демонстрируют активности, полезные для лечения и предупреждения депрессии и симптомов, предполагающих депрессию: расстройств циркадного ритма, расстройств сна и хронического стресса. Изучения антидепрессантного механизма показали, что OR, ORG и их производные исправляют нарушение гиппокампальной LTP, улучшают гиппокамп-зависимые научение и память и лечат и предотвращают такие родственные депрессии факторы, как тревога и острый стресс. Механизм гиппокампальной LTP связан главным образом с NMDA- и АМРА-рецепторами и их молекулярными и клеточными путями. В заключение необходимо отметить, что OR, ORG и их производные могут воздействовать на эти мишени в качестве регуляторов и вызывать эффекты лечения и предупреждения депрессии посредством восстановления гиппокампальной LTP.

Поскольку нейроны взаимодействуют главным образом посредством химических синапсов и, как полагают, память "хранится" в этих синапсах, то LTP считается одним из главных клеточных механизмов, лежащих в основе научения и памяти. Таким образом, OR, ORG и их производные также могут быть применены для лечения и предупреждения других расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, детский ADHD (синдром дефицита внимания и гиперактивности), аутизм и шизофрения. Поскольку более 90% всех заболеваний могут быть индуцированы или вызваны стрессом и гиппокампальные принципы действия по регуляции стресса вовлекают синаптическую пластичность, то OR, ORG и их производные могут быть полезны в лечении, предупреждении и реабилитации многих заболеваний в клинике, например, у наркоманов, которые испытывают экстремальный стресс в период отмены, и у пациентов с диагнозом рак или сердечно-сосудистое заболевание, которые подвержены чрезмерному стрессу или тревоге.

В сочетании с результатами предшествующих экспериментов по токсичности OR, ORG и их производные демонстрируют новые применения в лечении и предупреждении депрессии и этиологических причин депрессии, характеризуясь высокой эффективностью и низкой токсичностью. Другими применениями OR, ORG и их производных являются применения в лечении и предупреждении симптомов, предполагающих депрессию, таких как острый стресс и тревога. Механизмы, вовлеченные в антидепрессантный эффект OR, ORG и их производных, лежат в регуляции сывороточных кортикостероидов, гиппокампальной синаптической пластичности, включая NMDA- и АМРА-рецепторы и их внутриклеточные сигнальные пути, а также научения и памяти.

Следовательно, терапевтическими применениями и полезными эффектами OR, ORG и их производных в настоящем изобретении являются следующие: (1) терапевтическое влияние на депрессию; (2) терапевтическое влияние на причины депрессии; (3) терапевтическое влияние на симптомы депрессии или подобные симптомы других заболеваний; (4) их возможные применения не предназначены для ограничения и их не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающиеся лечением и предупреждением депрессии, и они также могут быть полезны для других заболеваний, вовлекающих стресс, тревогу и функциональное когнитивное нарушение.

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается применения 3,5-дигидрокситолуола или его производных в изготовлении лекарств или функциональных продуктов питания для лечения или предупреждения депрессии и антидепрессанта, представляющего собой 3,5-дигидрокситолуол или его производные, обладающего более сильной антидепрессантной активностью по сравнению с флуоксетином или имипрамином. 3 н. и 36 з.п. ф-лы, 21 табл., 9 пр.

1. Применение 5-метил-1,3-бенздиола или его производных, представленных формулой I, в изготовлении лекарств, дополнительно содержащих фармацевтически приемлемые эксципиенты, или функциональных продуктов питания, дополнительно содержащих приемлемые пищевые добавки, полезных для применения в лечении или предупреждения депрессии:

где
R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил;
R² представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

2. Применение по п.1, где соединения представлены формулой II:

где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

3. Применение по п.2, где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил.

4. Применение по п.3, где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил.

5. Применение по п.1, где соединения представлены формулой III:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

6. Применение по п.5, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил.

7. Применение по п.6, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил или рамнопиранозил.

8. Применение по п.1, где соединения представлены формулой IV:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

9. Применение по п.8, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

10. Применение по п.8, где R² представляет собой 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил или ацетил: 1,3-O-диацетилорцинол или 3-O-ацетил-орцинол-1-O-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозид.

11. Применение по любому из пп.1-10 для лечения или предотвращения депрессии, где прямо регулируется долговременная гиппокампальная потенциация (LTP) и предотвращается индуцированный стрессом физиологический подъем уровня глюкокортикоидов.

12. Применение по любому из пп.1-10, где термин "депрессия" включает следующие подтипы:
(1) депрессию и расстройства настроения, такие как депрессия, маниакальная депрессия, смешанная депрессия и маниакальное расстройство или гипомания; или (2) депрессивные расстройства, такие как депрессивное расстройство и дистимия; или (3) другие аффективные расстройства, такие как аффективные расстройства, вызываемые психическими заболеваниями или расстройствами разных подтипов, проявляющих признаки депрессивных расстройств, и аффективные расстройства, вызываемые приемом веществ (например, вызывающих зависимость лекарственных средств) или терапией (такой как хирургия, лучевая терапия или химиотерапия); или (4) биполярное расстройство или биполярное аффективное расстройство, включающее два или более эпизодов депрессии и гипомании и чередующиеся эпизоды мании и депрессии.

13. Применение по любому из пп.1-10, где симптомы депрессии или симптомы, предполагающие депрессию, относятся к расстройствам циркадного ритма, расстройствам сна, хроническому стрессу, тревоге, острому индуцированному стрессом нарушению или функциональному когнитивному нарушению или расстройству.

14. Применение по любому из пп.1-10 для лечения или предупреждения вышеупомянутых симптомов депрессии или симптомов, предполагающих депрессию, где функциональные продукты питания включают повседневные продукты питания, напитки или питье.

15. Антидепрессант, представляющий собой 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные, представленные формулой I, или фармацевтические композиции, содержащие такие активные компоненты (5-метил-1,3-бензолдиол или его производные) в эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами:

где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил, пропионил, бензоил, циннамоил, сукцинил, метил, этил, пропил, бутил или бензил;
R² представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

16. Антидепрессант по п.15, где 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные представлены формулой II:

где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-0-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

17. Антидепрессант по п.16, где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил.

18. Антидепрессант по п.17, где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил или β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил.

19. Антидепрессант по п.15, где 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные представлены формулой III:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-В-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

20. Антидепрессант по п.19, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил.

21. Антидепрессант по п.20, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил или рамнопиранозил.

22. Антидепрессант по п.15, где 5-метил-1,3-бензолдиол или его производные представлены формулой IV:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

23. Антидепрессант по п.22, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

24. Антидепрессант по п.23, где R² представляет собой 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил или ацетил: 1,3-O-диацетилорцинол или 3-O-ацетил-орцинол-1-O-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозид.

25. Антидепрессант по любому из пп.15-24, где эффективная дозировка активных компонентов (5-метил-1,3-бензолдиола или производных) для лечения или предупреждения депрессии для взрослых составляет от 0,1 мг/сутки до 12 г/сутки, и оптимальная дозировка для взрослых составляет 50-200 мг/сутки.

26. Антидепрессант по п.25, где эффективная дозировка активных компонентов (5-метил-1,3-бензолдиола или производных) для лечения или предупреждения депрессии для взрослых составляет 50-200 мг/сутки.

27. Применение 5-метил-1,3-бенздиола или его производных, представленных формулой I:

где
R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил;
R² представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил для лечения или предупреждения депрессии.

28. Применение по п.27, где соединения представлены формулой II:

где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

29. Применение по п.28, где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил.

30. Применение по п.29, где R¹ представляет собой водород, β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил.

31. Применение по п.27, где соединения представлены формулой III:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

32. Применение по п.31, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил или арабинозил.

33. Применение по п.32, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил или рамнопиранозил.

34. Применение по п.27, где соединения представлены формулой IV:

где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

35. Применение по п.34, где R² представляет собой β-D-глюкопиранозил, β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил, 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил, маннозил, аллозил, галактозил, рамнопиранозил, фукозил, ксилозил, арабинозил, ацетил или пропионил.

36. Применение по п.34, где R² представляет собой 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-β-D-глюкопиранозил или ацетил: 1,3-O-диацетилорцинол или 3-O-ацетил-орцинол-1-O-(2,3,4,6-тетраацетил)-β-D-глюкопиранозид.

37. Применение по любому из пп.27-36 для лечения или предотвращения депрессии, где прямо регулируется долговременная гиппокампальная потенциация (LTP) и предотвращается индуцированный стрессом физиологический подъем уровня глюкокортикоидов.

38. Применение по любому из пп.27-36, где термин "депрессия" включает следующие подтипы:
(1) депрессию и расстройства настроения, такие как депрессия, маниакальная депрессия, смешанная депрессия и маниакальное расстройство или гипомания; или (2) депрессивные расстройства, такие как депрессивное расстройство и дистимия; или (3) другие аффективные расстройства, такие как аффективные расстройства, вызываемые психическими заболеваниями или расстройствами разных подтипов, проявляющих признаки депрессивных расстройств, и аффективные расстройства, вызываемые приемом веществ (например, вызывающих зависимость лекарственных средств) или терапией (такой как хирургия, лучевая терапия или химиотерапия); или (4) биполярное расстройство или биполярное аффективное расстройство, включающее два или более эпизодов депрессии и гипомании и чередующиеся эпизоды мании и депрессии.

39. Применение по любому из пп.27-36, где симптомы депрессии или симптомы, предполагающие депрессию, относятся к расстройствам циркадного ритма, расстройствам сна, хроническому стрессу, тревоге, острому индуцированному стрессом нарушению или функциональному когнитивному нарушению или расстройству.