Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 825 839

(13)

(51)

МПК

C07K16/28(2006-01-01)

A61K39/00(2006-01-01)

A61K39/395(2006-01-01)

A61P35/00(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2020133629, 2019-05-06

(24)

Дата начала отсчета патента

2019-05-06

(22)

дата подачи заявки

2019-05-06

(45)

опубликовано

2024-09-02

(72)

авторы

Мандельбойм, ОферРехес, АдиЙонич, СтипанЦукерман, Пинхас

(73)

патентообладатели

Йиссум Рисерч Девелопмент Компани Оф Зе Хибрю Юниверсити Оф Иерусалим Лтд.Нектин Терапьютикс Лтд.

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

WO 2017042210 Al, 16.03.2017CAMPBELL DEAN 0 ET AL.: "Preclinical Evaluation of an Anti-Nectin-4 ImmunoPET Reagent in Tumor-Bearing Mice and Biodistribution Studies in Cynomolgus Monkeys", MOLECULAR IMAGING & BIOLOGY, ELSEVIER, BOSTON, volPMCHALLITA-EID ET AL.: "Enfortumab Vedotin Antibody-Drug

АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К НЕКТИНУ-4 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/00 A61K39/395 A61P35/00

Описание патента на изобретение RU2825839C2

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение принадлежит к области иммунотерапии и относится к антителам и их фрагментам, связывающимся с человеческим белком нектин-4, к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим эти антитела, и к клеткам, продуцирующим эти антитела. Изобретение также относится к терапевтическим и диагностическим композициям, содержащим эти антитела, и к способам лечения и диагностики заболеваний, в особенности рака, с применением этих антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунотерапия представляет собой одно из наиболее многообещающих достижений в лечении рака за последнее десятилетие. Иммунотерапия рака используется для создания и усиления противоопухолевого иммунного ответа, например, путем лечения антителами, специфичными к антигенам на опухолевых клетках, слияниями антигенпрезентирующих клеток с опухолевыми клетками или путем активации противоопухолевых Т-клеток. Способность рекрутировать иммунные клетки (например, Т-клетки) против опухолевых клеток у пациента обеспечивает терапевтический метод борьбы с различными видами рака и метастазами, которые до сих пор считались неизлечимыми.

Опосредованный Т-клетками иммунный ответ включает несколько последовательных этапов, регулируемых балансом между костимулирующими и коингибирующими сигналами, которые контролируют величину иммунного ответа. Ингибирующие сигналы, называемые иммунными контрольными точками, имеют решающее значение для поддержания аутотолерантности и для ограничения опосредованного иммунной системой сопутствующего повреждения тканей. Эти сигналы меняются по мере устранения, ухудшения или сохранения инфекции или провокации иммунной системы, и эти изменения влияют на иммунный ответ и изменяют его форму.

Экспрессия белков иммунных контрольных точек может регулироваться опухолями. Например, активация лиганда белка программируемой смерти-1 (PD-L1) на поверхности раковых клеток позволяет им уклоняться от иммунной системы хозяина, ингибируя Т-клетки, которые в противном случае могли бы атаковать эти опухолевые клетки, посредством связывания с PD-1. Таким образом, иммунные контрольные точки представляют собой значительные препятствия для активации функционального клеточного иммунитета против рака. Соответственно, антагонистические антитела, специфичные к ингибирующим лигандам на иммунных клетках, считаются жизнеспособными противораковыми агентами, и они применяются для лечения рака (например, ниволумаб и пембролизумаб). Другим примером молекулы иммунной контрольной точки является «Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM» (TIGIT). TIGIT представляет собой ко-ингибирующую молекулу, экспрессируемую на различных иммунных клетках, включая Т-клетки и естественные киллеры (NK-клетки). TIGIT с высокой аффинностью связывается с рецептором полиовируса (PVR, CD155). Моноклональные антитела (mAb), специфичные к TIGIT, раскрыты, например, в WO 2016/028656 и WO 2017/037707.

Рецептор полиовируса (PVR) представляет собой трансмембранный гликопротеин, участвующий в опосредовании адгезии клеток к молекулам внеклеточного матрикса. PVR является известным опухолевым антигеном и мишенью для терапевтических вмешательств. Ожидается, что блокирование PVR на опухолевых клетках снизит жизнеспособность опухолевых клеток. PVR также играет ключевую роль в ангиогенезе и метастазировании. В нескольких патентных заявках, включая заявку на патент США № 20070041985, заявку на патент США № 20090215175 и WO 2017149538, раскрыты молекулы и антитела, которые специфически связываются с PVR, и их применение против рака.

Молекула клеточной адгезии нектин-4 (нектин-4), также называемая белок 4, связанный с рецептором полиовируса (PVRL4), представляет собой трансмембранный белок типа I и член семейства нектинов родственных иммуноглобулиноподобных молекул адгезии. Нектин-4 является опухолеассоциированным маркером многих опухолей, включая рак легкого, молочной железы, ободочной кишки и яичника.

В источнике Chailta-Eid at al. 2016 (Cancer Res. 2016;76:3003–13) раскрыт конъюгат антитела к нектину-4 (энфортумаба) с лекарственным средством, показавший себя как высокоэффективный терапевтический агент в нескольких доклинических моделях рака. Антитело, конъюгированное с ингибитором микротрубочек ведотином, связывает нектин-4 человека, а также нектин-4 крысы и обезьяны, и ингибирует рост нескольких линий клеток и ксенотрансплантатов, экспрессирующих нектин-4.

Несмотря на успехи, достигнутые в иммунотерапии рака, остается неудовлетворенная потребность в дополнительных подходах, а также в более эффективных и специфичных средствах и комбинациях лекарственных средств, чтобы усилить атаку клеток иммунной системы на опухолевые клетки. Один из таких подходов включает ингибирование связывания нектина-4 с TIGIT с помощью специфических моноклональных антител.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам и их фрагментам, которые связываются с белком нектин-4 человека, к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим эти антитела, и к клеткам, продуцирующим эти антитела. Настоящее изобретение частично основано на открытии того факта, что нектин-4, ранее известный как рецептор вируса кори и опухолевый антиген, является лигандом для иммуноингибирующей молекулы TIGIT и поэтому был впервые предложен в качестве мишени для ингибирования супрессивного действия TIGIT на противораковый иммунитет. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно предложены химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие сайт связывания с нектином-4.

Настоящее изобретение относится к высокоэффективным моноклональным антителам (mAb), специфичным к нектину-4 человека, которые не только блокируют взаимодействие между нектином-4 и ингибирующим рецептором TIGIT, но также оказывают прямое действие на клетки-мишени, экспрессирующие этот рецептор. Эти антитела, константа связывания которых с нектином-4 находится в субнаномолярном диапазоне, обращают ингибирование TIGIT иммунной системы и непосредственно усиливают элиминацию опухолевых клеток, не будучи при этом конъюгированными с каким-либо токсином или противоопухолевым агентом. Следовательно, антитела по настоящему изобретению пригодны для ингибирования взаимодействия между нектином-4 на клетках-мишенях и TIGIT на иммунных клетках, например, при иммунотерапии рака. Более того, некоторые интактные антитела, описанные в настоящем документе, индуцируют активность ADCC (антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность). Нектин-4 специфически сверхэкспрессируется на опухолевых клетках. Индукция активности ADCC наряду с высокой аффинностью антител согласно настоящему изобретению к нектину-4 и их ADCC активностью делает их идеальными кандидатами для иммунотерапии.

Настоящее изобретение относится к антителам и их фрагментам, распознающим белок нектин-4, предотвращающим его связывание с белком TIGIT и ингибирующим супрессивную активность в отношении лимфоцитов, таких как естественные киллеры (NK) и Т-клетки. Раскрытые в настоящем документе антитела к нектину-4 способны связываться с нектином-4, присутствующим на клетках-мишенях, таких как раковые клетки. Антитела и фрагмент согласно настоящему изобретению характеризуются наличием уникальных наборов последовательностей определяющих комплементарность областей (CDR), высокой аффинностью и высокой специфичностью к нектину-4 человека, и пригодны для иммунотерапии рака для борьбы с уклонением опухоли от иммунной системы в качестве самостоятельной терапии и в сочетании с другими противораковыми агентами. Антитела также пригодны для предупреждения вирусных инфекций, в частности, предупреждения кори.

Раскрыто, что раскрытые в настоящем документе высокоаффинные антитела к нектину-4 блокируют взаимодействие TIGIT-нектин-4 и восстанавливают активность T- и NK-клеток.

Некоторые из моноклональных антител согласно настоящему изобретению также способны блокировать взаимодействие между нектином-4 и нектином-1, что указывает на их способность препятствовать инвазионной способности опухолей, экспрессирующих нектин-4. Кроме того, mAb к нектину-4 были способны индуцировать активацию NK-клеток в большинстве клеток-мишеней. MAb к нектину-4 согласно изобретению обладают преимуществом, состоящим в том, что они оказывают прямое действие на раковые клетки-мишени, вызывая их уничтожение без необходимости в NK-клетках и/или токсине. Кроме того, раскрыто, что антитела к нектину-4 согласно изобретению не оказывают блокирующего действия на передачу сигналов костимулирующими рецепторами, такими как DNAM1, поэтому ожидается, что они не будут оказывать отрицательного воздействия на другие иммунные индуцирующие сигналы.

Интересно, что, несмотря на высокое сходство последовательностей между последовательностями нектина-4 человека и грызунов, некоторые из антител согласно настоящему изобретению являются высокоспецифичными к нектину-4 человека и не связывают нектин-4 грызунов.

Некоторые из mAb к нектину-4, описанных в настоящем документе, были способны снижать жизнеспособность опухолевых клеток иммуно-независимым образом за счет блокирования нектина-4 на опухолевых клетках. В некоторых вариантах осуществления антитела к нектину-4, описанные в настоящем документе, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток посредством иммуно-независимого вмешательства в связывание с нектином-1 на опухолевых клетках, не будучи при этом связанными с какой-либо токсической молекулой.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложено выделенное моноклональное антитело (mAb) или его фрагмент, содержащий по меньшей мере антигенсвязывающую часть, которое специфически связывается с нектином-4 человека и ингибирует его связывание с TIGIT.

Настоящее изобретение также относится к mAb или его фрагменту, способному ингибировать связывание нектина-4 человека с TIGIT человека, для применения для лечения рака вместе с Т-клеточными лимфоцитами и/или естественными киллерами (NK).

Согласно некоторым вариантам осуществления mAb не конъюгировано с каким-либо токсином или противоопухолевым агентом.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело или фрагмент антитела содержит набор из шести последовательностей определяющих комплементарность областей (CDR), выбранных из группы, состоящей из:

i. трех CDR вариабельной области тяжелой цепи (HC), содержащей SEQ ID NO: 22, и трех CDR вариабельной области легкой цепи (LC), содержащей SEQ ID NO: 24, или их аналога или производного, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента;

ii. трех CDR вариабельной области HC, содержащей SEQ ID NO: 2, и трех CDR вариабельной области LC, содержащей SEQ ID NO: 4, или их аналога или производного, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента; и

iii. трех CDR вариабельной области HC, содержащей SEQ ID NO: 6, и трех CDR вариабельной области LC, содержащей SEQ ID NO: 8, или их аналога или производного, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело или фрагмент антитела содержит набор из шести последовательностей CDR, выбранный из группы, состоящей из:

iv. трех CDR вариабельной области HC, содержащей SEQ ID NO: 39, и трех CDR вариабельной области LC, содержащей SEQ ID NO: 40, или их аналога или производного, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента;

v. трех CDR вариабельной области HC, содержащей SEQ ID NO: 35, и трех CDR вариабельной области LC, содержащей SEQ ID NO: 36, или их аналога или производного, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента; и

vi. трех CDR вариабельной области HC, содержащей SEQ ID NO: 37, и трех CDR вариабельной области LC, содержащей SEQ ID NO: 38, или их аналога или производного, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью антитела или фрагмента.

Существует несколько методов определения последовательностей CDR отдельно взятой молекулы антитела, известных в данной области техники, однако не существует стандартного однозначного метода. Определение последовательностей CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела может быть выполнено любым методом, известным в данной области техники, включая, не ограничиваясь перечисленным, методы, известные как KABAT, Chothia и IMGT. Выбранный набор CDR может включать последовательности, идентифицированные более чем одним методом, а именно, некоторые последовательности CDR могут быть определены, например, с использованием KABAT, а некоторые - с использованием IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательности CDR вариабельных областей mAb определены с использованием метода IMGT.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит последовательности CDR моноклонального антитела, обозначенного hNec4.11 (или Nectin4.11, или клон 11), а именно, три последовательности CDR, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 39, и три последовательности CDR, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 40.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность SYYIH (SEQ ID NO: 25). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность WIYPGNVNTKYNERFKG (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность SNPYVMDY (SEQ ID NO: 27).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность SYYIH (SEQ ID NO: 25); (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность WIYPGNVNTKYNERFKG (SEQ ID NO: 26); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность SNPYVMDY (SEQ ID NO: 27).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVNNDVA (SEQ ID NO: 28). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность YASNRFT (SEQ ID NO: 29). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQAYRSPYT (SEQ ID NO: 30).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит: (i) CDR1 LC, содержащую последовательность KASQSVNNDVA (SEQ ID NO: 28); (ii) CDR2 LC, содержащую последовательность YASNRFT (SEQ ID NO: 29); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность QQAYRSPYT (SEQ ID NO: 30).

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность SYYIH (SEQ ID NO: 25), CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность WIYPGNVNTKYNERFKG (SEQ ID NO: 26), CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность SNPYVMDY (SEQ ID NO: 27), CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVNNDVA (SEQ ID NO: 28), CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность YASNRFT (SEQ ID NO: 29), и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQAYRSPYT (SEQ ID NO: 30), или их аналоги, содержащие не более 5% аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в последовательности гипервариабельной области (HVR).

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит набор из шести последовательностей CDR, состоящий из:

i. CDR1 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25;

ii. CDR2 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26;

iii. CDR3 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27;

iv. CDR1 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28;

v. CDR2 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29; и

vi. CDR3 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 39, или ее аналог или производное, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 40, или ее аналог или производное, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью вариабельной области легкой цепи.

Согласно конкретному варианту осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, или их аналог, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью легкой и/или тяжелой цепи.

Изобретение также включает антитело или фрагмент антитела, способные с высокой аффинностью связываться с эпитопом в белке нектин-4 человека, с которым связывается моноклональное антитело hNec4.11.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит последовательности CDR моноклонального антитела, обозначенного hNec4.01 (или Nectin4.01), а именно, три последовательности CDR, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 35, и три последовательности CDR, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 36.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность AYNIH (SEQ ID NO: 9). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность YIYPNNGGSGYNQKFMN (SEQ ID NO: 10). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность FDYDEAWFIY (SEQ ID NO: 11).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность AYNIH (SEQ ID NO: 9); (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность YIYPNNGGSGYNQKFMN (SEQ ID NO: 10); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность FDYDEAWFIY (SEQ ID NO: 11).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 12). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность DTSKLAS (SEQ ID NO: 13). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность FQGSGSPYT (SEQ ID NO: 14).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит: (i) CDR1 LC, содержащую последовательность SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 12); (ii) CDR2 LC, содержащую последовательность DTSKLAS (SEQ ID NO: 13); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность FQGSGSPYT (SEQ ID NO: 14).

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность AYNIH (SEQ ID NO: 9), CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность YIYPNNGGSGYNQKFMN (SEQ ID NO: 10), CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность FDYDEAWFIY (SEQ ID NO: 11), CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 12), CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность DTSKLAS (SEQ ID NO: 13), и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность FQGSGSPYT (SEQ ID NO: 14), или их аналоги, содержащие не более 5% аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в последовательности гипервариабельной области (HVR).

i. CDR1 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9;

ii. CDR2 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10;

iii. CDR3 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11;

iv. CDR1 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12;

v. CDR2 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13; и

vi. CDR3 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 35, или ее аналог или производное, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 36, или ее аналог, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью вариабельной области легкой цепи.

Согласно конкретному варианту осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, или их аналог, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью легкой и/или тяжелой цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит последовательности CDR моноклонального антитела, обозначенного hNec4.05 (или Nectin4.05), а именно, три последовательности CDR, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 37, и три последовательности CDR, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 38.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TYYIH (SEQ ID NO: 15). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность WIYPGNVNTKNNEKFKV (SEQ ID NO: 16). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность SNPYVMDY (SEQ ID NO: 17).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит: (i) CDR1 HC, содержащую последовательность TYYIH (SEQ ID NO: 15); (ii) CDR2 HC, содержащую последовательность WIYPGNVNTKNNEKFKV (SEQ ID NO: 16); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность SNPYVMDY (SEQ ID NO: 17).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 18). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 19). Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQDYSSPYT (SEQ ID NO: 20).

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит: (i) CDR1 LC, содержащую последовательность KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 18); (ii) CDR2 LC, содержащую последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 19); и (iii) CDR3 HC, содержащую последовательность QQDYSSPYT (SEQ ID NO: 20).

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность TYYIH (SEQ ID NO: 15), CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность WIYPGNVNTKNNEKFKV (SEQ ID NO: 16), CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность SNPYVMDY (SEQ ID NO: 17), CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 18), CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 19), и CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность QQDYSSPYT (SEQ ID NO: 20), или их аналоги, содержащие не более 5% аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в последовательности гипервариабельной области (HVR).

i. CDR1 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15;

ii. CDR2 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16;

iii. CDR3 тяжелой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17;

iv. CDR1 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18;

v. CDR2 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19; и

vi. CDR3 легкой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 37, или ее аналог или производное, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 38, или ее аналог, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью вариабельной области легкой цепи.

Согласно конкретному варианту осуществления выделенное моноклональное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, или их аналог, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с указанной последовательностью легкой и/или тяжелой цепи.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело или его фрагмент распознает нектин-4 человека с аффинностью по меньшей мере 10^-8M. Согласно другим вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела связывает нектин-4 человека с аффинностью, равной 10^-8 M, 5x10^-9 M, 10^-9 M, 5x10^-10 M, 10^-10 M, 5x10^-11 M или даже выше. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела связывается с нектином-4 человека с аффинностью от 10^-9 M до 10^-10 M. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Аналоги и производные выделенных mAb и описанные выше фрагменты также входят в объем изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления аналог антитела или фрагмента антитела обладают по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с гипервариабельной областью последовательности референсного антитела.

Согласно некоторым вариантам осуществления аналог или производное выделенного антитела или его фрагмента обладает по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с вариабельной областью последовательности референсного антитела. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела согласно изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37, или аналог, обладающий по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38, или аналог, обладающий по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанной последовательностью.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где: (i) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 39, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 40; (ii) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 35, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 36; или (iii) тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 37, а легкая цепь содержит SEQ ID NO: 38. Также включены аналоги антител или фрагментов, обладающие по меньшей мере 95% сходством последовательности с указанными тяжелыми или легкими цепями.

Согласно некоторым вариантам осуществления аналог обладает по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с описанными выше вариабельными областями легкой или тяжелой цепи антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления аналог содержит не более одной аминокислотной замены, делеции или добавления по сравнению с одной или более последовательностями CDR гипервариабельной области, а именно, любой из последовательностей CDR, представленных в SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления аминокислотная замена представляет собой консервативную замену.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела содержит гипервариабельную область (HVR), имеющую области легкой и тяжелой цепи, определенные выше, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были заменены, подвергнуты делеции и/или добавлены. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела содержит HVR, имеющую области легкой и тяжелой цепи, определенные выше, в которых была заменена одна аминокислота. Согласно конкретным вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела содержит CDR, как определено выше, в которой была заменена одна аминокислота.

Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное моноклональное антитело или фрагмент антитела содержит набор CDR, выбранный из группы, состоящей из:

i. набора из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой SYYIH (SEQ ID NO: 25); CDR2 HC представляет собой WIYPGNVNTKYNERFKG (SEQ ID NO: 26); CDR3 HC представляет собой SNPYVMDY (SEQ ID NO: 27); CDR1 LC представляет собой KASQSVNNDVA (SEQ ID NO: 28); CDR2 LC представляет собой YASNRFT (SEQ ID NO: 29); и CDR3 LC представляет собой QQAYRSPYT (SEQ ID NO: 30);

ii. набора из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой AYNIH (SEQ ID NO: 9); CDR2 HC представляет собой YIYPNNGGSGYNQKFMN (SEQ ID NO: 10); CDR3 HC представляет собой FDYDEAWFIY (SEQ ID NO: 11); CDR1 LC представляет собой SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 12); CDR2 LC представляет собой DTSKLAS (SEQ ID NO: 13); и CDR3 LC представляет собой FQGSGSPYT (SEQ ID NO: 14); и

iii. набора из шести CDR, где последовательность CDR1 HC представляет собой TYYIH (SEQ ID NO: 15); CDR2 HC представляет собой WIYPGNVNTKNNEKFKV (SEQ ID NO: 16); CDR3 HC представляет собой SNPYVMDY (SEQ ID NO: 17); CDR1 LC представляет собой KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 18); CDR2 LC представляет собой YASNRYT (SEQ ID NO: 19); и CDR3 LC представляет собой QQDYSSPYT (SEQ ID NO: 20).

Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам и их связывающим фрагментам, содержащим тяжелую цепь и легкую цепь, где указанные цепи содержат набор последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из:

i. набора, содержащего SEQ ID NO: 39 и 40;

ii. набора, содержащего SEQ ID NO: 35 и 36; и

iii. набора, содержащего SEQ ID NO: 37 и 38.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела способны ингибировать связывание нектина-4 человека с TIGIT, экспрессируемым на Т-клетках или NK-клетках.

Согласно конкретному варианту осуществления mAb выбрано из группы, состоящей из химерного антитела и фрагмента антитела, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающую часть антитела. Согласно конкретным вариантам осуществления антитело представляет собой химерное антитело. Согласно другим вариантам осуществления химерное антитело содержит константную область иммуноглобулина человека. Согласно конкретному варианту осуществления фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fd', Fv, dAb, выделенной области CDR, одноцепочечной вариабельной области (scFV), одноцепочечного антитела (scab), «диател» и «линейных антител». Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Одноцепочечная вариабельная область (scFV), содержащая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антител, описанных в настоящем документе, также предложена в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления между вариабельными областями имеется шарнирная область.

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность scFV представлена в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 или их аналоге, обладающем по меньшей мере 90% сходством последовательности с указанными последовательностями.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность константной области, выбранную из группы, состоящей из мышиного IgG1, мышиного IgG2a, мышиного IgG2b, мышиного IgG3, IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления моноклональное антитело представляет собой химерное моноклональное антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления химерное антитело содержит константные области человеческого происхождения.

Согласно некоторым вариантам осуществления человеческие константные области химерного антитела выбраны из группы, состоящей из IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека.

Согласно конкретным вариантам осуществления антитело представляет собой IgG1 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления предложен IgG человека, содержащий вариабельные области антител, описанных в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления предложен конъюгат, содержащий антитело или его фрагмент, как описано выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат содержит белок-носитель.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложен химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточную часть (связывающий домен), способную связываться с нектином-4.

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR содержит внеклеточную часть, содержащую любое из предложенных антител или их фрагментов, как описано в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR содержит сайт связывания нектина-4, содержащий набор CDR, выбранный из группы, состоящей из:

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR содержит антигенсвязывающий домен, содержащий SEQ ID NO: 32 или 34, трансмембранный домен и внутриклеточный Т-клеточный сигнальный домен.

Согласно аспекту настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержащий антитело или фрагмент антитела, включающие домен, связывающий нектин-4, содержащий набор CDR, выбранный из группы, состоящей из:

Согласно некоторым вариантам осуществления предложен вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 33, или аналог, обладающий по меньшей мере 95% сходством с указанной последовательностью.

Согласно некоторым вариантам осуществления предложена Т-клетка, сконструированная для экспрессии CAR, описанного в настоящем документе.

Согласно дополнительным вариантам осуществления предложена NK-клетка, сконструированная для экспрессии CAR, описанного в настоящем документе.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены полинуклеотидные последовательности, кодирующие моноклональные антитела, обладающие высокой аффинностью и специфичностью в отношении нектина-4 человека, а также векторы и клетки-хозяева, несущие эти полинуклеотидные последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления предложены полинуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, описанные выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, способные связываться с эпитопом в белке нектин-4 человека, с которым связывается: (i) моноклональное антитело (в настоящем документе обозначенное как hNec4.11), имеющее вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 39 и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 40; (ii) моноклональное антитело (в настоящем документе обозначенное как hNec4.01), имеющее вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 35 и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 36; или (iii) моноклональное антитело (в настоящем документе обозначенное как hNec4.05), имеющее вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 37 и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 38.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие последовательность, представленную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36; или SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым другим вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность согласно изобретению кодирует антитело или фрагмент или цепь антитела, содержащие:

i. набор из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой SYYIH (SEQ ID NO: 25); CDR2 HC представляет собой WIYPGNVNTKYNERFKG (SEQ ID NO: 26); CDR3 HC представляет собой SNPYVMDY (SEQ ID NO: 27); CDR1 LC представляет собой KASQSVNNDVA (SEQ ID NO: 28); CDR2 LC представляет собой YASNRFT (SEQ ID NO: 29); и CDR3 LC представляет собой QQAYRSPYT (SEQ ID NO: 30);

iii. набор из шести CDR, где последовательность CDR1 HC представляет собой TYYIH (SEQ ID NO: 15); CDR2 HC представляет собой WIYPGNVNTKNNEKFKV (SEQ ID NO: 16); CDR3 HC представляет собой SNPYVMDY (SEQ ID NO: 17); CDR1 LC представляет собой KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 18); CDR2 LC представляет собой YASNRYT (SEQ ID NO: 19); и CDR3 LC представляет собой QQDYSSPYT (SEQ ID NO: 20).

Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления определенные выше полинуклеотидные последовательности кодируют молекулу, выбранную из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающую часть, и конъюгата антитела, содержащего указанное антитело или фрагмент антитела. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 43, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательности.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере одну последовательность, кодируемую по меньшей мере одной полинуклеотидной последовательностью, раскрытой выше.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложена конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну цепь антитела или ее фрагмент согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой плазмиду.

Согласно некоторым вариантам осуществления плазмида содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, представленную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена клетка, способная продуцировать антитело или фрагмент антитела, содержащие определенные последовательности CDR и/или определенные вариабельные области тяжелой и легкой цепей, определенные выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления предложена клетка, содержащая по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, раскрытую выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетка способна продуцировать моноклональное антитело, содержащее:

Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетка, продуцирующая моноклональное антитело, представляет собой клетку гибридомы.

Антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть присоединены к цитотоксическому фрагменту, радиоактивному фрагменту или идентифицируемому фрагменту.

Настоящее изобретение относится, согласно еще одному аспекту, к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно антитело, фрагмент антитела или их конъюгаты, распознающие нектин-4 человека с высокой аффинностью и специфичностью, и, необязательно, по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель, соль или носитель, где указанное по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела способны ингибировать связывание нектина-4 человека с TIGIT человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит mAb, специфичное к нектину-4, где указанное mAb не конъюгировано с каким-либо токсином или противоопухолевым агентом.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, способное связываться с эпитопом в белке нектин-4 человека, с которым связывается моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из hNec4.11, hNec4.01 и hNec4.05, имеющее последовательности вариабельной области и CDR, раскрытые выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно моноклональное антитело, содержащее:

i. набор из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой SEQ ID NO: 25; CDR2 HC представляет собой SEQ ID NO: 26; CDR3 HC представляет собой SEQ ID NO: 27; CDR1 LC представляет собой SEQ ID NO: 28; CDR2 LC представляет собой SEQ ID NO: 29; и CDR3 LC представляет собой SEQ ID NO: 30;

ii. набор из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой SEQ ID NO: 9; CDR2 HC представляет собой SEQ ID NO: 10; CDR3 HC представляет собой SEQ ID NO: 11; CDR1 LC представляет собой SEQ ID NO: 12; CDR2 LC представляет собой SEQ ID NO: 13; и CDR3 LC представляет собой SEQ ID NO: 14; или

iii. набор из шести CDR, где последовательность CDR1 HC представляет собой SEQ ID NO: 15; CDR2 HC представляет собой SEQ ID NO: 16; CDR3 HC представляет собой SEQ ID NO: 17; CDR1 LC представляет собой SEQ ID NO: 18; CDR2 LC представляет собой SEQ ID NO: 19; и CDR3 LC представляет собой SEQ ID NO: 20.

Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 37. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40.

Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36.

Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит моноклональное антитело или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38.

Также предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела согласно изобретению, для применения для восстановления цитотоксичности NK путем ингибирования связывания нектина-4 с TIGIT, экспрессируемым на NK-клетках.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела способны ингибировать связывание нектина-4 человека с TIGIT, экспрессируемым на Т-клетках.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения для иммунотерапии рака или для усиления иммунного ответа.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит лимфоциты человека, экспрессирующие TIGIT.

Согласно некоторым вариантам осуществления лимфоциты человека представляют собой клетки-киллеры, выбранные из группы, состоящей из Т-клеток, NK-клеток и естественных Т-киллеров (NKT-клеток).

Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-киллеры являются аутологичными или аллогенными.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит аутологичные или аллогенные NK-клетки, экспрессирующие TIGIT.

Рак, поддающийся лечению композицией согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой вид рака, экспрессирующий нектин-4. Согласно некоторым вариантам осуществления рак сверхэкспрессирует нектин-4. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения рак представляет собой метастатический рак. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения для ингибирования образования или распространения метастазов или уменьшения общего количества метастазов у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака молочной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака ободочной кишки, рака шейки матки, рака почки, легкого, рака щитовидной железы, рака предстательной железы, рака головного мозга, рака почки, рака горла, карциномы гортани, рака мочевого пузыря, рака печени, фибросаркомы, рака клеток эндометрия, глиобластомы, саркомы, миелоидного рака, лейкоза и лимфомы. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления рак представляет собой солидный рак. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления солидный рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака легкого, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы и рака яичника.

Согласно другим вариантам осуществления рак представляет собой гемобластоз. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция предназначена для применения для лечения рака вместе с лимфоцитами человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления лимфоциты человека представляют собой клетки-киллеры, выбранные из группы, состоящей из Т-клеток, NK-клеток и NKT-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-киллеры являются аутологичными или аллогенными.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-киллеры представляют собой NK-клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения для предупреждения или лечения вирусной инфекции.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция предназначена для применения для предупреждения заражения вирусом кори.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ ингибирования связывания нектина-4 человека с TIGIT с помощью моноклонального антитела или фрагмента антитела, определенных выше.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту антитела или его фрагмента, которые связываются с нектином-4, где указанное антитело или его фрагмент не конъюгированы с каким-либо токсином или противоопухолевым агентом.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ усиления иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества моноклонального антитела, фрагмента антитела или конъюгата антитела, определенных выше.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного антитела или его фрагмента, распознающего нектин-4 человека с высокой аффинностью и специфичностью и способного ингибировать его связывание с лигандом TIGIT.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения терапевтически эффективное количество приводит к уменьшению размера опухоли или количества метастазов у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей mAb, которое не конъюгировано с каким-либо токсином или противоопухолевым агентом.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения рака включает введение или проведение по меньшей мере одной дополнительной противораковой терапии. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительная противораковая терапия представляет собой хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию или иммунотерапию.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения рака включает введение моноклонального антитела, распознающего нектин-4 человека с высокой аффинностью и специфичностью, и дополнительного противоракового агента. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный противораковый агент выбран из группы, состоящей из иммуномодулятора, активированных лимфоцитарных клеток, ингибитора киназы и химиотерапевтического агента.

Согласно другим вариантам осуществления дополнительный иммуномодулятор представляет собой антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела, связывающиеся с антигеном, отличным от нектина-4 человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный иммуномодулятор представляет собой антитело к молекуле иммунной контрольной точки. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный иммуномодулятор представляет собой антитело к молекуле иммунной контрольной точки, выбранной из группы, состоящей из человеческого белка 1 программируемой клеточной смерти (PD-1), PD-L1 и PD-L2, молекулы адгезии клеток, связанной с карциноэмбриональным антигеном 1 (CEACAM1), гена активации лимфоцитов 3 (LAG3), CD137, OX40 (также называемого CD134), иммуноглобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров (KIR), TIGIT, PVR, CTLA-4, NKG2A, GITR и любой другой молекулы контрольных точек или их комбинации. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления противораковый агент выбран из группы, состоящей из эрбитукса, цитарабина, флударабина, фторурацила, меркаптопурина, метотрексата, тиогуанина, гемцитабина, винкристина, винбластина, винорелбина, кармустина, ломустатина, хлорамбуцила, циклофосфамида, цисплатина, карбоплатина, ифосфамида, мехлорэтамина, мелфалана, тиотепы, дакарбазина, блеомицина, дактиномицина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, митомицина, митоксантрона, пликамицина, этопозида, тенипозида и любой их комбинации. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления противораковый агент представляет собой ингибитор рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Согласно некоторым вариантам осуществления ингибитор EGFR выбран из группы, состоящей из цетуксимаба (Erbitux®), панитумумаба (Vectibix®) и нецитумумаба (Portrazza®). Согласно некоторым вариантам осуществления ингибитор EGFR представляет собой цетуксимаб (Erbitux®).

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения субъект представляет собой человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения применение дополнительно включает применение агента, подавляющего активность или экспрессию иммунного коингибирующего рецептора.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения иммунный коингибирующий рецептор выбран из группы, состоящей из PD-1, TIGIT, PVR, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4, CD96, BY55, LAIR1, SIGLEC10 и 2B4. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно аспекту настоящего изобретения предложен способ модуляции функции и/или активности иммунной системы, включающий модуляцию связывания нектина-4 с TIGIT с помощью антитела согласно изобретению.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения рака включает предупреждение или снижение образования, роста или распространения метастазов у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения рака включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей mAb или его фрагмент, способные ингибировать связывание нектина-4 человека с TIGIT человека, и дополнительно введение указанному субъекту лимфоцитов человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-киллеры являются аутологичными или аллогенными.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-киллеры представляют собой NK-клетки.

Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения или лечения вирусной инфекции, включающему введение субъекту по меньшей мере одного mAb, специфичного к нектину-4 человека, или его фрагмента, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающий домен, где указанное mAb или его фрагмент способны ингибировать связывание нектина-4 с TIGIT.

Согласно некоторым вариантам осуществления предложен способ предупреждения заражения вирусом кори, включающий введение mAb, специфичного к нектину-4 человека, или его фрагмента, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающий домен, где указанное mAb или его фрагмент способны ингибировать связывание вируса кори с нектином-4 человека, экспрессируемым на эпителиальных клетках. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки представляют собой эпителиальные клетки. Согласно аспекту настоящего изобретения предложен способ диагностики или прогнозирования рака или инфекционного заболевания у субъекта, включающий определение уровня экспрессии нектина-4 в биологическом образце от указанного субъекта с помощью по меньшей мере одного антитела, как описано в настоящем документе.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества клетки, содержащей молекулу CAR, как описано в настоящем документе.

Настоящее изобретение дополнительно включает, согласно еще одному аспекту, способ определения или количественной оценки экспрессии нектина-4, включающий приведение биологического образца в контакт с антителом или фрагментом антитела и измерение уровня образования комплекса, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит:

Способы определения и количественной оценки могут осуществляться in vitro или ex vivo в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, или могут применяться для диагностики состояний, связанных с экспрессией нектина-4. Антитела согласно настоящему изобретению также могут применяться для создания методов скрининга. Например, иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммуноанализ (RIA), а также такой метод, как ИГХ (иммуногистохимия) или FACS (сортировка клеток, активируемых флуоресценцией), могут быть созданы для измерения уровней секретируемого или клеточно-ассоциированного полипептида с помощью антител и методов, известных в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ обнаружения или количественной оценки присутствия нектина-4, экспрессируемого на клетках или секретируемого в биологическую среду, включает следующие стадии:

i. инкубирование образца с антителом, специфичным к нектину-4 человека, или его фрагментом, содержащим по меньшей мере антигенсвязывающую часть;

ii. обнаружение связанного нектина-4 с помощью детектируемого зонда.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно включает следующие стадии:

iii. сравнение количества (ii) с градуировочной кривой, полученной для референсного образца, содержащего известное количество нектина-4; и

iv. вычисление количества нектина-4 в образце по градуировочной кривой.

Согласно некоторым частным вариантам осуществления образец представляет собой биологическую жидкость.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ осуществляют in vitro или ex vivo.

Также предложен набор для измерения экспрессии или присутствия нектина-4 в биологическом образце, содержащий по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит антитело или фрагмент антитела, содержащий:

Согласно аспекту настоящего изобретения предложен набор для выявления рака, где диагностический набор содержит антитело или его фрагмент антитела, как раскрыто в настоящем документе.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения предложен способ диагностики, оценки тяжести или определения стадии заболевания, связанного с иммунной системой, или пролиферативного заболевания, включающий определение экспрессии, концентрации или активности нектина-4 в образце от субъекта с помощью антитела согласно настоящему изобретению или его фрагмента или конъюгата, и сравнение экспрессии или активности нектина-4 с референсной величиной экспрессии, концентрации или активности нектина-4. Указанная референсная величина может быть получена из образца, взятого у нормального субъекта, у того же субъекта, когда он находился на другой стадии заболевания, или определяется из клинических данных большой популяции субъектов.

Дополнительные варианты осуществления и полный объем области применения настоящего изобретения станут понятны из подробного описания изобретения, приведенного далее в настоящем документе. Тем не менее, следует понимать, что подробное описание изобретения и конкретные примеры, хотя в них и описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены исключительно в целях иллюстрации, так как разные изменения и модификации, не выходящие за рамки сущности и объема изобретения, будут понятны специалистам в данной области техники после изучения этого подробного описания изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 Схематическое изображение рецепторов, участвующих в передаче сигналов TIGIT на иммунных (NK) и опухолевых клетках. Показано антитело к нектину-4.

Фиг. 2 Клоны антител hNec4.05 и hNec4.01 демонстрируют лучшую способность блокирования взаимодействия TIGIT-нектин-4. На графике показаны значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) FACS-окрашивания клеток лимфомы Беркитта RAJI, трансфицированных нектином-4. Клетки инкубировали с 0,2 мкг различных клонов (как указано), а затем инкубировали с 3 мкг Ig к TIGIT с последующим окрашиванием вторичным антителом против иммуноглобулина человека.

Фиг. 3 Количественная оценка аффинности связывания клонов антител с нектином-4. Связывание меченного флуорофором Ig к нектину-4 и клонов антител hNec4.05 и клона hNec4.01 наблюдали с помощью микромасштабного термофореза. Измерения повторяли как минимум с тремя независимыми белковыми препаратами, и показаны средние результаты. (± СОС).

Фиг. 4A и 4B Клоны антител hNec4.05 и hNec4.01 блокируют нектин-4 и повышают цитотоксичность NK. Меченые [³⁵S] метионином (4A) клетки лимфомы Беркитта RAJI, трансфицированные нектином-4; (4B) клетки карциномы предстательной железы LNCap (естественным образом экспрессирующие нектин-4), инкубировали с 1 мкг/лунку либо мышиного IgG1 в качестве контрольного антитела, либо антител к нектину-4 hNec4.01 или hNec4.05. Через 1 час в клетки добавляли NK-клетки и инкубировали в течение 5 часов. На график нанесено среднее специфическое уничтожение (± СКО) при различных соотношениях эффектор:мишень (E:T) для NK:раковых клеток. *обозначает значимый эффект (p <0,05) клонов hNec4.01 и hNec4.05 по сравнению с контрольным антителом. На фигуре показан один репрезентативный эксперимент из трех проведенных. Такой же эффект был установлен с клетками MCF-7, MDA-MB-453, SK-BR-3 и T47D, все из которых являются линиями клеток рака молочной железы.

Фиг. 5A-5C Клоны антител не связывают мышиный нектин-4. (A) Вестерн-блоттинг клеток RAJI, трансфицированных мышиным нектином-4 (обозначенным как мНектин-4) и обнаруженных с помощью коммерчески доступного mAb к мышиному нектину-4 (клон 356704, который не подходит для проточной цитометрии). Экспрессию сравнивали с клетками RAJI, экспрессирующими пустой вектор (обозначенный как Пустой). Окрашивание на hGAPDH использовали в качестве контроля нагрузки. (B-C) FACS-окрашивание клеток RAJI, трансфицированных мышиным нектином-4 (гистограммы с черной линией). Клетки окрашивали 0,2 мкг (B) клона hNec4.01 или (C) клона hNec4.05.

Фиг. 6A-6C Блокирование взаимодействий нектина-4 и нектина-1. (A-B) FACS-окрашивание клеток RAJI, трансфицированных нектином-4 человека. Клетки предварительно инкубировали с 1 мкг (A) клона hNec4.01 или (B) клона hNec4.05, а затем инкубировали с 3 мкг Ig к нектину-1 (гистограммы с черной линией). Окрашивание без блокирования показано серой линией. Гистограммы, закрашенные серым цветом, представляют собой фоновое контрольное окрашивание только вторичного антитела. (C) Значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) при FACS-окрашивании в A и B.

Фиг. 7A-7C Действие mAb к нектину-4 in vivo. (A) Мышам SCID-beige подкожно имплантировали 5×10⁶ клеток Raji, которые были либо трансфицированы пустым вектором (ПВ), либо сверхэкспрессировали (СЭ) нектин-4, по отдельности (левая панель, без NK) или вместе с 1×10⁶ NK-клеток (правая панель, NK). (B) Мышам SCID-beige подкожно имплантировали 5×10⁶ клеток Raji, сверхэкспрессирующих нектин-4, вместе с 1×10⁶ NK-клеток. Мыши получали 75 мкг либо контрольного антитела, либо клона mAb к нектину-4 hNec4.05 два раза в неделю путем внутрибрюшинной инъекции. (C) Мышам SCID-beige подкожно имплантировали 5×10⁶ клеток MDA-MB-453, по отдельности или с 7×10⁵ NK-клеток. Затем мышей лечили, как в (B). Опухоли собирали и взвешивали на 21 (A), 27 (B) или 23 (C) день после инъекции опухоли. N=7 для всех экспериментальных групп мышей. (*) p<0,05.

Фиг. 8A-8C Связывание клонов антител hNec4.05 и hNec4.11 с нектином-4 на клеточной поверхности. (A) Связывание антител с нектином-4, экспрессируемым на линии клеток MDA-MD-453 человека, оценивали с помощью анализа FACS. Показаны значения EC50, рассчитанные после титрования связывания антитела (диапазон 20-0,01 нМ), и максимальный сигнал связывания для каждого клона. Следует отметить, что аналогичные результаты были получены с химерной версией антител, в которой Fc мышиного IgG1 был заменен на Fc иммуноглобулина человека. (B) Связывание антител с клетками CHO, трансфицированными нектином-4 яванского макака (Cyno) и проанализированными, как в A. (B) Связывание антител с клетками CHO, трансфицированными мышиным-нектином-4 и проанализированными, как в A. НО - не обнаружено.

Фиг. 9A-9D Клоны антител hNec4.05 и hNec4.11 блокируют связывание нектина-4 с его лигандами TIGIT и нектином-1. Связывание лигандов нектина-4 оценивали с помощью анализа FACS. Клетки СНО, трансфицированные нектином-4 человека, инкубировали либо с Ig к TIGIT человека (A и C), либо с Ig к нектину-1 человека (B и D), оба при 20 мкг/мл, с клоном антитела к нектину-4 hNec4.05 или без него (A и B) или клоном hNec4.11 или без него (C и D), оба при 8 мкг/мл. Во всех случаях наблюдается устойчивое ингибирование связывания антителами к нектину-4. Оставшийся сигнал, вероятно, связан со связыванием лиганда с другими рецепторами, экспрессируемыми клетками CHO, такими как PVR, на которые не влияют антитела к нектину-4.

Фиг. 10A-10B Клоны химерного Ab человеческого IgG1 hNec4.05 и hNec4.11 усиливают активацию NK-клеток в присутствии опухолевых клеток. NK-клетки человека (эффектор, E) инкубировали с клетками-мишенями (T) HT1376 (A) и MDA-MD-453 (B) при соотношении E:T, равном 2:1. Инкубацию проводили в присутствии 12 мкг/мл химерных клонов hNec4.05 и hNec4.11 или контрольного hIgG1. Через два часа NK-клетки анализировали на предмет их дегрануляции и статуса активации с помощью анализа экспрессии CD107a методом FACS. Дегрануляцию NK-клеток в присутствии контрольного hIgG1 принимали за 1, и соответствующим образом рассчитывали кратность индукции. Показаны средние значения для 2-3 повторных определений и их нормированные СКО.

Фиг. 11A-11D CAR-T, управляемые hNec4.11, приводят к специфической активации Т-клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих нектин-4. (A) Схематическое изображение конструкции CART. (B) Клетки Jurkat трансдуцировали лентивирусными частицами, кодирующими конструкцию и GFP (зеленый флуоресцентный белок). Согласно результатам анализа экспрессии GFP методом FACS эффективность трансдукции была выше 99%. (C) Родительские клетки Jurkat или клетки Jurkat, экспрессирующие конструкцию CART (Jurkat pHAGE2.4.11), инкубировали с клетками-мишенями HT1376 или MDA-MD-453 (MDA-453) в течение 48 часов, после чего среду собирали и тестировали на концентрацию ИЛ-2 как способ оценки активации Jurkat. Секреция ИЛ-2 была в значимой степени индуцирована экспрессией CART (*= 0,003, **= 0,00014; двусторонний критерий Стьюдента). Показан репрезентативный эксперимент из двух проведенных. (D) МНПК (мононуклеарные клетки периферической крови) от здорового донора трансдуцировали с использованием конструкции CART. МНПК CART инкубировали с клетками HT1376 в диапазоне различных E:T (указано на оси x). Уничтожение клеток-мишеней было значимым для случаев, отмеченных звездочкой (***p<7*10^-5).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к эффективным моноклональным антителам, специфичным к нектину-4 человека. Изобретение также относится к получению и применению указанных mAb в качестве терапевтических агентов. В частности, mAb согласно настоящему изобретению могут применяться для восстановления и увеличения активности иммунных клеток в отношении уничтожения опухолевых клеток, а также в качестве диагностических реагентов.

Хотя в предыдущей публикации показано применение mAb к нектину-4 для нацеливания лекарственного средства на опухолевые клетки, сверхэкспрессирующие нектин-4, в настоящем изобретении впервые раскрыты моноклональные антитела, которые непосредственно усиливают иммунную систему против опухолевых клеток путем ингибирования связывания нектина-4 с ингибирующим рецептором TIGIT иммунных клеток, таких как NK-клетки.

Антитела согласно настоящему изобретению не обладают недостатками антител, специфичных к TIGIT, которые в настоящее время проходят исследования для лечения рака. Антитела к TIGIT могут, как утверждается, смещать всю иммунную систему в сторону активации путем блокирования всех иммунных клеток, экспрессирующих рецептор TIGIT, и потенциально вызывать аутоиммунные эффекты, в то время как антитела к нектину-4 согласно настоящему изобретению нацелены только на клетки, экспрессирующие нектин-4, который, как известно, сверхэкспрессируется в опухолях.

Более того, некоторые из антител согласно настоящему изобретению могут также приводить к иммуно-независимому уничтожению опухолевых клеток, вероятно, благодаря их способности блокировать взаимодействия нектина-4 с нектином-1.

Термин «антиген» в контексте настоящего документа относится к молекуле или части молекулы, способной вызывать образование антитела и специфически связываемой антителом. Антиген может иметь один или более эпитопов. Упомянутое выше специфическое связывание означает, что антиген будет взаимодействовать высокоселективным образом со своим соответствующим антителом, а не с множеством других антител, которые могут быть индуцированы другими антигенами. Антиген согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения представляет собой белок нектин-4.

Термин «нектин-4» или «молекула клеточной адгезии нектин-4» в контексте настоящего документа относится к однопроходному мембранному белку I типа, состоящему из 510 аминокислот и имеющему молекулярную массу 55454 Да, также известному как PVRL4; LNIR; PRR4; и EDSS1. Белок нектин-4 содержит два иммуноглобулиноподобных (Ig-подобных) домена C2-типа и один Ig-подобный домен V-типа. Он участвует в адгезии клеток посредством трансгомофильных и -гетерофильных взаимодействий. Растворимая форма образуется в результате протеолитического расщепления на клеточной поверхности металлопротеиназой ADAM17/TACE, а секретируемая форма обнаружена как в линиях клеток опухоли молочной железы, так и у пациентов с опухолями молочной железы. Иллюстративный нектин-4 согласно изобретению представлен следующими обозначениями или регистрационными номерами SwissPort, UniPort и GenBank: Q96NY8-NECT4_HUMAN; Q96NY8; B4DQW3; Q96K15; Q96NY8-1; Q96NY8-2; ENSP00000356991; NP_112178.2; XP_005245565.1; XP_011508323.1; XP_011508324.1; или XP_011508325.1.

Антитела или их фрагмент согласно изобретению связываются с эпитопом в нектине-4. В частности, антитела связываются с эпитопом в эктодомене (внеклеточной части) последовательности белка нектин-4.

Термин «антигенная детерминанта» или «эпитоп» в контексте настоящего документа относится к области молекулы антигена, которая специфически взаимодействует с определенным антителом. Пептидные последовательности, полученные из эпитопа, могут быть использованы, по отдельности или в сочетании с фрагментом-носителем, с помощью способов, известных в данной области техники, для иммунизации животных и получения дополнительных поликлональных или моноклональных антител. Выделенные пептиды, полученные из эпитопа, могут применяться в способах диагностики для обнаружения антител.

Следует отметить, что аффинность может быть количественно оценена с использованием известных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR) (описанный в Scarano S, Mascini M, Turner AP, Minunni M. Surface plasmon resonance imaging for affinity-based biosensors. Biosens Bioelectron. 2010, 25: 957-66), и может быть рассчитана с использованием, например, константы диссоциации, Kd, где более низкая Kd отражает более высокую аффинность.

Антитела или иммуноглобулины содержат две тяжелые цепи, связанные вместе дисульфидными связями, и две легкие цепи, причем каждая легкая цепь связана с соответствующей тяжелой цепью дисульфидными связями с образованием Y-образной структуры. Протеолитическое расщепление антитела дает домены Fv (вариабельный фрагмент) и Fc (кристаллический фрагмент). Антигенсвязывающие домены, Fab, включают области, в которых полипептидная последовательность варьируется. Термин F(ab')₂ означает два плеча Fab', соединенных дисульфидными связями. Центральная ось антитела называется Fc-фрагментом. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов (C_H). Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (V_L) на одном конце и константный домен (C_L) на другом конце, причем вариабельный домен легкой цепи находится рядом с вариабельным доменом тяжелой цепи, а константный домен легкой цепи находится рядом с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт. Домены на легкой и тяжелой цепях имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных области, последовательности которых относительно консервативны, к которым присоединяются три гипервариабельных домена, известных как определяющие комплементарность области (CDR 1-3). Эти домены вносят вклад в специфичность и аффинность антигенсвязывающего сайта.

Идентификацию или определение CDR из отдельно взятой вариабельной последовательности тяжелой или легкой цепи обычно осуществляют с помощью одного из нескольких методов, известных в данной области техники. Например, такое определение осуществляют согласно Kabat (Wu T.T and Kabat E.A., J Exp Med, 1970; 132:211–50) и IMGT (Lefranc M-P, et al., Dev Comp Immunol, 2003, 27:55-77).

В случаях использования термина «CDR, имеющая последовательность» или аналогичного термина он включает варианты, в которых CDR содержит указанные последовательности, а также варианты, в которых CDR состоит из указанной последовательности.

Специфичность антитела к антигену обусловлена гипервариабельной областью (HVR), а именно, уникальными последовательностями CDR как легкой, так и тяжелой цепей, которые вместе образуют антигенсвязывающий сайт.

Изотип тяжелой цепи (гамма, альфа, дельта, эпсилон или мю) определяет класс иммуноглобулина (IgG, IgA, IgD, IgE или IgM, соответственно). Легкая цепь может иметь один из двух изотипов (каппа, κ или лямбда, λ). Оба изотопа встречаются во всех классах антител.

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и включает моноклональные антитела (включая полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела и фрагменты антител, достаточно длинные, чтобы проявлять желаемую биологическую активность, а именно, связывание с нектином-4 человека.

Антитело или антитела согласно изобретению включают интактные антитела, такие как поликлональные антитела или моноклональные антитела (mAb), а также их протеолитические фрагменты, такие как фрагменты Fab или F(ab')₂. Одноцепочечные антитела входят в объем настоящего изобретения.

Фрагменты антител

«Фрагменты антител» содержат только часть интактного антитела, обычно включающую антигенсвязывающий сайт интактного антитела и, таким образом, сохраняющую способность связывать антиген. Примеры фрагментов антител, охватываемых настоящим определением, включают: (i) фрагмент Fab, имеющий домены VL, CL, VH и CH1; (ii) фрагмент Fab', представляющий собой фрагмент Fab, имеющий один или более остатков цистеина на С-конце домена CH1; (iii) фрагмент Fd, имеющий домены VH и CH1; (iv) фрагмент Fd', имеющий домены VH и CH1 и один или более остатков цистеина на С-конце домена CH1; (v) фрагмент Fv, имеющий домены VL и VH одного плеча антитела; (vi) фрагмент dAb (Ward et al., Nature 1989, 341, 544-546), состоящий из домена VH; (vii) выделенные области CDR; (viii) фрагменты F(ab')₂ - двухвалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab', связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ix) молекулы одноцепочечных антител (например, одноцепочечный Fv; scFv) (Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1988, 85,5879-5883); (x) «диатела» с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащими вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL), в одной и той же полипептидной цепи (см., например, EP 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6444-6448); (xi) «линейные антитела», содержащие пару последовательно расположенных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. Protein Eng., 1995, 8, 1057-1062; и патент США № 5,641,870).

Были разработаны различные методы получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако теперь эти фрагменты можно непосредственно продуцировать с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител. В качестве альтернативы, фрагменты Fab'-SH могут быть непосредственно выделены из E. coli и химически связаны с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу фрагменты F(ab')₂ могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методы получения фрагментов антител будут очевидны квалифицированному специалисту. В других вариантах осуществления предпочтительное антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv).

Одноцепочечные антитела могут представлять собой одноцепочечные составные полипептиды, обладающие способностью связывать антиген и содержащие аминокислотные последовательности, гомологичные или аналогичные вариабельным областям легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина, т.е. связанные V_H-V_L или одноцепочечный Fv (scFv). Методы получения одноцепочечных антител (патент США № 4,946,778) могут быть модифицированы для получения одноцепочечных антител к нектину-4.

Термин «моноклональное антитело» (mAb) в контексте настоящего документа относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение «моноклональный» не должно толковаться как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. MAb могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники. Например, моноклональные антитела для применения согласно настоящему изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature 1975, 256, 495, или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4,816,567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных, например, в Clackson et al., Nature 1991, 352, 624-628 или Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222:581-597.

Конструирование и разработка рекомбинантных одновалентных антигенсвязывающих молекул, полученных из моноклональных антител, посредством быстрой идентификации и клонирования генов функциональных вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи, а также конструирование и клонирование синтетической последовательности ДНК, оптимизированной для экспрессии в рекомбинантных бактериях, описаны в Fields et at. 2013, 8(6):1125-48.

MAb согласно настоящему изобретению могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA и IgD. Гибридома, продуцирующая mAb, может быть культивирована in vitro или in vivo. Высокие титры mAb могут быть достигнуты путем продуцирования in vivo, когда клетки отдельных гибридом вводят внутрибрюшинно примированным мышам Balb/c для получения асцитной жидкости, содержащей высокие концентрации желаемых mAb. mAb могут быть очищены из таких асцитных жидкостей или из культуральных супернатантов с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Также рассматриваются антиидиотипические антитела, обладающие специфической иммунореактивностью по отношению к гипервариабельным областям антитела согласно изобретению.

В изобретении предложено моноклональное антитело или фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий домен (ABD), который содержит три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, где указанный ABD обладает по меньшей мере 90% идентичностью или сходством последовательности с ABD моноклонального мышиного антитела, содержащего: (i) вариабельную цепь тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и вариабельную цепь легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 (в настоящем документе обозначено как hNec4.11); (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 (в настоящем документе обозначено как hNec4.01); или (ii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38 (в настоящем документе обозначено как hNec4.05). Такое антитело может иметь домен ABD, обладающий по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98, по меньшей мере 99% идентичностью или сходством последовательности, или 100% идентичностью последовательности с соответствующим ABD антител hNec4.11, hNec4.01 или hNec4.05.

Идентичность последовательностей относится к количеству аминокислот или нуклеотидов, которые точно совпадают у двух разных последовательностей. Сходство последовательностей допускает рассмотрение консервативных аминокислотных замен как идентичных аминокислот.

В изобретении также предложены консервативные аминокислотные варианты молекул антител согласно изобретению. Также могут быть созданы варианты согласно изобретению, сохраняющие общую молекулярную структуру кодируемых белков. Учитывая свойства отдельных аминокислот, составляющих описанные белковые продукты, специалист может определить необходимость некоторых целесообразных замен. Аминокислотные замены, т.е. «консервативные замены», могут быть сделаны, например, на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы задействованных остатков. В контексте настоящего документа термин «аналог антитела» относится к антителу, полученному из другого антитела посредством одной или более консервативных аминокислотных замен.

В контексте настоящего документа термин «вариант антитела» относится к любой молекуле, содержащей антитело согласно настоящему изобретению. Например, вариантом антитела считаются слитые белки, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связаны с другим химическим структурным элементом.

Аналоги и варианты последовательностей антител также входят в объем настоящей заявки. Они включают, не ограничиваясь перечисленным, консервативные и неконсервативные замены, инсерции и делеции аминокислот в последовательности. Такая модификация и получаемый в результате аналог или вариант антитела входят в объем настоящего изобретения при условии, что они придают или даже улучшают связывание антитела с нектином-4 человека.

Консервативные замены аминокислот, известные специалистам в данной области техники, входят в объем настоящего изобретения. Консервативные аминокислотные замены включают замену одной аминокислоты другой, имеющей тот же тип функциональной группы или боковой цепи, например, алифатический, ароматический, положительно заряженный, отрицательно заряженный. Эти замены могут повысить пероральную биодоступность, пенетрацию и нацеливание на конкретные популяции клеток, иммуногенность и т. п. Специалисту будет ясно, что отдельные замены, делеции или добавления в пептиде, полипептиде или белковой последовательности, которые приводят к изменению, добавлению или удалению одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой «консервативно модифицированный вариант», если изменение приводит к замене аминокислоты на химически схожую аминокислоту. Таблицы консервативных замен, в которых приведены функционально схожие аминокислоты, хорошо известны в данной области техники. Например, согласно одной из таблиц, известных в данной области техники, каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга:

1) аланин (A), серин (S), треонин (T);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Следует подчеркнуть, что последовательности вариантных цепей определяют методами секвенирования с использованием специфических праймеров. Различные методы секвенирования, применяемые для одной и той же последовательности, могут приводить к несколько различающимся последовательностям из-за технических проблем и использования разных праймеров, особенно на концах последовательности. Поэтому в заявке приведены различные варианты последовательностей вариабельной цепи антитела к нектину-4.

Термины «молекула, имеющая антигенсвязывающую часть антитела» и «антигенсвязывающие фрагменты», используемые в настоящем документе, подразумевают не только интактные молекулы иммуноглобулинов любого изотипа и генерируемые любой линией клеток животных или микроорганизмом, но также и их антигенсвязывающую реакционноспособную часть, включая, не ограничиваясь перечисленным, фрагмент Fab, фрагмент Fab', фрагмент F(ab')₂, вариабельную часть их тяжелой и/или легкой цепей, Fab мини-антитела (см., например, WO 93/15210, заявку на патент США № 08/256,790, WO 96/13583, заявку на патент США № 08/817,788, WO 96/37621, заявку на патент США № 08/999,554), и одноцепочечные антитела, содержащие такую реакционноспособную часть, а также любой другой тип молекулы, в которую физически внедрена такая реакционноспособная часть антитела. Такие молекулы могут быть получены любым известным способом, включая, не ограничиваясь перечисленным, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные методы.

Моноклональные антитела в настоящем документе, в частности, включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4,816,567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Кроме того, может быть осуществлена прививка определяющей комплементарность области (CDR) для изменения определенных свойств молекулы антитела, включая аффинность или специфичность. Неограничивающий пример прививки CDR раскрыт в патенте США № 5,225,539.

Химерные антитела представляют собой молекулы, разные части которых происходят от разных видов животных, например, имеющие вариабельную область, полученную из мышиного mAb, и константную область иммуноглобулина человека. Антитела, в которых каркасные остатки вариабельной области по существу происходят от антитела человека (называемого акцепторным антителом), а CDR по существу происходят от мышиного антитела (называемого донорным антителом), также называются гуманизированными антителами. Химерные антитела в основном используются для снижения иммуногенности при применении и для увеличения выхода при производстве, например, когда мышиные mAb имеют более высокий выход из гибридом, но более высокую иммуногенность у людей, так что используются химерные mAb человек/мышь. Химерные антитела и способы их получения известны в данной области техники (например, патентные РСТ заявки WO 86/01533, WO 97/02671, WO 90/07861, WO 92/22653 и патенты США № 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, 5,530,101 и 5,225,539).

Согласно конкретному варианту осуществления предложено химерное моноклональное антитело, распознающее нектин-4 человека, содержащее:

i. набор из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой (SEQ ID NO: 25); CDR2 HC представляет собой (SEQ ID NO: 26); CDR3 HC представляет собой (SEQ ID NO: 27); CDR1 LC представляет собой (SEQ ID NO: 28); CDR2 LC представляет собой (SEQ ID NO: 29); и CDR3 LC представляет собой (SEQ ID NO: 30);

ii. набор из шести CDR, где CDR1 HC представляет собой (SEQ ID NO: 9); CDR2 HC представляет собой (SEQ ID NO: 10); CDR3 HC представляет собой (SEQ ID NO: 11); CDR1 LC представляет собой (SEQ ID NO: 12); CDR2 LC представляет собой (SEQ ID NO: 13); и CDR3 LC представляет собой (SEQ ID NO: 14); или

iii. набор из шести CDR, где последовательность CDR1 HC представляет собой (SEQ ID NO: 15); CDR2 HC представляет собой (SEQ ID NO: 16); CDR3 HC представляет собой (SEQ ID NO: 17); CDR1 LC представляет собой (SEQ ID NO: 18); CDR2 LC представляет собой (SEQ ID NO: 19); и CDR3 LC представляет собой (SEQ ID NO: 20).

Согласно аспекту настоящего изобретения предложен CAR, содержащий фрагмент антитела, который специфически связывается с нектином-4.

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR содержит: i) специфический связывающий агент, который может специфически связываться с нектином-4; ii) спейсер или шарнирный домен; iii) трансмембранный домен (ТМ), закрепляющий CAR в Т-клеточной мембране; iv) эндодомен, передающий сигналы внутри Т-клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR содержит набор CDR, выбранный из группы, состоящей из:

Согласно некоторым вариантам осуществления вектор содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 33. Согласно некоторым вариантам осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор.

Что касается трансмембранного домена, в различных вариантах осуществления CAR может быть сконструирован таким образом, чтобы он содержал трансмембранный домен, присоединенный к внеклеточному домену CAR. Трансмембранный домен может включать одну или более дополнительных аминокислот, прилегающих к трансмембранной области, например, одну или более аминокислот, связанных с внеклеточной областью белка, из которого происходит трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислот внеклеточной области) и/или одну или более дополнительных аминокислот, связанных с внутриклеточной областью белка, из которого происходит трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислот внутриклеточной области). Согласно некоторым вариантам осуществления трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем аминокислотной замены таким образом, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами того же или других поверхностных мембранных белков, например, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса.

Согласно некоторым вариантам осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD27, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или фрагмент антитела, включающие домен, связывающий нектин-4, соединены с трансмембранным доменом шарнирной областью. Согласно некоторым вариантам осуществления шарнир получен из белка человека. Согласно некоторым вариантам осуществления шарнир представляет собой шарнир Ig (иммуноглобулина) человека. Согласно некоторым вариантам осуществления шарнир представляет собой шарнир IgG4 или шарнир CD8a.

Цитоплазматический домен или область CAR включает внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обычно отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был введен CAR. Термин «эффекторная функция» относится к специализированной функции клетки. Эффекторной функцией Т-клетки, например, может быть цитолитическая активность или хелперная активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «внутриклеточный сигнальный домен» относится к части белка, которая передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Подразумевается, что термин «внутриклеточный сигнальный домен» включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи сигнала эффекторной функции. Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR согласно настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторов, которые действуют совместно, инициируя передачу сигнала после взаимодействия с антигенным рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, имеющую такие же функциональные возможности.

В некоторых вариантах осуществления сигналов, генерируемых только посредством TCR, недостаточно для полной активации Т-клетки, и также требуется вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клеток опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию посредством TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и теми, которые действуют антиген-независимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический домен, например, костимулирующий домен).

Согласно некоторым вариантам осуществления внутриклеточный сигнальный домен сконструирован так, чтобы он содержал два или более костимулирующих сигнальных домена. Согласно некоторым вариантам осуществления два или более костимулирующих сигнальных домена разделены линкерной молекулой. Согласно некоторым вариантам осуществления линкерная молекула представляет собой остаток глицина. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер представляет собой остаток аланина.

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR содержит костимулирующий домен, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1BB (CD137). Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим CAR, вместе с векторами и клетками-хозяевами. Изобретение также относится к (гетерологичной) Т-клетке, содержащей CAR согласно изобретению, вместе с фармацевтическими композициями, содержащими такие CAR вместе с подходящим носителем или вспомогательным веществом. Изобретение также относится к терапии аутологичными Т-клетками, включающей Т-клетки, композиции и CAR согласно изобретению (и соответствующие медицинские применения).

Согласно некоторым вариантам осуществления CAR-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем документе, может дополнительно содержать второй CAR, например, второй CAR, включающий другой антигенсвязывающий домен, например, к той же мишени (нектину-4) или к другой мишени. Согласно некоторым вариантам осуществления когда CAR-экспрессирующая клетка содержит два или более разных CAR, антигенсвязывающие домены разных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом.

Согласно некоторым вариантам осуществления предложена популяция клеток, где по меньшей мере одна клетка в указанной популяции экспрессирует CAR, имеющий домен к нектину-4, описанный в настоящем документе, а вторая клетка экспрессирует другой агент, например, агент, усиливающий активность CAR-экспрессирующей клетки.

Изобретение также относится к (гетерологичной) NK-клетке, содержащей CAR согласно изобретению, вместе с фармацевтическими композициями, содержащими такие CAR вместе с подходящим носителем или вспомогательным веществом. Изобретение также относится к терапии аутологичными NK-клетками, включающей NK-клетки, композиции и CAR согласно изобретению (и соответствующие медицинские применения).

В контексте настоящего документа «химерный антигенный рецептор» или «CAR» относится к искусственно сконструированному гибридному полипептиду, содержащему антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающую часть антитела (например, scFV)), трансмембранный домен и Т-клеточный или NK-клеточный сигнальный домен, и/или T-клеточный или NK-клеточный активирующий домен. CAR обладают способностью перенаправлять специфичность и реактивность Т-клеток или NK-клеток на выбранную мишень не рестриктированным по MHC образом с помощью антигенсвязывающих свойств моноклональных антител. Распознавание антигена не рестриктированным по MHC образом дает Т-клеткам или NK-клеткам, экспрессирующим CAR, способность распознавать антиген независимо от процессинга антигена, что таким образом позволяет обойти основной механизм ускользания опухоли от иммунологического ответа. Чаще всего внеклеточный связывающий домен CAR состоит из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), полученного в результате слияния вариабельных областей тяжелой и легкой цепи мышиного или гуманизированного моноклонального антитела.

Фармакология

В фармацевтических и лекарственных препаратах активный агент предпочтительно используется вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и, необязательно, любыми другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(и) должен быть фармацевтически приемлемым в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами препарата и не оказывать чрезмерно пагубного действия на его реципиента. Активный агент предоставляется в количестве, эффективном для достижения желаемого фармакологического эффекта, как описано выше, и в количестве, подходящем для достижения желаемого воздействия.

Обычно антитела, их фрагменты и конъюгаты согласно настоящему изобретению, содержащие антигенсвязывающую часть антитела или содержащие другой полипептид, включая пептидомиметик, будут суспендированы в стерильном физиологическом растворе для применения в терапевтических целях. В качестве альтернативы фармацевтические композиции могут быть приготовлены с обеспечением контроля высвобождения активного ингредиента (молекулы, содержащей антигенсвязывающую часть антитела) или продления его присутствия в организме пациента. Известны многочисленные подходящие системы для доставки лекарственных средств, которые включают, например, имплантируемые системы для высвобождения лекарственных средств, гидрогели, гидроксиметилцеллюлозу, микрокапсулы, липосомы, микроэмульсии, микросферы и тому подобное. Препараты с контролируемым высвобождением могут быть приготовлены с использованием полимеров для образования комплекса с молекулой согласно настоящему изобретению или ее адсорбции. Например, биосовместимые полимеры включают матрицы из сополимера этилена и винилацетата и матрицы из сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты полиангидридного типа. Скорость высвобождения молекулы согласно настоящему изобретению, т.е. антитела или фрагмента антитела, из такой матрицы зависит от молекулярной массы молекулы, количества молекулы в матрице и размера диспергированных частиц.

Фармацевтическая композиция согласно данному изобретению может быть введена любыми подходящими способами, например, перорально, местно, интраназально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, внутрисуставно, внутриочагово, внутриопухолево или парентерально. Обычно для доставки антител используют внутривенное (в/в) введение.

Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что терапевтически эффективное количество молекулы согласно настоящему изобретению будет зависеть, среди прочего, от схемы введения, вводимой разовой дозы молекулы, от того, вводится ли молекула в комбинации с другими терапевтическими агентами, иммунного статуса и состояния здоровья пациента, терапевтической активности вводимой молекулы, ее устойчивости в кровообращении и мнения лечащего врача.

В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать количество раковых клеток; уменьшать размер опухоли; подавлять (т.е. до некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) инфильтрацию периферических органов раковыми клетками; подавлять (т.е. до некоторой степени замедлять и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; подавлять, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, связанных с расстройством. В тех случаях, когда лекарственное средство может предупреждать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии рака эффективность in vivo может быть измерена, например, путем оценки продолжительности выживаемости, времени до прогрессирования заболевания (ВДП), частоты ответов (ЧО), длительности ответа и/или качества жизни.

Рак, поддающийся лечению с помощью настоящего изобретения, включает, не ограничиваясь перечисленным, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз, или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), рак брюшины, гепатоклеточный рак, рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак печени и различные типы рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая низкозлокачественную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ) НХЛ; среднезлокачественную/фолликулярную НХЛ; среднезлокачественную диффузную НХЛ; высокозлокачественную иммунобластную НХЛ; высокозлокачественную лимфобластную НХЛ; высокозлокачественную мелкоклеточную НХЛ с нерасщеплённым ядром; НХЛ с массивным поражением; мантийноклеточную лимфому; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (ПТЛР), а также патологическую сосудистую пролиферацию, связанную с факоматозами, отек (например, связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса. Предпочтительно рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака прямой кишки, немелкоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы (НХЛ), почечно-клеточного рака, рака предстательной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, саркомы мягких тканей, саркомы Капоши, нейроэндокринной карциномы, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы и множественной миеломы. Раковые состояния, поддающиеся лечению согласно настоящему изобретению, включают метастатические виды рака.

Согласно другим вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению предназначена для применения для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией нектина-4. Типы рака, связанные со сверхэкспрессией нектина-4, можно идентифицировать с использованием известных баз данных, таких как Атлас ракового генома (TCGA). Согласно некоторым вариантам осуществления рак, поддающийся лечению с помощью композиции согласно настоящему изобретению, выбран из группы, состоящей из адренокортикальной карциномы (АСС), хромофобной почечно-клеточной карциномы (KICH), гепатоклеточной карциномы печени (LIHC), аденокарциномы ободочной и прямой кишки (COAD, READ), аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PAAD), феохромоцитомы и параганглиомы (PCPG), папиллярной карциномы почки (KIRP), аденокарциномы легкого (LUAD), плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSC), аденокарциномы предстательной железы (PRAD), карциномы тела матки (эндометрия) (UCEC), рака шейки матки (CESC), меланомы кожи (SKCM), мезотелиомы (MESO), уротелиального рака мочевого пузыря (BLCA), светлоклеточной карциномы почки (KIRC), плоскоклеточной карциномы легкого (LUSC), карциносаркомы матки (UCS), саркомы (SARC), серозной цистаденокарциномы яичника (OV), папиллярной карциномы щитовидной железы (THCA), мультиформной глиобластомы (GBM), рака молочной железы (BRCA), низкозлокачественной глиомы (LGG) и диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBC). Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Молекулы согласно настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов растворяют, диспергируют или смешивают со вспомогательным веществом, которое, как хорошо известно, является фармацевтически приемлемым и совместимым с активным ингредиентом. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, вода, физиологический раствор, натрий-фосфатный буфер (PBS), декстроза, глицерин, этанол или тому подобное, и их комбинации. Другие подходящие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, при желании композиция может содержать незначительные количества дополнительных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные агенты для регулировки pH.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена вместе с противоопухолевой композицией.

Термин «лечение» в контексте настоящего документа относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже страдает расстройством, а также тех, у кого расстройство необходимо предупредить.

Термины «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь перечисленным, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают меланому, рак легкого, щитовидной железы, молочной железы, ободочной кишки, предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки, шейки матки, поджелудочной железы, лейкоз, лимфому, миелоидный рак, рак яичника, матки, саркому, рак желчных протоков или эндометрия.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения рака включает введение фармацевтической композиции как часть схемы лечения, включающей введение по меньшей мере одного дополнительного противоракового агента.

Согласно некоторым вариантам осуществления противораковый агент выбран из группы, состоящей из антиметаболита, ингибитора митоза, таксана, ингибитора топоизомеразы, ингибитора топоизомеразы II, аспарагиназы, алкилирующего агента, противоопухолевого антибиотика и их комбинаций. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления антиметаболит выбран из группы, состоящей из цитарабина, глударабина, фторурацила, меркаптопурина, метотрексата, тиогуанина, гемцитабина и гидроксимочевины. Согласно некоторым вариантам осуществления ингибитор митоза выбран из группы, состоящей из винкристина, винбластина и винорелбина. Согласно некоторым вариантам осуществления ингибитор топоизомеразы выбран из группы, состоящей из топотекана и иренотекана. Согласно некоторым вариантам осуществления алкилирующий агент выбран из группы, состоящей из бусульфана, кармустина, ломустина, хлорамбуцила, циклофосфамида, цисплатина, карбоплатина, ифосамида, мехлорэтамина, мелфалана, тиотепы, дакарбазина и прокарбазина. Согласно некоторым вариантам осуществления противоопухолевый антибиотик выбран из группы, состоящей из блеомицина, дактиномицина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, митомицина, митоксантрона и пликамицина. Согласно некоторым вариантам осуществления топоизомераза II выбрана из группы, состоящей из этопозида и тенипозида. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления дополнительный противораковый агент выбран из группы, состоящей из бевацизумаба, карбоплатина, циклофосфамида, доксорубицина гидрохлорида, гемцитабина гидрохлорида, топотекана гидрохлорида, тиотепы и их комбинаций. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

Моноклональные антитела согласно настоящему изобретению могут применяться как часть комбинированной терапии по меньшей мере одним противораковым агентом. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный противораковый агент представляет собой иммуномодулятор, активированную лимфоцитарную клетку, ингибитор киназы или химиотерапевтический агент.

Согласно некоторым вариантам осуществления противораковый агент представляет собой иммуномодулятор, как агонист, так и антагонист, такой как антитело к молекуле иммунной контрольной точки.

Блокада иммунных контрольных точек посредством иммунотерапии оказалась новым перспективным средством лечения рака. Пути иммунных контрольных точек состоят из ряда костимулирующих и ингибирующих молекул, которые работают согласованно, поддерживая аутотолерантность и защищая ткани от повреждения иммунной системой в физиологических условиях. Опухоли используют определенные пути контрольных точек, чтобы уклоняться от иммунной системы. Следовательно, ингибирование таких путей стало многообещающей стратегией противоракового лечения.

Антитело ипилимумаб к белку 4, ассоциированному с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4) (одобрено в 2011 г.), было первым иммунотерапевтическим агентом, который продемонстрировал положительные результаты при лечении онкологических больных. Это антитело препятствует ингибирующим сигналам во время презентации антигена Т-клеткам. Антитело пембролизумаб к белку программируемой клеточной смерти 1 (PD-1) (одобрено в 2014 г.) блокирует отрицательную иммунорегуляторную передачу сигналов рецептором PD-1, экспрессируемым Т-клетками. Дополнительный анти-PD-1 агент был подан на одобрение надзорных органов в 2014 году для лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Активные исследования в настоящее время проводятся в отношении множества других иммунных контрольных точек, среди них: CEACAM1, NKG2A, B7-H3, B7-H4, VISTA, CD112R, ген активации лимфоцитов-3 (LAG3), CD137, OX40 (также называемый CD134) и иммуноглобулиноподобные рецепторы клеток-киллеров (KIR).

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления иммуномодулятор выбран из группы, состоящей из антитела, ингибирующего CTLA-4, человеческого белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-1), антитела PD-L1 и PD-L2, активированной цитотоксической лимфоцитарной клетки, агента, активирующего лимфоциты, антитела к CEACAM, антитела к TIGIT и ингибитора сигнального пути RAF/MEK. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления дополнительный иммуномодулятор выбран из mAb к PD-1, mAb к PD-L1, mAb к PD-L2, mAb к CEACAM1, mAb к CTLA-4, mAB к TIGIT, PVR, интерлейкина 2 (ИЛ-2) или лимфокин-активированных киллеров (ЛАК).

Согласно другим вариантам осуществления дополнительный противораковый агент представляет собой химиотерапевтический агент. Химиотерапевтический агент, который может быть введен вместе с антителом согласно настоящему изобретению или отдельно, может включать любой такой агент, известный в данной области техники, проявляющий противоопухолевую активность, включая, не ограничиваясь перечисленным: митоксантрон, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка, являющиеся веретёнными ядами: винбластин, винкристин, винорелбин (таксол), паклитаксел, доцетаксел; алкилирующие агенты: мехлорэтамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, мелфалан, ифосфамид; метотрексат; 6-меркаптопурин; 5-фторурацил, цитарабин, гемцитабин; подофиллотоксины: этопозид, иринотекан, топотекан, дакарбазин; антибиотики: доксорубицин (адриамицин), блеомицин, митомицин; нитрозомочевины: кармустин (BCNU), ломустин, эпирубицин, идарубицин, даунорубицин; неорганические ионы: цисплатин, карбоплатин; интерферон, аспарагиназу; гормоны: тамоксифен, лейпролид, флутамид и мегестрола ацетат.

Согласно некоторым вариантам осуществления химиотерапевтический агент выбран из алкилирующих агентов, антиметаболитов, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пиримидина, аналогов пурина и родственных ингибиторов, алкалоидов барвинка, эпиподофиллотоксинов, антибиотиков, L-аспарагиназы, ингибитора топоизомеразы, интерферонов, координационных комплексов платины, антрацендиона, замещенной мочевины, производных метилгидразина, адренокортикального супрессанта, адренокортикостероидов, прогестинов, эстрогенов, антиэстрогенов, андрогенов, антиандрогенов и аналога гонадотропин-рилизинг-гормона. Согласно еще одному варианту осуществления химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из 5-фторурацила (5-FU), лейковорина (LV), иренотекана, оксалиплатина, капецитабина, паклитаксела и доксетаксела. Могут быть использованы один или несколько химиотерапевтических агентов.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для применения для лечения рака или для применения для усиления иммунного ответа.

Термин «усиление иммунного ответа» относится к увеличению реакции иммунной системы и стимуляции или продлению ее памяти. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может применяться для стимуляции иммунной системы после вакцинации. Таким образом, в одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может применяться для улучшения вакцинации.

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из рака легкого, щитовидной железы, молочной железы, ободочной кишки, меланомы, рака предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки, шейки матки, поджелудочной железы, лейкоза, лимфомы, миелоидного рака, рака яичника, матки, саркомы, рака желчных протоков и рака из клеток эндометрия. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант осуществления изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению, и фармацевтическая композиция, содержащая дополнительный иммуномодулятор или ингибитор киназы, используются для лечения рака путем раздельного введения.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества моноклонального антитела или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены способы лечения заболевания, связанного со сверхэкспрессией нектина-4.

Согласно аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества множества Т-клеток, содержащих молекулу CAR, как описано в настоящем документе.

Термин «эффективное количество» в контексте настоящего документа относится к достаточному количеству моноклонального антитела или фрагмента антитела, которое при введении субъекту будет оказывать предполагаемый терапевтический эффект. Эффективное количество, необходимое для достижения терапевтического конечного результата, может зависеть от ряда факторов, включая, например, конкретный тип опухоли и тяжесть состояния пациента, а также от того, вводится ли комбинация дополнительно с облучением. Эффективное количество (доза) активных агентов в контексте настоящего изобретения должно быть достаточным, чтобы обеспечить полезный терапевтический ответ у субъекта с течением времени, включая, не ограничиваясь перечисленным, ингибирование роста опухоли, снижение скорости роста опухоли, предупреждение роста опухоли и метастазов и повышение выживаемости.

Токсичность и терапевтическая эффективность описанных в настоящем документе композиций могут быть определены с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или подопытных животных, например, путем определения IC50 (концентрации, которая обеспечивает 50% ингибирование) и максимальной переносимой дозы для рассматриваемого соединения. Данные, полученные в результате этих анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при разработке диапазона доз для применения у людей. Дозировка может варьироваться в зависимости, среди прочего, от используемой лекарственной формы, выбранного режима дозирования, состава агентов, используемых для лечения, и используемого способа введения, а также других значимых факторов. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны отдельно взятым лечащим врачом с учетом состояния пациента. В зависимости от тяжести и восприимчивости состояния, подлежащего лечению, введение доз также может представлять собой однократное введение композиции с медленным высвобождением, при этом курс лечения может продолжаться от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не произойдет излечение или не будет достигнуто уменьшение патологического состояния. Количество вводимой композиции, безусловно, будет зависеть от субъекта, подвергаемого лечению, тяжести заболевания, способа введения, заключения лечащего врача и всех прочих значимых факторов.

«Введение» вещества, соединения или агента субъекту может осуществляться с использованием одного из множества методов, известных специалистам в данной области техники. Например, соединение или агент могут быть введены энтерально или парентерально. Энтеральное введение относится к введению через желудочно-кишечный тракт, включая пероральное, сублингвальное или ректальное. Парентеральное введение включает внутривенное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное, окулярное, сублингвальное, интраназальное, ингаляционное, интраспинальное, внутрицеребральное и чрескожное введение (путем всасывания, например, через кожный проток). Соединение или агент также могут быть надлежащим образом введены с помощью перезаряжаемых или биоразлагаемых полимерных устройств или других устройств, например, пластырей и насосов, или препаратов, обеспечивающих пролонгированное, медленное или контролируемое высвобождение соединения или агента. Введение также может проводиться, например, один раз, множество раз и/или в течение одного или более длительных периодов. В некоторых вариантах осуществления введение включает как непосредственное введение, включая самостоятельное введение пациентом, так и непрямое введение, включая действие по назначению лекарственного средства. Например, в контексте настоящего документа лечащий врач, который инструктирует пациента самостоятельно вводить лекарственное средство или получить лекарственное средство путем введения другим лицом, и/или который дает пациенту рецепт на лекарственное средство, вводит лекарственное средство указанному пациенту.

Антитела обычно вводят в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг массы тела пациента, обычно от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг/кг и часто от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг/кг. В этой связи предпочтительно использовать антитела с периодом полувыведения из крови, равным по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 4 дня, более предпочтительно до 21 дня. Ожидается, что химерные антитела будут иметь период полувыведения из крови до 14-21 дней. В некоторых случаях может быть предпочтительным введение большой ударной дозы с последующими периодическими (например, еженедельными) поддерживающими дозами в течение периода лечения. Антитела также могут быть доставлены с помощью систем доставки с медленным высвобождением, насосов и других известных систем доставки для непрерывной инфузии.

Термин «приблизительно» означает, что подразумевается допустимый интервал погрешности, например, до 5% или 10% для конкретного значения.

Диагностика

Настоящее изобретение также относится к способам диагностики и прогнозирования рака.

Согласно аспекту настоящего изобретения предложен способ диагностики и/или прогнозирования рака или инфекционного заболевания у субъекта, включающий стадию определения уровня экспрессии нектина-4 в биологическом образце от указанного субъекта с использованием по меньшей мере одного антитела, как описано в настоящем документе.

Термин «биологический образец» включает в себя множество типов образцов, полученных от организма, которые могут быть использованы в диагностическом или контрольном анализе. Термин включает в себя кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы твердых тканей, такие как биоптат, или полученные из них тканевые культуры или клетки и их потомство. Кроме того, данный термин может включать в себя циркулирующие опухолевые или другие клетки. Термин, в частности, включает в себя клинический образец и, кроме того, включает клетки в клеточной культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, сыворотку, плазму, мочу, околоплодные воды, биологические жидкости, включая внутриглазную жидкость и стекловидное тело в качестве образцов из глаз, а также образцы тканей. Данный термин также включает в себя образцы, с которыми после получения были произведены какие-либо манипуляции, такие как обработка реагентами, солюбилизация или обогащение определенными компонентами.

Определение уровня экспрессии нектина-4 может быть осуществлено с помощью меченого антитела к нектину-4, как описано в настоящем документе. Определение экспрессии может быть осуществлено, например, с помощью ELISA. Способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать стадию сравнения указанного уровня экспрессии с контрольным уровнем.

Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации некоторых вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Методики экспериментов

Авторы ссылаются на следующие примеры, которые вместе с приведенными выше описаниями иллюстрируют изобретение неограничивающим образом.

Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура и лабораторные процедуры, применяемые в настоящем изобретении, включают молекулярные, биохимические, микробиологические, иммунологические методы и методы рекомбинантной ДНК. Такие методы хорошо известны в данной области техники. Для удобства читателя в данном документе приведены другие общие ссылки на общеизвестные процедуры.

Методы

Линии клеток

Использованные линии клеток представляли собой клетки LNCap, JEG3, MCF-7, RAJI, MDA-MD-453, HT1376 и CHO. В некоторых случаях клетки СНО были стабильно трансфицированы нектином-4 яванского макака (Cyno) или мышиным нектином-4. Клетки выращивали при 37°C, влажности >95% и 5% CO₂ в DMEM для всех клеток, кроме клеток RAJI, которые культивировали в RPMI с добавкой 10% термоинактивированной FCS (среда и сыворотка от Sigma-Aldrich).

Проточная цитометрия

Проточную цитометрию проводили с использованием mAb к мышиному нектину-4 (клон 356704). Клетки инкубировали на льду в течение 30 минут с 0,2 мкг mAb на 100 000 клеток. Обнаружение проводили с помощью вторичного козьего антитела, связанного с AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), в течение 30 минут на льду.

В некоторых случаях использовали антитела к нектину-4 в различных концентрациях и инкубировали на льду с клетками-мишенями в течение 30 минут. Обнаружение проводили с помощью вторичных антител, направленных против мышиного или Fc иммуноглобулина человека, связанных с AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут на льду.

Для окрашивания Ig к TIGIT человека или Ig к нектину-1 человека клетки инкубировали на льду в течение 1 часа с 3 мкг Ig к TIGIT на 100 000 клеток. Обнаружение проводили с помощью вторичного антитела против иммуноглобуллина человека Alexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch) в течение 30 минут на льду. Для экспериментов по блокированию клетки предварительно инкубировали с 1 мкг указанного антитела до окрашивания Ig к TIGIT или Ig к нектину-1 человека. В некоторых случаях клетки инкубировали с 8 мкг/мл указанного антитела вместе с Ig к TIGIT человека или Ig к нектину-1 человека (при 20 мкг/мл). Обнаружение связывания лиганда осуществляли с помощью вторичных антител против иммуноглобулина человека с Alexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch).

Анализ проводили с использованием проточных цитометров FACS-Calibur (BD Biosciences) или Cytoflex Becman Coulter и экспресс-программного обеспечения FCS.

Анализ уничтожения

Для оценки цитотоксической активности NK-клеток против клеток-мишеней проводили анализы высвобождения S³⁵, как описано ранее (Mandelboim et al., Exp. Med. 184(3):913–22). NK-клетки выделяли у здоровых доноров с использованием набора для отделения NK-клеток человека EasySep (19055 STEMCELL TECHNOLOGIES) и выращивали с PHA и ИЛ-2. Клетки-мишени инкубировали в течение ночи в среде без метионина с радиоактивным метионином [S³⁵]. Далее клетки промывали и инкубировали на льду с 1 мкг антител на 5000 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали с NK-клетками в течение 5 часов. Высвобождение S³⁵ измеряли с помощью β-счетчика TopCount (Packard). Результаты представлены как: (CPM(образец) - CPM(спонтанное высвобождение)) / (CPM(общее высвобождение) - CPM(спонтанное высвобождение)) X 100, где CPM означает количество импульсов в минуту.

Анализ ADCC

NK-клетки выделяли у здоровых доноров с использованием набора для отделения NK-клеток человека EasySep (19055 STEMCELL TECHNOLOGIES) и выращивали с PHA и ИЛ-2. Клетки-мишени высевали из расчета 2,5×10⁴ клеток на лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном и инкубировали совместно с активированными NK-клетками при соотношении Е:Т, равном 2:1. Инкубацию проводили в присутствии 12 мкг/мл химерных клонов hNec4.05hIgG1 и hNec4.11hIgG1 или контрольного hIgG1. Через два часа NK-клетки анализировали с помощью FACS на предмет экспрессии ими маркера дегрануляции CD107a (Biolegend cat 328619).

Получение CAR-T и функциональный анализ

Одну цепь антитела hNec4.11 клонировали внутри рамки считывания в стеблевую область CD8, за которой следовали TM домен CD28, внутриклеточный домен 41BB и внутриклеточный домен дзета-цепи CD3. Схематическое изображение конструкции CAR-T показано на фиг. 11A. Конструкцию вводили в лентивирусный вектор, содержащий промотор hEf1a (pHAGE2), за которым следовала кассета IRES GFP для контроля эффективности трансдукции. Клетки Jurkat трансдуцировали лентивирусными частицами, кодирующими конструкцию. Эффективность трансдукции была выше 99% (фиг. 11B).

Родительские клетки Jurkat или клетки Jurkat, экспрессирующие конструкцию CAR-T (Jurkat pHAGE2.4.11) (5×10⁴ на лунку), инкубировали с клетками-мишенями HT1376 и MDA-MD-453 при соотношении E:T, равном 1:1, в течение 48 часов. После центрифугирования собирали супернатанты и измеряли уровни ИЛ-2 с использованием набора IL-2 ELISA от Peprotech (№ по каталогу 900-T12) в соответствии с протоколом производителя.

МНПК от здорового донора предварительно активировали в течение 72 часов с использованием активатора CD3/CD28 Т-клеток человека ImmunoCult™ Human CD3/CD28 T Cell Activator в соответствии с протоколом производителя. Клетки трансдуцировали с использованием лентивируса pHAGE2.4.11 согласно Kochenderfer JN et al. (J Immunother. 2009 doi: 10.1097/CJI.0b013e3181ac6138) и проверяли экспрессию по уровням GFP. МНПК CART инкубировали с клетками HT1376 (2,5×10⁴/лунку) в диапазоне различных E:T. Через 48 часов эффекторные клетки удаляли, клетки-мишени трижды промывали и измеряли жизнеспособность с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay в соответствии с протоколом производителя.

Модель опухоли у мышей in vivo

Все эксперименты проводили на самках мышей SCID-beige в возрасте 6–8 недель. Всех мышей содержали в условиях, свободных от специфической патогенной микрофлоры, при нормальных циклах свет/темнота и 22 +/- 2°C в свободном от специфической патогенной микрофлоры помещении Медицинского факультета Еврейского университета (Эйн-Керем, Иерусалим) и в соответствии с рекомендациями комитета по этике. Каждая группа мышей содержала 7 самок (n=7). Ксенотрансплантаты были созданы путем подкожной инъекции указанных клеток в область левого бока. Инъекции антитела к нектину-4, clone.05 и контрольных антител (антитело к мышиному CD3, InVivoMAb-clone 17A2) вводили внутрибрюшинно два раза в неделю. За мышами наблюдали ежедневно. В день окончания анализа (см. подписи к рисункам) всех мышей умерщвляли и регистрировали индивидуальные массы опухолей. Никаких различий между различными группами мышей в их общем состоянии здоровья на исходном уровне не наблюдалось.

Пример 1. Получение и отбор mAb к нектину-4

Технология экспрессии иммуногена (Nec4-Fc) основана на клетках млекопитающих HEK 293T, предпочтительном методе, особенно в случае гликопротеинов, который обеспечивает наилучшее качество, стабильность, растворимость и выход. Белок Nec4-Fc, который представляет собой слитый белок из эктодомена нектина-4 и Fc-домена IgG1 человека, было получен рекомбинантно и очищен следующим образом:

Кодирующая последовательность нектина-4 человека была клонирована в виде слияния с Fc-фрагментом IgG1 человека для получения рекомбинантного Fc-слитого белка. Использовали эктодоменную (внеклеточную) часть молекулы нектина-4 человека, охватывающую остатки с 32 по 349. С-концевой остаток серина в положении 349 аминокислотной последовательности нектина-4 был слит с шарниром тяжелой цепи дегликозилированного Fc (N297A) IgG1 человека, за которым следовали константные области CH2 и CH3. Открытая рамка считывания (ORF) рекомбинантного белка была оптимизирована по кодонам для высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих. Оптимизированная последовательность ДНК была получена службой синтеза GeneArt (Invitrogen) с добавлением фланкирующих последовательностей ДНК, соответствующих сайтам рестрикции EcoRI и NotI, на 5'- и 3'-концах фрагмента ДНК, соответственно. Вектор экспрессии был сконструирован путем двойного расщепления оптимизированного фрагмента ДНК с помощью EcoRI и NotI с последующим его лигированием в pIRESpuro3 (Clontech Laboratories, Inc.). Полученные конструкции трансфицировали в клетки HEK-293T с использованием реагента для трансфекции FuGENE 6 (Roche Diagnostics). Через 48 ч трансфицированные клетки подвергали отбору с антибиотиком с помощью 5 мкг/мл пуромицина (Sigma–Aldrich). Стабильные пулы анализировали на секрецию белка с помощью SDS/PAGE. Супернатанты собирали и очищали на колонке с белком G Poros 20 на станции перфузионной хроматографии высокого давления, BioCAD (PerSeptive Biosystems). Полученный слитый белок иммуногена обозначен как нектин-4-Fc.

Для иммунизации мышам BALB/c инъецировали 50 мкг иммуногена в полном адъюванте Фрейнда (CFA), а затем 50 мкг иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) на 14 день после первой иммунизации. Затем сыворотки анализировали на титр антитела к нектину-4-Fc с помощью ELISA. Мышей с наивысшим титром стимулировали 50 мкг иммуногена в PBS. Через три дня у иммунизированных мышей брали селезенку, и после лизиса эритроцитов спленоциты сливали с линией клеток SP2/0. Потенциальные клетки гибридомы высевали в 20% среду RPMI 1640, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT), для отбора стабильных линий клеток гибридомы. Вышеупомянутую процедуру повторяли дважды, и в общей сложности на секрецию антитела к нектину-Fc были проверены 1034 лунки с помощью ELISA. Затем 30 лунок, в которых их супернатант был положительным на связывание с нектином-4-Fc, покрывающим планшеты для ELISA, были повторно протестированы на их положительность, и параллельно был проведен тест на перекрестную реактивность с нерелевантным Fc-слитым белком. В результате было получено 10 линий клеток гибридомы, которые секретировали антитела, специфически распознающие эктодомен нектина-4. Все эти кандидаты, которые продемонстрировали специфический сигнал в ELISA, были протестированы на их способность распознавать нативный человеческий белок нектин-4 на трансфицированных линиях клеток.

Клетки лимфомы Беркитта RAJI трансфицировали нектином-4 человека и анализировали с помощью FACS для определения связывания пяти указанных клонов гибридомы. Клетки инкубировали с различными клонами, а затем инкубировали с Ig к TIGIT человека и окрашивали вторичным антителом. Значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) FACS-окрашивания показаны на фиг. 2. Как показано, моноклональные антитела, продуцируемые клонами hNec4.01 (клон 1) и hNec4.05 (клон 5), показали наилучшую способность блокировать взаимодействия TIGIT-нектин-4.

Также были проведены аналогичные анализы с использованием линий клеток JEG3 и LNCap, естественным образом экспрессировавших нектин-4, и они дали аналогичные результаты.

Пять антител продемонстрировали положительное окрашивание. 4 из этих 5 были дополнительно отобраны по их изотипу IgG (а не изотипу IgM). Наконец, все 4 оставшихся кандидата продемонстрировали сильную связывающую способность по отношению к нативным молекулам нектина-4 человека, экспрессируемым на поверхности живых клеток, и были повторно протестированы на нескольких нерелевантных слитых белках для отбора антител с нулевой перекрестной реактивностью между нектином-4 и другими лигандами рецепторов иммунных клеток. Однако было показано, что только 2 из них блокируют антитела к нектину-4. Таким образом, были созданы 2 стабильные клональные линии клеток, hNec4.01 и hNec4.05, обе из которых имели изотип каппа-IgG1. Затем было проведено крупномасштабное производство антител и оба моноклональных антитела были очищены из бессывороточной среды с использованием системы жидкостной хроматографии GE AKTA Prime Plus и колонок с белком G HiTrap в количестве нескольких миллиграммов.

Аналогично описанному выше, были идентифицированы дополнительные клоны, из которых клон 11 (hNec4.11) имел наилучшую связывающую и блокирующую способность и, таким образом, был подвергнут скринингу параллельно с hNec4.05, как описано ниже.

На основании вышеупомянутых попыток был сделан вывод, что даже в случае иммуногена, очень похожего на целевой белок нектин-4 (с точки зрения того, что он представлял собой димер, гликозилированный клеточным механизмом млекопитающих и продуцированный в неденатурирующих условиях), вероятность получения линии клеток гибридомы, секретирующей блокирующие антитела к нектину-4, составляет менее 2% (на тысячу).

Пример 2. Аффинность mAb к нектину-4 к нектину-4 человека

Аффинность антител hNec4.01 и hNec4.05 к меченой флуорофором молекуле Ig к нектину-4 человека дополнительно определяли с помощью микромасштабного термофореза (Wienken et al. 2010, Nat. Commun.1:100). Измерения повторяли по меньшей мере с тремя независимыми белковыми препаратами. Как показано на фиг. 3, для обоих антител наблюдались очень высокие аффинности связывания. Для клона hNec4.05 расчетная Kd составляла 272±154 пМ, а для клона hNec4.01 расчетная Kd составляла 107±115 пМ.

Пример 3. Секвенирование mAb к нектину-4

Два клона гибридомы № 0.1 и № 0.5, которые продемонстрировали наилучшее ингибирование связывания нектин-4-TIGIT, были отправлены на секвенирование нуклеотидов и аминокислот.

Методы

Тотальную РНК выделяли из клеток гибридомы, следуя техническому руководству TRIzol® Reagent (Ambion, № по каталогу: 15596-026). Затем тотальную РНК обратно транскрибировали в кДНК с использованием изотип-специфичных антисмысловых праймеров или универсальных праймеров в соответствии с техническим руководством из набора для синтеза первой цепи кДНК PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, № по каталогу: 6110A). Фрагменты антител V_H и V_L были амплифицированы в соответствии со стандартной операционной процедурой (СОП) быстрой амплификации концов кДНК (RACE) GenScript. Фрагменты амплифицированных антител по отдельности клонировали в стандартный клонирующий вектор. Проводили ПЦР для отбора колоний для скрининга клонов со вставками правильного размера. Для каждого фрагмента было секвенировано не менее пяти колоний со вставками правильного размера. Последовательности различных клонов были выровнены, и была предоставлена обобщающая последовательность этих клонов.

Были использованы следующие инструменты для анализа последовательности вариабельных областей иммуноглобулина:

i. Nucleotide BLAST от NCBI;

ii. Программа IMGT/V Quest; и

iii. IgBLAST от NCBI.

Полученные последовательности представляли собой:

Клон hNec4.01:

Последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи, 414 пар оснований (SEQ ID NO: 1):