ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к гену (определяющему иммортализацию гену), вовлеченному в иммортализацию раковых клеток человека, и к способу, применимому для избирательной терапии рака, нацеленной на иммортализованную раковую клетку, обладающую геном. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу распознавания иммортализованной раковой клетки с использованием определяющего иммортализацию гена в качестве показателя и реагента для распознавания. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу для скрининга активного ингредиента избирательного противоракового лекарственного средства (ингибитора роста иммортализованной раковой клетки), нацеленного на иммортализованные раковые клетки, и к противораковому лекарственному средству (ингибитору роста иммортализованной раковой клетки).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пациенты получают плохой прогноз для солидного рака человека, если не проводить радикального хирургического вмешательства. Это в основном происходит из-за недостаточного эффекта современной химиотерапии. Поскольку существующие химиотерапевтические лекарственные средства в основном влияют на биосинтез нуклеиновых кислот, ДНК, микротрубочки и т.д., так как они ингибируют процесс синтеза от нуклеиновой кислоты до белка, они неминуемо разрушают в дополнение к раковым клеткам здоровые клетки, которые находятся в процессе роста. Недавнее исследование идентифицировало ряд молекул, которые специфически экспрессируются в раковых клетках, и ингибиторы, нацеленные на эти специфические молекулы, могут оказывать минимальное неблагоприятное действие на здоровые клетки. Это преимущество позволяет использовать более высокую дозу лекарственного средства. Однако несмотря на его активное развитие, такое нацеленное на молекулу лекарственное средство обладает следующим главным дефектом. Нацеленное на молекулу лекарственное средство не обязательно обещает конкретный эффект для большинства случаев рака; эффект может сильно меняться для каждого случая. Более того, обычно является сложным точно оценить эффект до введения. Такое сильное изменение для нацеленного на молекулу терапевтического лекарственного средства в каждом случае может происходить из-за того факта, что лекарственное средство направлено на молекулы генов, вовлеченных в канцерогенез или метастазирование. Канцерогенез меняется для различных типов рака и даже в пределах одного и того же рака; таким образом предполагают, что эффект, оказываемый молекулами-мишенями на развитие рака, отличается в каждом случае. В противоположность этому развитие нацеленного на молекулу терапевтического лекарственного средства, которое может обладать универсальным эффектом для множества видов рака, должно стать возможным посредством идентификации молекулы, обладающей универсальным и первичным эффектом для различных типов рака.
У всех позвоночных, включая человека, каждый конец хромосомы содержит простую повторяющуюся последовательность: «TTAGGG» (приблизительно 10 т.п.о. у человека и в несколько раз больше у мышей). Эта концевая последовательность не может до конца воспроизводиться при каждой дупликации ДНК при делении клетки и постепенно укорачивается (из расчета приблизительно 200 оснований у человека). Эта концевая часть названа «теломерой». Когда теломера укорачивается до определенной длины (приблизительно 5 т.п.о. в незлокачественных клетках человека) посредством повторяющихся делений клетки, деление клетки в конечном счете прекращается. Деление клетки снова становится возможным посредством злокачественного перерождения клетки, однако затем когда укорачивание в конечном итоге достигает предельного уровня (приблизительно 2 т.п.о.), клетка погибает. Как описано в непатентном документе 1, обратная транскриптаза «теломеразы» служит для удлинения укороченной теломеры для стабилизации длины теломеры, таким образом продлевая предел делений клетки. Поскольку теломераза не экспрессируется в здоровой клетке, деление клетки для здоровой клетки ограничено несколькими десятками раз. Однако теломераза является высокоэкспрессированной как в способной к размножению клетке, так и в и иммортализованной раковой клетке. Все раковые клетки привыкли рассматривать как иммортализованные; однако, опубликованы сообщения, что некоторые виды клинически выраженного рака не обладают активностью теломеразы (см. непатентные документы 2, 3 и т.д.). Опубликованы также другие сообщения, что вынужденная экспрессия ферментного компонента теломеразы TERT в незлокачественной клетке не приводит к получению раковой клетки (см. непатентный документ 4). Соответственно к настоящему времени злокачественное перерождение и иммортализацию рассматривают как различные феномены:
[Непатентный документ 1] Harley CB, Mutation Res, 256: 271-82, 1991
[Непатентный документ 2] Kim NW et al., Science 266: 2011-5, 1994
[Непатентный документ 3] Hiyama K et al., J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995
[Непатентный документ 4] Morales CP et al., Nat Genet 21: 115-8, 1999
[Непатентный документ 5] Shay JW, Bacchetti S, Eur J Cancer 33: 787-91, 1997
[Непатентный документ 6] Hiyama K et al., J Immunol 155: 3711-5, 1995
[Непатентный документ 7] Hiyama E et al., Int J Oncol 9: 453-8, 1996
[Непатентный документ 8] Forsyth NR et al., Aging Cell 2: 235-43, 2003
[Непатентный документ 9] Bodnar AG et al., Exp Cell Res 228: 58-64, 1996
[Непатентный документ 10] Hiyama K et al., Int J Oncol 27: 87-95, 2005
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Настоящее изобретение относится к способу распознавания иммортализованной раковой клетки и к реагенту, применяемому для распознавания. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу скрининга активного ингредиента для ингибитора роста иммортализованной раковой клетки, который является применимым в качестве избирательного противоракового лекарственного средства благодаря его эффекту специфической супрессии роста иммортализованной раковой клетки; и к ингибитору роста иммортализованной раковой клетки.
Техническое решение
Чтобы разработать нацеленное на молекулу терапевтическое лекарственное средство, которое является эффективным для лечения рака, особенно лекарственное средство, которое, как ожидают, обладает универсальным эффектом для многих типов рака, авторы настоящего изобретения сфокусировали свое внимание на другом признаке рака - «иммортализации», который отличается от «перерождения в рак (злокачественного изменения)». Конкретно, даже если раковые клетки обнаружены, они не будут распространяться или метастазировать, чтобы погубить хозяина, если их неограниченный рост можно остановить. Супрессия неограниченного роста также увеличивает возможность естественной смерти раковых клеток, при условии, что число оставшихся раковых клеток снижено до некоторой степени посредством химиотерапии или нерадикального хирургического вмешательства, поскольку ожидают, что время деления раковой клетки будет истекать до начала роста следующей клетки. Опубликовано, что эту экспрессию теломеразы наблюдали в 80% или более из нескольких тысяч клинических образцов (см. Непатентный документ 5); экспрессию теломеразы подтверждали при различных типах рака, исследованных до настоящего времени; а также экспрессию теломеразы наблюдали в большинстве штаммов клеток, происходящих из видов рака человека (см. Непатентный документ 2). На основании этих сообщений и известного факта, что раковые клетки с экспрессией теломеразы никогда естественным образом не станут отрицательными снова, феномен иммортализации, по-видимому, существует как универсальный и широко распространенный во многих раковых клетках, в отличие от большого разнообразия канцерогенеза. Соответственно посредством нацеливания на молекулу, которая регулирует иммортализацию, становится возможным супрессировать неограниченный раковый рост с универсальным эффектом для многих типов рака. На основании этого принципа тестировали противораковую стратегию, сфокусированную непосредственно на теломеразе.
Однако авторы настоящего изобретения уже обнаружили, что клетка-предшественник, лимфоцит и т.д., из регенерирующего органа обладает активацией теломеразы даже в нормальной здоровой клетке (см. Непатентные документы 6 и 7). Также известно, что иммортализация клеток не всегда является индуцированной вынужденной экспрессией TERT (ферментный компонент теломеразы) в незлокачественных клетках (см. Непатентный документ 8); и что здоровая клетка-предшественник или лимфоцит, экспрессирующие теломеразу, не являются иммортализованными, но обладают увеличенным временем жизни (см. Непатентные документы 6 и 9). Соответственно такое обнаружение активации теломеразы в здоровых клетках, очевидно, представляет собой просто экспрессию теломеразы, а не иммортализацию клетки. Более конкретно, хотя иммортализация клетки человека по существу требует активации фермента теломеразы, который служит для удлинения теломеры на конце хромосомы, иммортализация является индуцированной не только активацией теломеразы, но также присутствием специфических молекул для иммортализации. Молекулы, по-видимому, функционируют, в частности, в раковых клетках. Фактически, авторы настоящего изобретения подтвердили, что ген, который подвергается специфической экспрессии и изменению в клоне, который был иммортализован вынужденной экспрессией теломеразы посредством введения TERT в здоровые клетки, полностью отличается от опубликованных экспрессии и изменений, наблюдаемых в раковых клетках (см. Непатентный документ 10). Существует другой факт, показывающий, что ген, вовлеченный в иммортализацию здоровых клеток, отличается от гена, вовлеченного в иммортализацию раковых клеток. Если лекарственное средство направлено на теломеразу, оно супрессирует способность к делению лимфоцита, клетки-предшественника крови, клетки крипт слизистой оболочки кишечника и т.д., и таким образом проявляет тенденцию нарушать иммунность, кроветворную способность и функционирование желудочно-кишечного тракта, что, как известно, является неисправимым вредом при лечении рака. Однако если лекарственное средство направлено на определяющий иммортализацию фактор, который действует только в раковых клетках, становится возможным блокировать специфическую неограниченную пролиферацию раковых клеток без разрушения здоровых клеток организма/клеток-предшественников, обладающих активностью теломеразы.
На основании этой теории авторы настоящего изобретения провели интенсивное исследование для обнаружения генов, которые являются универсально вовлеченными в иммортализацию раковых клеток человека. В результате исследования авторы настоящего изобретения в конечном итоге поняли, что эти гены не являются вовлеченными в увеличение продолжительности жизни клеток в результате активации теломеразы в здоровых клетках, но являются специфически вовлеченными в постоянную пролиферацию раковых клеток. Затем авторы изобретения идентифицировали тринадцать определяющих иммортализацию генов (Таблица 1) следующим образом. Сначала гены с универсальной экспрессией и усилением в различных типах рака выделяли анализом на микрочипах. Среди полученных генов выбрали тринадцать видов генов на основании их более сильной экспрессии в органе с клиническим раком, состоящем из иммортализованных раковых клеток, чем экспрессия в раковой ткани, состоящей из неиммортализованных раковых клеток и на основании того, что они не подвергаются экспрессии или повышению уровня в здоровых клетках, экспрессирующих теломеразу посредством ее введения. Затем авторы изобретения подтвердили, что супрессия экспрессии тринадцати генов с использованием миРНК супрессирует пролиферацию иммортализованных раковых клеток.
Далее авторы настоящего изобретения провели более подробное исследование на основании вышеуказанной теории и в конечном итоге завершили настоящее изобретение. Конкретно настоящее изобретение включает в себя следующие формы.
Пункт 1. Маркерный ген для определения иммортализации раковой клетки, причем маркерный ген содержит полинуклеотид, обладающий последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований, которая специфически гибридизуется с непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований внутри любой из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:1-13.
Пункт 2. Маркерный ген по пункту 1, где маркерный ген представляет собой зонд или праймер.
Пункт 3. Способ определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя стадии:
(1) связывания маркерного гена по п.1 или 2 с РНК, приготовленной из биологического образца, который является выделенным из тестируемого субъекта и который может содержать раковую клетку, или с производным РНК;
(2) измерения количества РНК или производного, связанных с маркерным геном, с использованием маркерного гена в качестве показателя; и
(3) сравнения количества РНК или ее производного, обнаруженных на стадии (2) (в общем обозначаемого как «количество РНК» здесь и далее), с количеством (в общем обозначаемым как «сравнительное количество РНК» здесь и далее) соответствующей РНК или ее производного в неиммортализованной здоровой или раковой клетке.
Пункт 4. Способ определения иммортализованной раковой клетки по пункту 3, дополнительно включающий в себя стадию:
(4) определения, что раковая клетка тестируемого субъекта является иммортализованной, когда количество РНК, обнаруженное на стадии (2), выше, чем сравнительное количество РНК, и определения, что раковая клетка тестируемого субъекта не является иммортализованной, когда количество РНК, обнаруженное на стадии (2), не превышает сравнительное количество РНК.
Пункт 5. Антитело для распознавания полипептида, обладающего любой из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:14-26. Антитело является пригодным для применения для определения иммортализованной раковой клетки.
Пункт 6. Способ определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя стадии:
(1') связывания содержащей белок фракции, содержащей полипептид, полученной из биологического образца, который является выделенным из тестируемого субъекта и который может содержать раковую клетку с антителом по пункту 5;
(2') измерения количества полипептида, связанного с антителом, с использованием антитела в качестве показателя; и
(3') сравнения количества (в общем обозначаемого как «количество полипептида» - здесь и далее) полипептида, обнаруженного на стадии (2'), с количеством (в общем обозначаемым как «сравнительное количество полипептида» - здесь и далее) соответствующего полипептида в неиммортализованной здоровой или раковой клетке.
Пункт 7. Способ определения иммортализованной раковой клетки по пункту 6, дополнительно включающий в себя стадию:
(4') определения, что раковая клетка тестируемого субъекта является иммортализованной, когда количество полипептида, обнаруженного на стадии (2'), выше, чем сравнительное количество полипептида, и определения, что раковая клетка тестируемого субъекта не является иммортализованной, когда количество полипептида, обнаруженное на стадии (2'), не превышает сравнительное количество полипептида.
Пункт 8. Набор реагентов для определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя, по меньшей мере, один член, выбранный из группы, состоящей из маркерного гена по пункту 1 и антитела по пункту 5.
Пункт 9. Способ скрининга вещества на супрессию пролиферации иммортализованных раковых клеток, включающий в себя стадии:
(A) приведения тестируемого материала в контакт с клеткой, которая может экспрессировать один из определяющих иммортализацию генов, представленных SEQ ID NO:1-13;
(B) измерения уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена в клетке, приведенной в контакт с тестируемым материалом;
(C) сравнения уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена, обнаруженного на стадии (B), с уровнем экспрессии (в общем обозначаемым как «сравнительный уровень экспрессии» - здесь и далее) определяющего иммортализацию гена в клетке, не находящейся в контакте с тестируемым материалом; и
(D) выбора тестируемого материала в качестве вещества-кандидата для супрессии пролиферации иммортализованных раковых клеток, когда уровень экспрессии, обнаруженный на стадии (B), ниже, чем сравнительный уровень экспрессии.
Пункт 10. Способ скрининга вещества на супрессию пролиферации иммортализованных раковых клеток, включающий в себя стадии:
(A') приведения тестируемого материала в контакт с полипептидом, обладающим одной из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:14-26;
(B') измерения активности полипептида, обладающего одной из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:14-26, приведенного в контакт с тестируемым материалом;
(C') определения степени активности полипептида, обнаруженной на стадии (B'), путем сравнения активности полипептида, обнаруженной на стадии (B'), с активностью (в общем обозначаемой как «сравнительная активность» - здесь и далее) полипептида, не находящегося в контакте с тестируемым материалом; и
(D') выбора тестируемого материала в качестве вещества-кандидата для супрессии пролиферации иммортализованных раковых клеток, когда активность полипептида, обнаруженная на стадии (B'), ниже, чем сравнительная активность.
Пункт 11. Ингибитор роста иммортализованной раковой клетки, содержащий в качестве активного ингредиента полинуклеотид, обладающий последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований, которая специфически гибридизуется с непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований внутри любой из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:1-13.
Пункт 12. Ингибитор роста иммортализованной раковой клетки по пункту 11, где полинуклеотид обладает одной из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:27-76.
Пункт 13. Способ противоракового лечения, включающий в себя стадию введения ингибитора роста иммортализованной раковой клетки по пункту 11 или 12 в раковые клетки пациента.
Пункт 14. Применение полинуклеотида, обладающего последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований, которая специфически гибридизуется с непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований внутри одной из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:1-13, для получения ингибитора роста иммортализованной раковой клетки.
Пункт 15. Применение по пункту 14, где полинуклеотид обладает одной из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:27-76.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
По настоящему изобретению выявили гены, которые универсальным образом определяют иммортализацию многих различных раковых клеток. Гены обладают специфически повышенной экспрессией в иммортализованных раковых клетках при множестве видов рака. Настоящее изобретение относится к способу распознавания иммортализованных раковых клеток и к реагенту, который применяют для способа распознавания, который позволяет измерение уровня экспрессии определяющих иммортализацию генов. По отношению к измеренному уровню становится возможным отличить иммортализованные раковые клетки от клеток с ограниченным числом делений. Это разделение никогда не являлось возможным при общепринятых общих патологических диагнозах. Таким образом разделение обладает большим потенциалом для клинического применения, которое является применимым для ранней диагностики, новых возможностей лечения, прогнозирования и т.п. для различных видов рака.
Кроме того, с помощью способа скрининга, нацеленного на определяющий иммортализацию ген, по настоящему изобретению получают активный ингредиент противоракового лекарственного средства, специфически супрессирующего пролиферацию иммортализованных раковых клеток.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
(I) Определяющий иммортализацию ген
По настоящему изобретению термин «неиммортализованные раковые клетки» относится, среди раковых клеток вообще, к клеткам с ограниченным числом делений, обладающим (1) отсутствием активации теломеразы, (2) сниженной длиной теломеры и (3) не поддающейся детекции экспрессией белка теломеразы. Кроме того, по настоящему изобретению термин «иммортализованная раковая клетка» относится к клетке, в которой отсутствует по меньшей мере одно из вышеупомянутых условий; более конкретно, к клетке, обладающей активацией теломеразы, к клетке, обладающей увеличенной длиной теломеры, и/или к клетке с поддающейся детекции экспрессией белка теломеразы. Такая «иммортализованная раковая клетка» является способной к неограниченной пролиферации клетки.
По настоящему изобретению термин «определяющий иммортализацию ген» относится к гену, который определяет иммортализацию раковых клеток.
Настоящее изобретение не ограничивает конкретно тип раковой клетки в качестве мишени и относится к клеткам, происходящим, например, из рака легкого, рака молочной железы, рака пищевода, рака головы и шеи, рака желудка, рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака печени, рака желчного пузыря и желчных протоков, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы или карциномы шейки матки.
Определяющими иммортализацию генами являются конкретно (1) ген UBE2S, (2) ген RFC4, (3) ген PTGES2, (4) ген MAF1, (5) ген ACVR2B, (6) ген FAM119A, (7) ген LTB4DH, (8) ген DPM2, (9) ген SEPX1, (10) ген PSMA3, (11) ген CHCHD3, (12) ген LSM3 и (13) ген GTSE1. В таблице 1 показаны регистрационный номер в GenBank, официальное наименование гена и символ гена, и SEQ ID NO:, обозначающие последовательности оснований генов. В таблице 1 наименование гена, символ гена и т.д. основаны на данных NCBI, описанных в Интернет (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
(D49387, BQ214856)
Как показано в примере 1, перечисленные выше определяющие иммортализацию гены все являются высокоэкспрессированными в иммортализованных раковых клетках, полученных из множества видов рака, включая рак легкого, рак пищевода и рак молочной железы. Как показано в примере 2, когда экспрессию этих тринадцати генов супрессировали посредством миРНК в иммортализованных раковых клетках, в каждом случае пролиферация иммортализованных раковых клеток являлась супрессированной. Это показывает, что тринадцать определяющих иммортализацию генов определяют иммортализацию раковых клеток (определяющий иммортализацию ген).
(II) Реагент для оценки иммортализации раковых клеток (маркерный ген)
Как описано выше, определяющие иммортализацию гены ((1)-(13)), обладающие последовательностями оснований, представленными SEQ ID NO:1-13, все обладают сильной экспрессией, специфической для иммортализованных раковых клеток. Таким образом, с использованием тринадцати генов в качестве маркерных генов можно оценивать иммортализацию/смертность раковых клеток.
Настоящее изобретение относится к определяющему иммортализацию маркерному гену (сокращенному как «маркерный ген» по настоящему изобретению) в качестве средства (реагента), которое подходящим образом используют для оценки иммортализации раковых клеток. Маркерный ген конструируют как полинуклеотид по меньшей мере из 15 оснований, который специфически гибридизуется с непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований среди одной из последовательностей оснований, определяющих иммортализацию генов, представленных SEQ ID NO:1-13. Маркерный ген по настоящему изобретению может обладать произвольной формой в соответствии с объектом и может представлять собой любое из одноцепочечной ДНК, одноцепочечной РНК, двухцепочечной ДНК, двухцепочечной РНК и гибрида ДНК:РНК.
Маркерный ген содержит зонд или праймер, применимый для детекции возникновения экспрессии определяющего иммортализацию гена и/или уровня (уровня экспрессии) в раковых клетках, чтобы позволять распознавание иммортализованных раковых клеток. Кроме того, проба или праймер является также применимой в качестве средства (реагента для детекции) для детекции изменения экспрессии определяющего иммортализацию гена для скрининга материала, супрессирующего пролиферацию иммортализованных раковых клеток.
(II-1) Зонд
Иммортализацию раковых клеток распознают посредством детекции по меньшей мере одного из вышеупомянутых определяющих иммортализацию генов: (1) гена UBE2S, (2) гена RFC4, (3) гена PTGES2 и (4) гена MAF1, (5) гена ACVR2B, (6) гена FAM119A, (7) гена LTB4DH, (8) гена DPM2, (9) гена SEPX1, (10) гена PSMA3, (11) гена CHCHD3, (12) гена LSM3 и (13) гена GTSE1, которые обладают сильной экспрессией, специфической для иммортализованных раковых клеток.
При детекции определяющих иммортализацию генов в качестве зондов используют полинуклеотиды, каждый из которых специфически гибридизуется с последовательностью оснований одного из вышеупомянутых определяющих иммортализацию генов. По настоящему изобретению олигонуклеотид, обладающий последовательностями множества оснований, включен в разряд «полинуклеотид».
Каждый полинуклеотид сконструирован, чтобы специфически гибридизоваться с непрерывной последовательностью оснований одного из определяющих иммортализацию генов. Более конкретно, для каждого из вышеупомянутых определяющих иммортализацию генов соответствующий полинуклеотид специфически гибридизуется с непрерывными основаниями, по меньшей мере, 15 основаниями, предпочтительно, 20 основаниями, и более предпочтительно, 30 основаниями из общей длины оснований определяющего иммортализацию гена. Соответственно каждый полинуклеотид обладает длиной в основаниях, соответствующей определенной длине в основаниях.
На протяжении настоящего описания и формулы изобретения «специфическая гибридизация» относится к гибридизации, где образуется только специфический гибрид и не образуется неспецифического гибрида в строгих условиях гибридизации. Строгие условия гибридизации определяют обычным образом, например, на основании температуры плавления (Tm) нуклеиновой кислоты, при которой образуется гибрид. Типичные условия отмывки для обеспечения состояния гибридизации представляют собой приблизительно «1×SSC, 0,1% SDS, 37°C», более строгие «0,5×SSC, 0,1% SDS, 42°C», и еще более строгие «0,1×SSC, 0,1% SDS, 65°C».
Полинуклеотид (зонд) предпочтительно обладает последовательностью оснований, которая является комплементарной непрерывной последовательности, по меньшей мере, из 15 оснований из определяющего иммортализацию гена; однако зонд не всегда должен являться полностью комплементарным указанной непрерывной последовательности оснований, при условии, что специфическая гибридизация является возможной. Полинуклеотид обладает идентичностью, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, не менее, чем 80%, более предпочтительно, не менее, чем 90%, еще более предпочтительно, не менее, чем 95%, и еще более предпочтительно, не менее, чем 98%, по отношению либо к полинуклеотиду, обладающему непрерывными основаниями по меньшей мере из 15 оснований внутри последовательности оснований определяющего иммортализацию гена, либо к комплементарному ему полинуклеотиду. Идентичность каждой последовательности оснований можно вычислить посредством поиска идентичности, программы выравнивания, BLAST, FASTA, ClustalW или подобных.
Примеры зондов, подходящих по настоящему изобретению, включают в себя олигонуклеотиды и полинуклеотиды, обладающие непрерывной последовательностью из 15 оснований, предпочтительно, 20 оснований, и более предпочтительно, 30 оснований из определяющего иммортализацию гена, который гибридизуется по меньшей мере с одним полинуклеотидом (однако когда полинуклеотид представляет собой РНК, основание «t» в последовательности заменено на «u»), выбранные из группы, состоящей из следующего (1)-(13):
(1) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:1) гена UBE2S.
(2) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:2) гена RFC4.
(3) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:3) гена PTGES2.
(4) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:4) гена MAF1.
(5) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:5) гена ACVR2B.
(6) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:6) гена FAM119A.
(7) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:7) гена LTB4DH.
(8) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:8) гена DPM2.
(9) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:9) гена SEPX1.
(10) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:10) гена PSMA3.
(11) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:11) гена CHCHD3.
(12) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:12) гена LSM3.
(13) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:13) гена GTSE1.
Эти полинуклеотиды (зонды) можно получать известным способом, например, с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеотидов, на основании последовательности оснований - мишени из определяющего иммортализацию гена. Полинуклеотиды (зонды) можно получать также способом ПЦР с использованием последовательности оснований - мишени из определяющего иммортализацию гена в качестве матрицы.
Более предпочтительно, для упрощения детекции определяющих иммортализацию генов каждый зонд можно метить радиоактивным материалом, флуоресцентным материалом, химическим люминесцентным веществом или ферментом (описанными позднее более подробно).
Кроме того, каждый зонд можно иммобилизовать на любой твердой фазе перед использованием.
Соответственно зонды, подходящие для настоящего изобретения, включают в себя зонд, в котором вышеупомянутый полинуклеотид иммобилизован на твердой фазе (например, иммобилизованный зонд, включая генный чип, микрочип кДНК, чип олиго-ДНК, или мембранный фильтр). Этот зонд является пригодным для чипа ДНК для использования для детекции определяющего иммортализацию гена, или более конкретно, для использования для детекции иммортализованной раковой клетки.
Твердая фаза иммобилизованного зонда (полинуклеотида) не является конкретно ограниченной, при условии, что она иммобилизует полинуклеотид. Примеры твердых фаз включают в себя стеклянную пластину, нейлоновую мембрану, микробусины, кремниевый кристалл, капилляр и другие субстраты. Полинуклеотид можно иммобилизовать на твердой фазе посредством размещения синтетического полинуклеотида на твердой фазе или посредством синтеза полинуклеотида - мишени на твердой фазе. Иммобилизация представляет собой хорошо известный способ в данной области, и можно использовать любой подходящий способ в соответствии с типом иммобилизованного зонда. Например, коммерчески доступное устройство для печати чипов (изготовленное Cosmobio Co., Ltd. и т.д.) часто используют для получения микрочипа ДНК. (Например, синтез полинуклеотида in situ с использованием фотолитографического способа (AFFYMETRIX CO.), или способ распыления (ROSETTA INPHARMATICS CO.)
(II-2) Праймер
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду в качестве праймера, который служит маркерным геном для специфической амплификации области последовательности оснований каждого определяющего иммортализацию гена.
Полинуклеотид, как правило, представляет собой полинуклеотид, который обладает непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований, предпочтительно, 15-100 оснований, более предпочтительно, 15-50 оснований, еще более предпочтительно, 15-35 оснований, и который специфически гибридизуется с частью по меньшей мере одного полинуклеотида (однако когда полинуклеотид представляет собой РНК, основание «t» в последовательности заменено на «u»), выбранного из группы, состоящей из следующего (1)-(13), так чтобы амплифицировать часть полинуклеотида или весь полинуклеотид:
(1) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:1) гена UBE2S.
(2) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:2) гена RFC4.
(3) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:3) гена PTGES2.
(4) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:4) гена MAF1.
(5) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:5) гена ACVR2B.
(6) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:6) гена FAM119A.
(7) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:7) гена LTB4DH.
(8) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:8) гена DPM2.
(9) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:9) гена SEPX1.
(10) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:10) гена PSMA3.
(11) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:11) гена CHCHD3.
(12) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:12) гена LSM3.
(13) Полинуклеотид с непрерывной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 15 основаниями из последовательности оснований (SEQ ID NO:13) гена GTSE1.
Как и в случае зонда, каждый из определенных полинуклеотидов (праймеров) предпочтительно обладает последовательностью оснований, комплементарной непрерывной последовательности, по меньшей мере, из 15 оснований в одном из определяющих иммортализацию генов; однако пока возможна специфическая гибридизация, он не должен являться полностью комплементарным. Полинуклеотид обладает идентичностью по меньшей мере 70%, предпочтительно, не менее, чем 80%, более предпочтительно, не менее чем 90%, еще более предпочтительно, не менее чем 95%, и еще более предпочтительно, не менее чем 98%, по отношению либо к полинуклеотиду, обладающему непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований внутри последовательности определяющего иммортализацию гена или комплементарного ему полинуклеотида.
Как и в случае зондов, эти полинуклеотиды (праймеры) можно получать известным способом, например, с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеотидов на основании последовательности оснований - мишени из определяющего иммортализацию гена.
(II-3) Маркер
Маркерный ген (зонд или праймер) в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой продукт, полученный добавлением маркера, подходящего для детекции определяющего иммортализацию гена, такого как флуоресцентный краситель, фермент, белок, радиоактивный изотоп, химическое люминесцентное вещество или биотин, к вышеупомянутому полинуклеотиду.
Например, подходящим примером маркера по настоящему изобретению, изготовленного из флуоресцентного красителя, радиоактивного изотопа, или химического люминесцентного вещества, является обычный маркер, способный метить нуклеотид для детекции или определения количества нуклеиновых кислот. Флуоресцентные красители включают в себя в качестве неограничивающих примеров HEX (4,7,2',4',5',7'-гексахлор-6-карбоксилфлуоресцеин, зеленый флуоресцентный краситель), флуоресцеин, NED (название продукта; Applied Biosystems Inc., желтый флуоресцентный краситель), 6-FAM (название продукта; Applied Biosystems Inc, желто-зеленый флуоресцентный краситель) и родамин или его производное (например, тетраметилродамин (TMR)). Флуоресцентное цветное мечение нуклеотида выполняют подходящим способом из известных способов (см. Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)). Можно использовать также коммерчески доступный набор с флуоресцентной меткой (например, система мечения олигонуклеотида ECL 3'-олиго, изготовленная Amersham Pharmacia Biotech).
Описанный выше маркерный ген (немеченый или меченый зонд или праймер) можно использовать в качестве реагента для детекции определяющего иммортализацию гена, иными словами, реагента для детекции иммортализованной раковой клетки.
(II-4) Набор реагентов для детекции иммортализованной раковой клетки
Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору с реагентом (маркерный ген (меченый или немеченый зонд или праймер)) для детекции иммортализованной раковой клетки. Набор включает в себя по меньшей мере один из вышеупомянутых немеченых или меченых полинуклеотидов, применяемых в качестве зондов или праймеров (полинуклеотид может являться иммобилизованным на твердой фазе). В дополнение к маркерному гену (зонду или праймеру) набор реагентов по настоящему изобретению может включать в себя другие реагенты или средства, как необходимо в ходе фактического осуществления (описанного позже) способа по настоящему изобретению, такие как реагент для гибридизации, материал для мечения зонда, средство для детекции метки, буферный раствор и т.д.
(III) Способ определения иммортализованных раковых клеток
(III-1) Маркерный ген (зонд или праймер) по настоящему изобретению позволяет измерение уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена (маркерного гена) в раковых клетках, полученных из тестируемого субъекта; далее измеренный уровень экспрессии позволяет оценить, являются ли раковые клетки «иммортализованными раковыми клетками» или «неиммортализованными раковыми клетками». Существующими патологическими диагнозами нельзя определить иммортализованные раковые клетки; однако способом определения иммортализованной раковой клетки по настоящему изобретению можно детектировать раннюю стадию зарождения иммортализованных раковых клеток даже до их развития, таким образом позволяя быстрое обеспечение подходящего лечения рака для каждого индивидуума.
В этом случае праймер и зонд по настоящему изобретению используют в качестве праймера для специфического распознавания и амплификации РНК, образующейся в результате экспрессии определяющего иммортализацию гена или полинуклеотида, полученного с РНК (например, кДНК), и в качестве зонда для специфической детекции РНК или полинуклеотида (например, кДНК, ДНК, амплифицированной с РНК или кДНК), производного от РНК соответственно.
Более конкретно, маркерный ген (праймер или зонд) по настоящему изобретению можно использовать в качестве праймера и/или зонда для специфической детекции определяющего иммортализацию гена с использованием известного способа для специфической детекции конкретного гена, такого как способ нозерн-блоттинга, способ ОТ-ПЦР, способ гибридизации in situ или т.п. Кроме того, детекцию и/или количественное определение уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена в раковой клетке можно осуществлять с использованием чипа ДНК. В этом случае зонд по настоящему изобретению можно использовать в качестве зонда для чипа ДНК.
Например, измерение уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена посредством нозерн-блоттинга можно осуществлять с помощью зонда по настоящему изобретению или более предпочтительно посредством зонда, меченного радиоактивным изотопом, флуоресцентным материалом или химическим люминесцентным веществом. Более конкретно, РНК, выделенную из раковой клетки тестируемого субъекта, переносят на нейлоновую мембрану или т.п., и меченый зонд гибридизуют с РНК. Затем количество полученного двухцепочечного продукта зонда и РНК измеряют на основании сигнала, полученного от маркера зонда. Детекцию сигнала можно осуществлять посредством подходящего известного аппарата, соответствующего маркеру зонда, такого как детектор радиоактивности или детектор флуоресценции. Детекцию можно осуществлять также с помощью коммерчески доступного набора реагентов для нозерн-блоттинга согласно протоколу из набора.
Измерение уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена с использованием способа ОТ-ПЦР можно также осуществлять с использованием праймера по настоящему изобретению, предпочтительно, праймера, меченного радиоактивным изотопом, флуоресцентным материалом, химическим люминесцентным веществом или т.п. Более конкретно, пару праймеров, снабженных маркером, гибридизуют с кДНК-матрицей, полученной по РНК, происходящей из раковой клетки тестируемого субъекта, и ПЦР проводят общепринятым способом. Затем количество полученной амплифицированной двухцепочечной ДНК измеряют на основании сигнала, полученного от маркера праймера. Детекцию сигнала можно осуществлять посредством подходящего известного аппарата, такого как детектор радиоактивности или детектор флуоресценции. Детекцию можно проводить также с помощью коммерчески доступного набора реагентов для ОТ-ПЦР согласно протоколу из набора.
Измерение уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена с использованием анализа чипа ДНК также можно осуществлять с использованием зонда по настоящему изобретению, предпочтительно зонда, меченного радиоактивным изотопом, флуоресцентным материалом и т.д. Более конкретно, чип ДНК с зондом, меченным радиоактивным изотопом, флуоресцентным материалом, химическим люминесцентным веществом или т.п., фиксируют на подходящем носителе. Затем чип ДНК гибридизуют со снабженными маркерами ДНК или РНК, которые получают из РНК, происходящей из раковой клетки тестируемого субъекта. Затем количество полученного двухцепочечного продукта зонда и снабженной маркером ДНК или РНК измеряют на основании сигнала, полученного от маркера зонда. Детекцию сигнала можно осуществлять посредством подходящего известного аппарата, такого как детектор радиоактивности или детектор флуоресценции. Этот способ можно осуществлять с помощью коммерчески доступного чипа ДНК, в котором ДНК, соответствующая зонду по настоящему изобретению, является фиксированной.
Измерение уровня экспрессии определяющих иммортализацию генов включает в себя две следующие стадии (1) и (2):
(1) стадию связывания зонда или праймера по настоящему изобретению с РНК, полученной из биологического образца, который может содержать раковую клетку, полученного из тестируемого субъекта, или с производным РНК; и
(2) стадию измерения количества РНК или ее производного, связавшегося с зондом или праймером, с использованием зонда или праймера в качестве показателя.
На стадии (1) биологический образец может представлять собой любой образец, выделенный из тестируемого субъекта, при условии, что он обладает возможностью содержать раковую клетку. Примеры биологического образца включают в себя жидкость организма (кровь, мочу и т.д.), ткани, или их экстракты и культуры полученных тканей. Выделение биологического образца из тестируемого объекта осуществляют подходящим способом в соответствии с типом биологического образца или типом рака. Получение РНК из биологического образца осуществляют известным способом.
На протяжении описания и формулы изобретения термин «производное РНК» относится к образцу, полученному посредством РНК, выделенной из биологического образца. Примеры производного РНК включают в себя комплементарный полинуклеотид (кДНК), полученный транскрипцией РНК, и ДНК, амплифицированную по РНК или кДНК с использованием ПЦР. кДНК можно получать с использованием известного способа, и вышеупомянутую ДНК получают посредством ПЦР с использованием праймера по настоящему изобретению для определяющего иммортализацию гена. Кроме того, зонд или праймер по настоящему изобретению, применяемый на стадии (1), предпочтительно является меченным маркером, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентный материал или химическое люминесцентное вещество.
Количество РНК или производного РНК, обнаруженное на стадии (2), зависит от уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена у тестируемого субъекта. Соответственно это количество РНК или производного РНК (далее здесь в полном объеме обозначенное как «количество РНК»), обнаруженное на стадии (2), сравнивают с количеством соответствующей РНК или производного РНК (далее здесь в полном объеме обозначенное как «сравнительное количество РНК») в неиммортализованных здоровых или раковых клетках для оценки иммортализации раковых клеток тестируемого субъекта. Более конкретно, если количество РНК тестируемого субъекта, обнаруженное на стадии (2), больше, чем сравнительное количество РНК, заключают, что раковые клетки тестируемого субъекта являются иммортализованными. В обратном случае заключают, что раковые клетки тестируемого субъекта не являются иммортализованными.
Таким образом, в дополнение к стадиям (1) и (2) способ определения иммортализованной раковой клетки по настоящему изобретению дополнительно включает в себя следующую стадию (3) и предпочтительно также стадию (4).
(3) стадия сравнения количества РНК или производного РНК (количество РНК), обнаруженного на стадии (2), с количеством соответствующей РНК или производного РНК (сравнительное количество РНК) в неиммортализованной здоровой или раковой клетке; и
(4) стадия заключения того, что выделенная раковая клетка тестируемого субъекта является иммортализованной, когда количество РНК на стадии (2) выше, чем сравнительное количество РНК, и заключения того, что выделенная раковая клетка тестируемого субъекта не является иммортализованной, когда количество РНК на стадии (2) не превышает сравнительное количество РНК.
Количество РНК (сравнительное количество РНК) определяющего иммортализацию гена в неиммортализованной здоровой или раковой клетке вычисляют, сначала измеряя количество РНК определяющего иммортализацию гена во множестве неиммортализованных здоровых или раковых клеток в тех же самых условиях, и затем находя среднее или промежуточное значение из вычисляемых значений.
(III-2) Кроме того, иммортализацию раковых клеток можно оценить на основании количества продукта экспрессии определяющего иммортализацию гена по настоящему изобретению, иными словами, на основании количества продукции полипептида (определяющего иммортализацию полипептида здесь далее) - кодируемого вышеупомянутым геном. Количество продукции определяющего иммортализацию полипептида можно измерить с использованием антитела, распознающего полипептид.
Ниже следуют определяющие иммортализацию полипептиды, которые можно использовать по настоящему изобретению, соответствующие вышеупомянутым определяющим иммортализацию генам (1)-(13):
(14) полипептид UBE2S: полипептид, кодируемый геном UBE2S (1), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:1, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:14.
(15) полипептид RFC4: полипептид, кодируемый геном RFC4 (2), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:2, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:15.
(16) полипептид PTGES2: полипептид, кодируемый геном PTGES2 (3), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:3, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:16.
(17) полипептид MAF1: полипептид, кодируемый геном MAF1 (4), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:4, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:17.
(18) полипептид ACVR2B: полипептид, кодируемый геном ACVR2B (5), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:5, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:18.
(19) полипептид FAM119A: полипептид, кодируемый геном FAM119A (6), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:6, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:19.
(20) полипептид LTB4DH: полипептид, кодируемый геном LTB4DH (7), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:7, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:20.
(21) полипептид DPM2: полипептид, кодируемый геном DPM2 (8), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:8, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:21.
(22) полипептид SEPX1: полипептид, кодируемый геном SEPX1 (9), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:9, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:22.
(23) полипептид PSMA3: полипептид, кодируемый геном PSMA3 (10), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:10, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:23.
(24) полипептид CHCHD3: полипептид, кодируемый геном CHCHD3 (11), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:11, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:24.
(25) полипептид LSM3: полипептид, кодируемый геном LSM3 (12), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:12, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:25.
(26) полипептид GTSE1: полипептид, кодируемый геном GTSE1 (13), обладающим последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:13, а именно полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO:26.
Полипептид (14) UBE2S представляет собой широко известный полипептид, и его получение также известно, как описано в J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992). Полипептид (15) RFC4 также является широко известным, как описано в Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12), 5211-5215 (1992). Подобным образом, полипептиды являются широко известными полипептидами, так как полипептид (16) PTGES2 описан в Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002); полипептид (18) ACVR2B описан в Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996); полипептид (20) LTB4DH описан в J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996); полипептид (21) DPM2 описан в EMBO J. 19 (11), 2475-2482 (2000); полипептид (22) SEPX1 описан в J. Biol. Chem. 274 (48), 33888-33897 (1999); полипептид (23) PSMA3 описан в Biochem. Biophys. Res. Commun. 207 (1), 318-323 (1995); полипептид (25) LSM3 описан в EMBO J. 18 (12), 3451-3462 (1999); и полипептид (26) GTSE1 описан в Gene 254 (1-2), 229-236 (2000).
Определяющие иммортализацию полипептиды (14)-(26) можно также получить способом, включающим в себя клонирование соответствующих определяющих иммортализацию генов (1)-(13), лигирование генов в векторную плазмиду, трансформацию генами клеток-хозяев, таких как E.coli, культивирование трансформированных клеток и выделение полипептидов из культуры.
Антитело, применяемое по настоящему изобретению, не является ограниченным, при условии, что оно распознает определяющий иммортализацию полипептид, и может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело. Антитело может представлять собой антитело, полученное как антитело против определяющего иммортализацию полипептида в качестве антигена для иммунизации, или антигенсвязывающее антитело по отношению к полипептиду, обладающему по меньшей мере 8 непрерывными аминокислотами, предпочтительно, 15 аминокислотами, и более предпочтительно, 20 аминокислотами из аминокислотной последовательности, формирующей определяющий иммортализацию полипептид. Полипептид можно в основном синтезировать широко известным способом на основании аминокислотной последовательности определяющего иммортализацию полипептида по настоящему изобретению или последовательности оснований, кодирующих аминокислоты. Например, можно применять химический синтез с использованием синтезатора аминокислот или промышленный синтез гена.
Антитело по настоящему изобретению можно получить обычным способом (см., например, Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al. (1987), Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13). Например, поликлональное антитело можно получать с использованием полипептида, полученного экспрессией полипептида в E.coli, или синтетического полипептида, как получают части аминокислотной последовательности общим способом, иммунизируя тестируемое животное вышеупомянутым полипептидом и выделяя антитело из сыворотки, полученной из иммунизированного животного. Моноклональное антитело можно также получать для полипептида, экспрессированного в E.coli или синтетического полипептида, как получают части аминокислотной последовательности обычным способом, иммунизируя тестируемое животное вышеупомянутым полипептидом, сливая клетки селезенки и клетки миеломы, выделенные из тестируемого животного, для синтеза клетки гибридомы, и выделяя антитело из клетки гибридомы.
Эти антитела также включены в качестве компонента вышеупомянутого набора реагентов для определения иммортализации раковой клетки для применения для оценки иммортализации раковых клеток.
Конкретно, оценку иммортализованных раковых клеток осуществляют с помощью следующих стадии (1') и стадий (2'):
(1') стадия смешивания содержащей белок фракции, содержащей полипептид, полученный из биологического образца, обладающего возможностью содержать раковые клетки, полученного из тестируемого субъекта, с антителом, распознающим определяющий иммортализацию полипептид по настоящему изобретению; и
(2') стадия измерения количества полипептида, связанного с антителом, с использованием антитела в качестве показателя.
Количество полипептида, обнаруженное на стадии (2'), зависит от количества продукции определяющего иммортализацию полипептида.
На стадии (2') биологический образец может представлять собой любой образец, выделенный из тестируемого субъекта, при условии, что он обладает возможностью содержать раковые клетки. Примеры биологических образцов включают в себя жидкости организма (кровь, мочу и т.д.), ткани или их экстракты, и культуры полученных тканей. Выделение биологического образца из тестируемого субъекта осуществляют подходящим способом в соответствии с типом биологического образца или типом рака. Получение содержащей белок фракции (включая полипептид) из биологического образца осуществляют посредством подходящего сочетания известных способов разделения и очистки. Определяющий иммортализацию полипептид можно детектировать посредством различных иммунологических способов детекции, таких как вестерн-блоттинг, ферментный иммуноанализ (EIA), радиоизотопный иммуноанализ (RIA), люминесцентный иммуноанализ или т.п. с использованием антитела в качестве зонда.
Далее объясняют стадии (1') и (2') для измерения количества полипептида (количество продукции определяющего иммортализацию полипептида) посредством вестерн-блоттинга. Сначала антитело против определяющего иммортализацию полипептида смешивают в качестве первичного антитела с содержащей белок фракцией, полученной из биологического образца тестируемого субъекта, для связывания с определяющим иммортализацию полипептидом, содержащимся в содержащей белок фракции. Затем вторичное антитело, меченное радиоактивным изотопом, флуоресцентным материалом или химическим люминесцентным веществом, связывается с первичным антителом. Затем количество определяющего иммортализацию полипептида измеряют на основании сигнала, полученного от маркера вторичного антитела. Детекцию сигнала можно осуществлять подходящим известным способом с использованием, например, детектора радиоактивности или детектора флуоресценции.
Иммортализацию раковых клеток тестируемого объекта можно оценивать сравнением полученного количества полипептида (количество продукции определяющего иммортализацию полипептида) у тестируемого субъекта на стадии (2') с количеством сравнительного определяющего иммортализацию полипептида (сравнительное количество продукции) в неиммортализованной здоровой или раковой клетке и нахождением уровня разницы. Более конкретно, если полученное количество полипептида (количество продукции определяющего иммортализацию полипептида) у тестируемого субъекта на стадии (2') выше, чем сравнительное количество полипептида (сравнительное количество продукции), заключают, что раковые клетки тестируемого субъекта являются иммортализованными. В обратном случае заключают, что раковые клетки тестируемого субъекта не являются иммортализованными.
Соответственно в дополнение к вышеупомянутым стадиям (1') и (2') способ определения иммортализованной раковой клетки по настоящему изобретению включает в себя следующую стадию (3'), и предпочтительно, также стадию (4').
(3') стадия сравнения количества полипептида, обнаруженного на стадии (2'), с количеством (сравнительное количество полипептида) соответствующего полипептида в неиммортализованной здоровой или раковой клетке; и
(4') стадия заключения, что выделенная раковая клетка тестируемого субъекта является иммортализованной, когда количество полипептида, обнаруженное на стадии (2'), выше, чем сравнительное количество полипептида, и заключения, что выделенная раковая клетка тестируемого субъекта не является иммортализованной, когда количество полипептида не превышает сравнительное количество полипептида.
Количество продукции определяющего иммортализацию полипептида в неиммортализованной здоровой или раковой клетке вычисляют, сначала измеряя количество продукции определяющего иммортализацию полипептида во множестве неиммортализованных здоровых или раковых клеток в тех же самых условиях и затем находя среднее или промежуточное значение из вычисленных значений.
(IV) Способ скрининга ингибитора роста иммортализованной раковой клетки
(IV-1) Как показано в примерах, для определяющих иммортализацию генов ((1)-(13)) в соответствии с настоящим изобретением показали специфическую высокую экспрессию в иммортализованных раковых клетках. Кроме того, супрессией экспрессии определяющих иммортализацию генов с использованием миРНК супрессируют пролиферацию иммортализованных раковых клеток. Это указывает на то, что вещество, супрессирующее экспрессию определяющих иммортализацию генов ((1)-(13)), может служить ингибитором роста иммортализованной раковой клетки (противораковым лекарственным средством). Таким образом, с использованием супрессии экспрессии определяющих иммортализацию генов ((1)-(13)) в качестве показателя можно проводить скрининг вещества, супрессирующего пролиферацию иммортализованных раковых клеток.
Соответственно настоящее изобретение относится к способу скрининга ингибиторов роста иммортализованной раковой клетки с использованием супрессии экспрессии определяющих иммортализацию генов ((1)-(13)) в качестве показателя.
Настоящий способ может включать в себя следующие стадии (A)-(D):
(A) стадия приведения тестируемого материала в контакт с клеткой, которая может экспрессировать один из определяющих иммортализацию генов (1)-(13);
(B) стадия измерения уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена в клетке, приведенной в контакт с тестируемым материалом;
(C) стадия сравнения уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена, обнаруженного на стадии (B), с уровнем экспрессии (сравнительным уровнем экспрессии) определяющего иммортализацию гена в клетке, не находящейся в контакте с тестируемым материалом; и
(D) стадия выбора тестируемого материала в качестве вещества для ингибирования пролиферации иммортализованных раковых клеток, когда уровень экспрессии, обнаруженный на стадии (B), ниже, чем сравнительный уровень экспрессии.
Клетку, применяемую по настоящему изобретению, можно получать из любого вида клеток, при условии, что клетка может экспрессировать по меньшей мере один из определяющих иммортализацию генов (1)-(13). Примеры органов, из которых можно получать применяемую клетку, включают в себя легкое, желудок, толстую кишку, прямую кишку, печень, желчный пузырь, желчный проток, поджелудочную железу, почку, мочевой пузырь, предстательную железу, матку, костный мозг, лимфатический узел и кровь. Клетку можно получать из млекопитающих или птиц, предпочтительно, млекопитающих, и более предпочтительно, человека. Экспрессия определяющего иммортализацию гена может являться эндогенной или экзогенной.
Тестируемый материал не является ограниченным и может представлять собой нуклеиновую кислоту (включая полинуклеотиды), пептид (включая полипептиды), органическое соединение или неорганическое соединение. Скрининг осуществляют приведением тестируемого материала или образца (тестируемого образца) в контакт с клеткой, которая может экспрессировать определяющий иммортализацию ген. Примеры тестируемого образца включают в себя экстракты клеток, продукты экспрессии из библиотеки генов и экстракты природных продуктов растительного или животного происхождения.
При скрининге способ приведения тестируемого материала в контакт с клеткой не является ограниченным при условии, что он не убивает клетку и не ингибирует экспрессию определяющего иммортализацию гена в клетке.
На стадиях (B) и (C) уровень экспрессии определяющего иммортализацию гена можно найти измерением количества мРНК определяющего иммортализацию гена или ее производного - кДНК или двухцепочечной ДНК, посредством нозерн-блоттинга или ОТ-ПЦР, с использованием вышеупомянутого зонда или праймера по настоящему изобретению. Кроме того, количество определяющего иммортализацию полипептида как продукта экспрессии определяющего иммортализацию гена можно использовать для нахождения уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена на стадиях (B) и (C). Количество определяющего иммортализацию полипептида можно найти посредством различных способов иммунологической детекции, таких как вестерн-блоттинг, ферментный иммуноанализ (EIA), радиоизотопный иммуноанализ (RIA), люминесцентный иммуноанализ или т.п., с использованием антитела против определяющего иммортализацию полипептида.
На стадии (C) скрининг вещества, ингибирующего пролиферацию иммортализованных раковых клеток, можно осуществлять сравнением уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена, измеренного на стадии (B), с уровнем экспрессии определяющего иммортализацию гена (сравнительным уровнем экспрессии) в клетке, не находящейся в контакте с тестируемым материалом. Более конкретно, когда уровень экспрессии определяющего иммортализацию гена, обнаруженный на стадии (B), ниже, чем сравнительный уровень экспрессии, тестируемый материал можно выбрать в качестве вещества для ингибирования пролиферации иммортализованной раковой клетки.
(IV-2) Ингибирование активности определяющих иммортализацию полипептидов ((14)-(26)), представляющих собой продукты экспрессии определяющих иммортализацию генов ((1)-(13)) по настоящему изобретению, также составляет признак для скрининга ингибитора роста иммортализованной раковой клетки. Например, известно, что полипептид (14) UBE2S обладает активатором убиквитина (E2) (J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)); известно, что полипептид (16) PTGES2 обладает активностью превращения простагландина H2 в простагландин E2 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)); полипептид (18) ACVR2B представляет собой трансмембранный рецептор и обладает активностью киназы Ser/Thr в межклеточном домене (Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)); полипептид (20) LTB4DH обладает активностью превращения лейкотриена B4 в 12-оксо-лейкотриен B4 (J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)); и полипептид (22) SEPX1 обладает активностью метионинсульфоксид-редуктазы (Mol. Biol. Cell 15 (3), 1055-1064 (2004)); таким образом, ингибирование этих видов активности определяющих иммортализацию полипептидов, является, в частности, применимым в качестве показателей для скрининга ингибитора роста иммортализованной раковой клетки.
Более конкретно, посредством осуществления следующих стадий (A')-(D') можно проводить скрининг вещества по супрессии пролиферации иммортализованных раковых клеток:
(A') стадия приведения тестируемого материала в контакт с одним из определяющих иммортализацию полипептидов (14)-(26);
(B') стадия измерения активности определяющего иммортализацию полипептида в контакте с тестируемым материалом;
(C') стадия сравнения активности определяющего иммортализацию полипептида, измеренной на стадии (B'), с активностью (сравнительной активностью) определяющего иммортализацию полипептида в водном растворе, клетке, или фракции клетки, не находящихся в контакте с тестируемым материалом; и
(D') стадия выбора тестируемого материала в качестве вещества для ингибирования пролиферации иммортализованных раковых клеток, когда активность, обнаруженная на стадии (B'), ниже, чем сравнительная активность.
Для скрининга используют активность определяющего иммортализацию полипептида в качестве показателя, и его можно осуществлять по отношению к любому объекту, который содержит или может содержать определяющие иммортализацию полипептиды (14)-(26) (предпочтительно, (14), (16), (18), (20) или (22)). Подходящий объект выбирают в соответствии с желательной функцией (активностью) определяющего иммортализацию полипептида. Примеры объектов, подвергаемых скринингу, включают в себя водный раствор, содержащий один из определяющих иммортализацию полипептидов (14)-(26) (предпочтительно, (14), (16), (18), (20) или (22)); клетку, которая может экспрессировать один из определяющих иммортализацию генов (1)-(13) (предпочтительно, (1), (3), (5), (7) или (9)); или фракцию клетки, полученную из вышеупомянутой клетки. Водный раствор не является конкретно ограниченным, при условии, что он содержит определяющий иммортализацию полипептид. В дополнение к обычному водному раствору можно использовать раствор клетки, экстракт ядра или жидкий супернатант культуры. Клетка может являться эндогенной или экзогенной, и может представлять собой любую клетку, которая может экспрессировать один из определяющих иммортализацию генов. Фракция клетки обозначает фракцию, полученную из вышеупомянутой клетки, такую как фракция мембраны клетки, цитоплазматическая фракция, фракция ядра клетки или т.п.
Те же самые клетку и тестируемый материал, как и для описанного ранее скрининга, можно использовать для этого способа скрининга.
Измерение способности полипептида (14) UBE2S к активации убиквитина на стадии (B') можно осуществлять известным способом. Например, в «J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992)» описан способ проведения реакции активации убиквитина для полипептида UBE2S в системе, содержащей убиквитин, активирующий убиквитин фермент (E1) и полипептид UBE2S, и измерения количества убиквитина, связанного с полипептидом UBE2S. Измерение количества убиквитина можно осуществлять известным способом. Например, реакцию проводят с использованием убиквитина, меченного радиоактивным материалом или ферментом, и измеряют количество маркера (J. Biol. Chem. 267 (22), 15829-15835 (1992), J. Biol. Chem. 279 (51), 52970-52977 (2004)). Альтернативно, можно проводить измерение детекцией убиквитина с использованием антитела против убиквитина (J. Biol. Chem. 279 (51), 52970-52977 (2004)). Убиквитин и активирующий убиквитин фермент (E1) могут представлять собой продаваемые продукты или их можно получать известным способом синтеза белка.
Измерение активности синтеза простагландина E2 полипептида (16) PTGES2 на стадии (B') можно осуществлять с использованием известного способа. Например, как описано в «Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (4), 884-889 (2002)», уровень продукции простагландина E2 можно измерять проведением реакции превращения простагландина E2 с использованием полипептида PTGES2 в системе, содержащей полипептид PTGES2 и простагландин H2. Количество простагландина E2 можно измерить с использованием известного способа. Например, согласно «Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (13), 7220-7225 (1999))», реакцию проводят с использованием простагландина H2, меченного радиоактивным материалом или ферментом, и затем измеряют количество маркера, чтобы найти количество продукции простагландина E2. Альтернативно, измерение можно проводить с использованием антитела против простагландина E2 (J. Dairy. Sci. 87 (7), 2197-2210 (2004)). Простагландин H2 может представлять собой продаваемый продукт, или его можно получать известным способом синтеза.
Измерение активности киназы Ser/Thr полипептида (18) ACVR2B на стадии (B') можно осуществлять с использованием известного способа. Например, как описано в «Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)», активность киназы Ser/Thr можно измерить, проводя киназную реакцию в системе, содержащей полипептид ACVR2B в присутствии субстрата и ATP, и затем измеряя уровень фосфорилирования субстрата. Уровень фосфорилирования субстрата можно измерять известным способом. Например, уровень фосфорилирования можно измерять измерением радиоактивности с использованием γ32P-ATP или γ33P-ATP в качестве индикатора (Mol. Cell Biol. 16 (3), 1066-1073 (1996)). Альтернативно, уровень фосфорилирования можно измерять, проводя реакцию фосфорилирования с использованием субстрата, меченного флуоресцентным материалом или биотином, и измеряя количество маркера фосфорилирования. Примеры субстратов включают в себя полипептид ACVR2B и специфические субстраты и пептиды.
Измерение активности превращения лейкотриена B4 для полипептида (20) LTB4DH на стадии (B') можно осуществлять с использованием известного способа. Например, как описано в «J. Biol. Chem. 271 (5), 2844-2850 (1996)», активность превращения лейкотриена B4 можно измерять, проводя реакцию превращения лейкотриена B4 с использованием полипептида LTB4DH в системе, содержащей полипептид LTB4DH и лейкотриен B4, и затем измеряя уровень продукции 12-оксо-лейкотриена B4. Уровень продукции 12-оксо-лейкотриена B4 можно измерять известным способом, таким как ВЭЖХ. Лейкотриен B4 может представлять собой продаваемый продукт или его можно получать известным способом химического синтеза.
Измерение активности метионинсульфоксид-редуктазы полипептида (22) SEPX1 на стадии (B') можно осуществлять с использованием известного способа. Например, как описано в «Mol. Biol. Cell 15 (3), 1055-1064 (2004)», активность метионинсульфоксид-редуктазы можно измерять, проводя реакцию восстановления метионинсульфоксида с использованием полипептида SEPX1 в системе, содержащей полипептид SEPX1 и метионинсульфоксид, и затем измеряя уровень продукции метионина. Уровень продукции метионина можно измерять известным способом, таким как ВЭЖХ. Метионинсульфоксид может представлять собой продаваемый продукт или его можно получать известным способом химического синтеза.
На стадиях (C') и (D') можно проводить скрининг вещества, ингибирующего пролиферацию иммортализованных раковых клеток, сравнением измеренной активности определяющего иммортализацию полипептида на стадии (B') со сравнительной активностью. Более конкретно, когда измеренная активность определяющего иммортализацию полипептида ниже, чем сравнительная активность, определяют, что тестируемый материал является веществом для ингибирования пролиферации иммортализованной раковой клетки.
Как объясняют в примерах, каждый из антисмысловых полинуклеотидов (миРНК) (SEQ ID NO:27-76), показанных в таблицах 2 и 3, гибридизуется с одним из определяющих иммортализацию генов по настоящему изобретению в раковой клетке для супрессии экспрессии определяющего иммортализацию гена, таким образом супрессируя пролиферацию иммортализованных раковых клеток. Таким образом, антисмысловой полинуклеотид (миРНК) можно использовать в качестве ингибитора роста иммортализованной раковой клетки. Соответственно настоящее изобретение относится к ингибитору роста иммортализованной раковой клетки, содержащему антисмысловой полинуклеотид в качестве активного ингредиента.
Антисмысловой полинуклеотид сформирован из полинуклеотида по меньшей мере из 15 оснований, который специфически гибридизуется с полинуклеотидом, обладающим непрерывной последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований внутри последовательности оснований определяющих иммортализацию генов (1)-(13). Полинуклеотид предпочтительно обладает последовательностью оснований, комплементарной непрерывной последовательности, по меньшей мере, из 15 оснований в одном из определяющих иммортализацию генов (1)-(13); однако при условии, что возможна специфическая гибридизация и таким образом экспрессия определяющего иммортализацию гена является супрессированной, он не всегда должен являться полностью комплементарным. Например, последовательность оснований полинуклеотида может обладать идентичностью 70%, предпочтительно, не менее чем 80%, более предпочтительно, не менее чем 90%, еще более предпочтительно, не менее чем 95%, и еще более предпочтительно не менее чем 98%, по отношению к комплементарной последовательности определяющего иммортализацию гена; и полинуклеотид может гибридизоваться с РНК определяющего иммортализацию гена для супрессии экспрессии определяющего иммортализацию гена. Антисмысловой полинуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно имеет 15-1000 оснований, более предпочтительно, 15-500 оснований, и еще более предпочтительно 16-30 оснований.
Антисмысловой полинуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно обладает последовательностью оснований, представленной одной из SEQ ID NO:27-76, и более предпочтительно, двухцепочечной РНК, обладающей одной из последовательностей оснований.
Антисмысловой полинуклеотид по настоящему изобретению можно модифицировать известным способом для улучшения стабильности и проницаемости клеток. Например, фосфорный остаток каждого нуклеотида можно заменять химически модифицированным фосфорным остатком, таким как фосфоротиоат, метилфосфонат, или фосфородитиоат, для предотвращения расщепления гидролазой, такой как нуклеаза.
Антисмысловой полинуклеотид по настоящему изобретению не является ограниченным по форме и может представлять собой одноцепочечную ДНК, одноцепочечную РНК, двухцепочечную ДНК, двухцепочечную РНК или гибрид ДНК:РНК.
Как правило, антисмысловой полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать с использованием известного способа, такого как химический синтез, с использованием синтезатора.
Антисмысловой полинуклеотид по настоящему изобретению можно вводить в раковые клетки пациента с использованием вирусного вектора, такого как ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, или аденоассоциированный вирусный вектор, или невирусного вектора, такого как липосома, посредством способа ex vivo или способа in vivo, таким образом, он соответствующим образом служит в качестве противоракового лечения. Соответственно настоящее изобретение относится к способу противоракового лечения, включающего в себя стадию введения пациенту ингибитора роста иммортализованной раковой клетки, содержащего антисмысловой полинуклеотид в качестве активного ингредиента.
Ингибитор роста иммортализованной раковой клетки по настоящему изобретению содержит вышеупомянутый антисмысловой полинуклеотид в качестве активного ингредиента и может также содержать стабилизатор, суспензию, замораживающую смесь, буферный раствор, растворитель или т.п. до такой степени, что эффект супрессии пролиферации клетки ингибитором не нарушается. Дозу и расписание введения ингибитора роста иммортализованной раковой клетки по настоящему изобретению пациенту с раком может подходящим образом определить специалист в данной области согласно типу заболевания, возрасту, массе пациента и т.д. Примеры расписаний введения включают в себя 3-недельный цикл внутривенного введения, при котором проводят последовательное 2-3-недельное введение антисмыслового полинуклеотида в дозе 2-10 мг/кг в сутки; 1-недельный цикл внутривенного введения, при котором проводят последовательное 5-суточное введение антисмыслового полинуклеотида в дозе 80-120 мг/м2 в сутки; и 4-недельный цикл внутривенного введения, при котором проводят последовательное 3-недельное введение антисмыслового полинуклеотида в дозе 80-120 мг/м2 в сутки.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение более конкретно объясняют ниже по отношению к примерам. Однако настоящее изобретение не является ограниченным этими примерами.
Пример 1
Идентификация определяющего иммортализацию гена
1. Получение тотальной РНК из образца ткани человека, штамма раковой клетки человека и культуры не неопластических клеток человека
С использованием набора RNeasyTM Mini (Qiagen) тотальную РНК выделяли из девяти видов штаммов клеток рака легкого, 21 вида штаммов раковых клеток пищевода, девяти видов рака пищеварительной системы, различных других штаммов раковых клеток (рак желудка, рак толстого кишечника, рак головы и шеи, лейкоз), двух видов не неопластических эпителиальных клеток пищевода и двух видов нормального респираторного эпителия согласно прилагаемому протоколу. Выделенную тотальную РНК хранили при -80°C.
Кроме того, тотальную РНК выделяли также из одиннадцати видов штаммов клеток рака молочной железы, десяти видов штаммов раковых клеток яичников, десяти видов штаммов раковых клеток поджелудочной железы, одного вида эпителия молочной железы с не неопластической иммортализацией, одного вида не неопластического эпителия молочной железы, десяти наборов ткани рака поджелудочной железы и не раковой ткани поджелудочной железы того же самого пациента с раком поджелудочной железы, первичного очага и трех частей с метастазами из ткани рака легкого одного и того же пациента с немелкоклеточным раком легкого. Полученную тотальную РНК сохраняли. Тотальную РНК проверяли, чтобы убедиться в высоком качестве, с четкими пиками 18S и 28S рРНК, с использованием 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) и RNA LabChip (Agilent Technologies), перед тем как подвергать анализу на микрочипе.
2. Анализ на микрочипе
С использованием выделенной тотальной РНК проводили всесторонний анализ экспрессии генов посредством микрочипа. Использовали микрочип CodeLink UniSet Human 20K I Bioarray (19881 зонд) и проводили (1) синтез кДНК по тотальной РНК, (2) синтез меченой кРНК по кДНК, (3) процесс фрагментации меченой кРНК, (4) гибридизацию фрагментов кРНК и микрочипа, (5) окрашивание микрочипа, (6) сканирование микрочипа и (7) анализ экспрессии генов.
(1) Синтез кДНК по тотальной РНК
С использованием набора реагентов для анализа экспрессии CodeLink (GE Healthcare Bio Science) синтезировали первую цепь кДНК согласно протоколу. Более конкретно, 1 мкг каждой из тотальных РНК, полученных в разделе 1, доводили до 10 мкл свободной от нуклеазы водой, смешивали с 1 мкл разбавляющего противобактериального раствора для мРНК и 1 мкл праймера T7 олиго (dT), оба содержались в наборе. Всего 12 мкл жидкости нагревали при 70°C в течение 10 минут с последующим быстрым охлаждением на льду в течение 3 минут. На льду жидкость перемешивали с 2 мкл 10 × буфера для синтеза первой цепи, 4 мкл смеси 5-мМ dNTP, 1 мкл ингибитора РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы (200 ед./мкл) - все содержалось в наборе. Всего 20 мкл жидкости нагревали при 42°C в течение двух часов.
Затем согласно протоколу РНК в гибриде РНК-ДНК расщепляли, и цепь РНК заменяли цепью ДНК, таким образом синтезируя вторую цепь кДНК (двухцепочечная кДНК). Более конкретно, 63 мкл свободной от нуклеазы воды, 10 × буфер для синтеза второй цепи (10 мкл), 5-мМ смесь dNTP (4 мкл), смесь ДНК-полимеразы (2 мкл:10 ед./мкл), 1 мкл РНКазы H - все содержалось в наборе, добавляли к 20 мкл реакционного раствора для первой цепи кДНК. Всего 100 мкл жидкости нагревали при 16°C в течение двух часов.
После реакции синтезированную двухцепочечную кДНК очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР QIA quick (QIAGEN) согласно прилагаемому протоколу. Более конкретно, 100 мкл раствора кДНК смешивали с 500 мкл буфера PB, содержащегося в наборе, и перемешанную жидкость помещали в центрифугируемую колонку QIA quick, установленную в 2-мл пробирку для центрифугирования, и подвергали центрифугированию в течение 50 секунд при 13000 об/мин. После элюции жидкость удаляли, центрифугируемую колонку QIA quick устанавливали снова, туда добавляли 700 мкл буфера PE, содержащегося в наборе, и проводили центрифугирование при 13000 об/мин в течение 1 минуты. Жидкость после элюции удаляли, центрифугируемую колонку QIA quick устанавливали снова, и проводили еще одно центрифугирование при 13000 об/мин в течение 1 минуты, так чтобы полностью удалить буфер PE. Центрифугируемую колонку QIA quick устанавливали в новую 1,5-мл пробирку, и 30 мкл свободной от нуклеазы воды наносили непосредственно на мембрану в центрифугируемую колонку QIA quick, позволяли стоять 1 минуту и затем центрифугировали при 13000 об/мин в течение 1 минуты. Этот процесс проводили дважды (всего использовали 60 мкл). Затем раствор кДНК концентрировали до менее чем 9,5 мкл с использованием вакуумной сушки и доводили добавлением свободной от нуклеазы воды до 9,5 мкл.
(2) Синтез меченой кРНК по кДНК
Затем согласно протоколу набора реагентов для анализа экспрессии CodeLink (GE Healthcare Bio Science) проводили реакцию транскрипции in vitro (IVT) в присутствии меченного биотином нуклеотида для синтеза кРНК. Более конкретно, смешивали 4,0 мкл 10 × реакционного буфера для T7, 4,0 мкл раствора ATP для T7, 4,0 мкл раствора GTP для T7, 4,0 мкл раствора CTP для T7 и 3,0 мкл раствора UTP для T7 - все содержались в наборе. После дополнительного добавления 7,5 мкл 10-мМ биотин-11-UTP (Perkin Elmer Corporation), всего 26,5 мкл жидкости добавляли к 9,5 мкл раствора кДНК, полученного в предыдущем процессе (1). Затем добавляли 4,0 мкл 10 × ферментной смеси T7, содержащейся в наборе, и всего 40,0 мкл жидкости хорошо перемешивали и нагревали в газообразной фазе при 37°C в течение 14 часов. После реакции синтезированную кРНК очищали с использованием набора RNeasy Mini (QIAGEN) согласно прилагаемому протоколу. Более конкретно, 60 мкл свободной от нуклеазы воды добавляли к реакционному раствору IVT (40 мкл), добавляли 350 мкл буфера RLT, содержащегося в наборе, и 250 мкл 100% этанола, и хорошо перемешивали, и всего 700 мкл перемешанной жидкости помещали в центрифугируемую колонку RNeasy mini, чтобы подвергать центрифугированию в течение 15 секунд при 12000 об/мин Центрифугируемую колонку RNeasy mini устанавливали в новую 2-мл пробирку для центрифугирования, на колонку наносили 500 мкл буфера RPE, содержащегося в наборе, и проводили другое центрифугирование при 12000 об/мин в течение 15 секунд. Этот процесс проводили дважды. После удаления жидкости после элюции центрифугируемую колонку RNeasy mini устанавливали в 2-мл пробирку для центрифугирования и проводили центрифугирование при 12000 об/мин в течение 2 минут для высушивания мембраны в колонке. После этого центрифугируемую колонку RNeasy mini устанавливали в новую 1,5-мл пробирку, и 50 мкл свободной от нуклеазы воды наносили непосредственно на мембрану, позволяли стоять 10 минут при комнатной температуре и затем центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 минуты. Этот процесс проводили дважды (всего использовали 100 мкл).
Образец хорошо перемешивали и отбирали порцию 2-мкл для проверки качества кРНК с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer, и 2-мкл порцию разводили в 50 раз стерильной дистиллированной водой для количественного определения кРНК; остальное хранили при -80°C. Для количественного определения измеряли поглощение разведенного в 50 раз раствора по отношению к 260 нм и 280 нм, и определяли концентрацию кРНК. Подтверждали, что соотношение поглощения при 260 нм и 280 нм составляет 1,8 или более. Когда концентрация РНК составляла 0,5 мкг/мкл или менее, образец концентрировали с использованием вакуумной сушки. Проверку качества кРНК осуществляли электрофорезом с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer и RNA LabChip согласно прилагаемому протоколу, подтверждая что размытый пик имеет по меньшей мере 500 оснований.
(3) Фрагментация меченой кРНК
Затем согласно протоколу из набора реагентов для анализа экспрессии CodeLink (GE Healthcare Bio Science) кРНК фрагментировали до приблизительно 100-200 оснований. Более конкретно, добавляли свободную от нуклеазы воду, так что из 10 мкг кРНК получали 20 мкл; затем добавляли 5 мкл 5 × буфера для фрагментации, содержащегося в наборе. После нагревания при 94°C в течение 20 минут жидкость быстро охлаждали на льду. 78 мкл буфера для гибридизации A, 130 мкл буфера для гибридизации B, 27 мкл свободной от нуклеазы воды - все содержались в наборе, добавляли к 25 мкл раствора, содержащего 10 мкг фрагментов кРНК, получая всего 260 мкл раствора для гибридизации. После перемешивания на встряхивателе при максимальной скорости в течение 5 секунд и осаждения центрифугированием образец нагревали при 90°C в течение 5 минут для денатурации кРНК нагреванием с последующим охлаждением на льду.
(4) Гибридизация фрагментов кРНК и микрочипа
С использованием набора CodeLink Shaker (GE Healthcare Bio Science) и встряхивателя CodeLink Innova проводили гибридизацию согласно протоколу. Более конкретно биочип CodeLink uniSet human 20K I устанавливали в лоток для встряхивания 12 пластин, содержащийся в наборе. Раствор для гибридизации, полученный в предыдущем процессе (3), встряхивали при максимальной скорости в течение 5 секунд и осаждали центрифугированием. 250 мкл раствора для гибридизации инъецировали в отверстие справа внизу в камере для герметизации чипа, и отверстие закрывали уплотнительной лентой (наклейкой), присоединенной к чипу. Лоток для встряхивания с чипом на нем помещали в встряхиватель CodeLink Innova и нагревали при 37°C в течение 18 часов при вращении при 300 об/мин.
(5) Окрашивание микрочипа
С использованием набора CodeLink Parallel Processing (GE Healthcare Bio Science) чип окрашивали и промывали согласно протоколу. Более конкретно, камеру для герметизации удаляли с гибридизуемого чипа, 13 мл 0,75 × буфера TNT (0,1 M Трис-HCl (pH 7,6), 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20) добавляли при комнатной температуре, и полученную жидкость разделяли по щелям среднего резервуара для реагентов с подставкой для биочипов, содержащейся в наборе. Подставку двигали вверх и вниз несколько раз, чтобы стряхнуть лишний раствор для гибридизации. Затем подставку для биочипов перемещали в большой резервуар для реагентов, заполненный 240 мл 0,75 × буфера TNT, нагретого до 46°C. Подставку для биочипов нагревали до 46°C в течение часа.
В качестве жидкости для окрашивания для каждого чипа 6,8 мкл жидкого стрептавидин-Cy5, растворенного в свободной от нуклеазы воде до 1 мг/мл, разводили в 500 раз с использованием 3393,2 мкл буфера TNB (0,1 M Трис-HCl (pH 7,6), 0,15 M NaCl, 0,5% блокирующего реагента TSA (Perkin Elmer Corporation)) при комнатной температуре. Всего подавали 3,4 мл, чтобы заполнить щели малого резервуара для реагентов, содержащегося в наборе. Подставку для биочипов, поддерживающую чип, перемещали в малый резервуар для реагентов, загораживали от света алюминием или т.п. и подвергали окрашиванию в течение 30 минут при комнатной температуре (23°C ± 2°C).
После окрашивания подставку для биочипов перемещали в большой резервуар для реагентов, заполненный 240 мл буфера TNT (комнатная температура), двигали вверх и вниз несколько раз и позволяли стоять 5 минут при комнатной температуре. Затем подставку перемещали в большой резервуар для реагентов, заполненный новым буфером TNT (комнатной температуре), двигали вверх и вниз несколько раз и позволяли стоять 5 минут при комнатной температуре. Этот процесс промывки повторяли четыре раза. Наконец, подставку промывали 240 мл раствора 0,05% Tween 20, двигая вверх и вниз в течение пяти секунд. Этот процесс повторяли дважды. Подставку для биочипов устанавливали в высушенный средний резервуар для реагентов с последующим центрифугированием при комнатной температуре 3 минуты при 600 × g.
(6) Сканирование микрочипа
Каждый из окрашенных чипов сканировали сканером Agilent G2565 (Agilent), чтобы сохранить картину окрашивания в виде изображения TIFF. Каждое изображение TIFF обрабатывали программным обеспечением для анализа экспрессии CodeLink, таким образом преобразуя в цифровую форму силу сигнала для пятна каждого гена на чипе.
(7) Анализ экспрессии генов
Данные силы сигнала, полученные таким образом, нормализовали с использованием программного обеспечения для анализа экспрессии генов на биочипах GeneSpring GX (Agilent Technologies), и затем анализировали данные. Конкретно, сигнал фона вычитали из сигнала пятна. Значения меньше 0,01 приравнивали к 0,01, и каждое значение делили на промежуточное значение из сигналов всех пятен, чтобы найти стандартизованный относительный уровень экспрессии гена. Гены, относительный уровень экспрессии которых в штаммах иммортализованных раковых клеток везде был выше (ФИГ. 1, внизу справа), чем в здоровой клетке (ФИГ. 1, вверху слева), распознавали следующим образом. Гены, обладающие универсальной повышенной экспрессией в различных органах, по-видимому, являются генами, вовлеченными в иммортализацию раковых клеток (ФИГ. 1, большая стрелка, указывающая направо), а не генами (ФИГ. 1, направленная вниз стрелка), вовлеченными в злокачественное перерождение здоровых клеток (ФИГ. 1, слева вверху).
В качестве первой группы при скрининге отбирали любой ген, для которого по меньшей мере в 8 из 9 видов штаммов клеток рака легкого показали экспрессию в двукратном количестве или выше, чем промежуточное значение для двух образцов нормального респираторного эпителия, любой ген, для которого по меньшей мере в 19 из 21 видов штаммов раковых клеток пищевода показали экспрессию в двукратном количестве или выше, чем промежуточное значение для двух образцов не неопластического эпителия пищевода, и любой ген, для которого по меньшей мере в 8 из 9 видов рака пищеварительной системы, или различных других штаммов раковых клеток (рак желудка, рак ободочной и прямой кишки, рак головы и шеи, лейкоз) показали экспрессию в двукратном количестве или выше, чем промежуточное значение для четырех видов не неопластического эпителия (двух видов респираторного эпителия и двух видов эпителия пищевода). В результате при скрининге отобрали пятьдесят один ген (ФИГ. 2, слева вверху). В качестве второй группы при скрининге отбирали любой ген, для которого среднее значение уровней экспрессии трех групп штаммов раковых клеток из различных органов являлось двукратным или выше, чем среднее значение для соответствующего эпителия (следует заметить, что для штаммов раковых клеток пищевода, используемых для этого скрининга, основывались на среднем значении, соответствующем семи видам, проанализированным первыми), и для которого уровень экспрессии в ткани с метастазами рака легкого, состоящих из иммортализованных клеток рака легкого, являлся двукратным или выше, чем среднее значение для ткани первичного очага и ткани с метастазами, состоящей из не иммортализованных клеток рака легкого того же самого пациента. В результате выделили 80 генов (ФИГ. 2, справа вверху). Среди двух отобранных скринингом групп семь генов являлись общими.
Является известным фактом, что штаммы раковых клеток все являются иммортализованными. Для каждого из наборов тканей рака легкого с иммортализацией/без иммортализации, используемых в экспериментах, подтвердили, что первичный очаг (ФИГ. 3, «D2Pr») и очаг метастазирования в печени (ФИГ. 3, «D5M3») одного и того же пациента являлись неиммортализованными (активация теломеразы: отрицательная; длина теломеры: уменьшенная; экспрессия белка hTERT: не наблюдали), и что один из очагов метастазирования в лимфатических узлах (ФИГ. 3, «D4M2») по существу состоял только из иммортализованных клеток (высокую активацию теломеразы, увеличенную длину теломеры, экспрессию белка hTERT наблюдали почти во всех клетках), а другой очаг метастазирования (ФИГ. 3, «D3M1») состоял как из иммортализованных клеток, так и из неиммортализованных клеток (низкая активация теломеразы; клетки с экспрессией белка hTERT наблюдали среди клеток без экспрессии). Эти характеристики подтвердили анализом активации теломеразы (Hiyama K et al., J Natl Cancer Inst 87: 895-902, 1995, Case G), длины теломеры (Hiyama K et al., Oncogene 10: 937-44, 1995, Case 92-D) и экспрессии белка hTERT in situ (Hiyama E et al., Neoplasia 3: 17-26, 2001, Fig 6A, B).
Для дальнейшего уточнения проводили скрининг гена, обладающего универсальной высокой экспрессией в 11 штаммах клеток рака молочной железы, 10 штаммах клеток рака яичника и 10 штаммах клеток рака поджелудочной железы. Наконец, всего тринадцать генов: (1) присоединяющего убиквитин фермента E2S (UBE2S), (2) фактора репликации C (активатора 1) 4, 37 кДа (RFC4), (3) простагландин E-синтазы 2, (PTGES2), (4) гомолога MAF1 (S. cerevisiae) (MAF1), (5) рецептора активина A, типа IIB(ACVR2B), (6) семейства со сходством последовательностей 119, члена A (FAM119A), (7) 12-гидроксидегидрогеназы лейкотриена B4 (LTB4DH), (8) полипептида 2 маннозилтрансферазы долихилфосфата, регуляторной субъединицы (DPM2), (9) селенопротеина X, 1(SEPX1), (10) субъединицы протеасомы (просомы, macropain), типа альфа, 3 (PSMA3), (11) домена, содержащего двойную спираль-спираль-двойную спираль-спираль 3 (CHCHD3), (12) гомолога LSM3, связанного с малой ядерной РНК U6 (S. cerevisiae) (LSM3) и экспрессирующийся (13) в G-2 и S-фазе 1(GTSE1), обнаружили как гены, обладающие универсальной более высокой экспрессией в большинстве штаммов клеток рака легкого, штаммов раковых клеток пищевода, штаммов раковых клеток пищеварительной системы, штаммов клеток рака молочной железы, штаммов клеток рака яичника, штаммов клеток рака поджелудочной железы и различных других штаммов раковых клеток, чем в штаммах смертных не неопластических клеток; они обладают более высокой экспрессией в положительной по теломеразе ткани с метастазами рака легкого (иммортализованные раковые клетки), чем в отрицательной по теломеразе ткани с метастазами рака легкого и первичной ткани (неиммортализованные раковые клетки) одного и того же пациента; и обладают более высокой экспрессией в штаммах клеток рака поджелудочной железы, состоящих только из иммортализованных клеток, чем в раковой ткани поджелудочной железы, содержащей как иммортализованные клетки, так и неиммортализованные клетки (ФИГ. 3). Для раковой ткани поджелудочной железы, используемой в этом эксперименте, показали более высокую экспрессию полноразмерной мРНК кодирующего теломеразу гена TERT, чем в здоровой ткани поджелудочной железы того же самого пациента. Однако поскольку экспрессия была явно ниже по сравнению со штаммами иммортализованных клеток рака поджелудочной железы, заключили, что ткань содержит неиммортализованные клетки.
Как показано на ФИГ. 3-15, вышеуказанные тринадцать генов обладают следующими характеристиками:
(1) для каждого гена показали более усиленную экспрессию в иммортализованных клетках (сплошные столбцы на ФИГ. 3-15, штаммы клеток, полученные из рака человека, за исключением MCF-12A, SV11e, SV11-106), чем в не неопластических смертных клетках (незакрашенные столбцы на ФИГ. 3-15);
(2) для каждого гена показали более усиленную экспрессию в иммортализованных раковых клетках, полученных из рака человека (сплошные столбцы на ФИГ. 3-15, за исключением MCF-12A, SV11e, SV11-106), чем в раковых клетках (столбцы с диагональной штриховкой на ФИГ. 3-15, за исключением SV12e, SV12-72); и
(3) его экспрессия является менее усиленной в не неопластических клетках с увеличенной продолжительностью жизни из-за экспрессии теломеразы, полученных введением кодирующего теломеразу гена TERT в здоровые фибробласты легкого (столбцы с ромбовидными точками на ФИГ. 3-15; TERT6e, TERT6-85), чем в родительских клетках (TIG-1). Эти гены обладают высокой экспрессией в положительных по теломеразе иммортализованных раковых клетках. Это показывает, что эти гены служат для определения иммортализации раковых клеток (определяющий иммортализацию ген).
Более того, в трансформированных для иммортализации клетках, полученных введением генов, кодирующих ген TERT, кодирующий теломеразу, и ранний антиген SV40, в здоровые фибробласты легких (ФИГ. 3-15, SV11e, SV11-106: формирование колоний и возможность пассирования до 300 PDL или более длительного пассирования подтверждали с использованием анализа формирования колоний с мягким агаром), экспрессия являлась более высокой, за исключением MAF1, LTB4DH, чем в родительских клетках (TIG-1), или в не неопластических клетках с увеличенным временем жизни (TERT6e, TERT6-85: отсутствие формирования колоний и прекращение пролиферации клеток при 100 PDL или менее подтверждали с использованием анализа формирования колоний с мягким агаром). Это, по-видимому, происходит из-за того, что клетки, трансформированные in vitro, не всегда являются эквивалентными раковым клеткам человека.
Пример 2
Супрессия пролиферации раковой клетки посредством миРНК (малой интерферирующей РНК) определяющего иммортализацию гена
Чтобы анализировать какое отношение тринадцать видов определяющих иммортализацию генов, идентифицированных в примере 1, имеют к пролиферации раковой клетки, сконструированы и получены миРНК, определенные согласно последовательностям соответствующих генов. Их вводили в три вида штаммов раковых клеток (HeLa: рак шейки матки, KYSE150: рак пищевода и HCC50: рак толстого кишечника). С помощью этих образцов наблюдали супрессию экспрессии мРНК определяющего иммортализацию гена и эффект на пролиферацию клеток через 96 часов после введения.
(1) Конструирование и получение специфической для последовательности определяющего иммортализацию гена миРНК (малой интерферирующей РНК)
В каждом из тринадцати определяющих иммортализацию генов определяли два или четыре вида последовательностей специфических миРНК, и двухцепочечные миРНК, сформированные каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи, закупали из Qiagen и Japan Bio Service. Из полученных последовательностей миРНК только смысловые цепи показаны в таблицах 2 и 3. миРНК-1 каждого гена представляла собой эквимолярную смесь из двух видов.
Таблица 2
Таблица 3
(2) Культивирование штаммов раковых клеток человека
Три вида штаммов раковых клеток (HeLa: рак шейки матки, KYSE150: рак пищевода, и HCC50: рак толстого кишечника) культивировали в следующих условиях. HeLa культивировали в культуральной среде DMEM (Nacalai Tesque Inc.), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку (Sigma Corporation) и гентамицин (Sigma Corporation). KYSE150 и HCC50 культивировали в культуральной среде RPMI 1640 (Nacalai Tesque Inc.), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку и гентамицин.
(3) Введение гена специфической для последовательности определяющего иммортализацию гена миРНК в штамм раковой клетки
На сутки перед трансфекцией раковые клетки, предварительно культивированные, выделяли с использованием трипсина. После суспендирования в культуральной среде, подробно описанной в (2) выше, HeLa=1,2×104, KYSE150=2×104 и HCC50=1,5×104, рассевали в каждую лунку 24-луночного планшета. На сутки трансфекции среду заменяли бессывороточной средой Opti-MEM (Invitrogen), и миРНК, показанные в таблице 2 и 3, подвергали трансфекции с использованием олигофектамина (Invitrogen) или липофектамина 2000 (Invitrogen). Концентрация миРНК при трансфекции составляла 40 нМ на лунку. Контрольную (не вызывающую подавление транскрипции) миРНК (Qiagen) использовали в качестве отрицательного контроля.
(4) Анализ супрессии относительной экспрессии мРНК определяющего иммортализацию гена
Через одни сутки после трансфекции, подробно описанной в (3), тотальную РНК выделяли из каждого штамма раковых клеток с использованием RNeasy Mini (Qiagen) согласно сборнику инструкций. С использованием зонда для ОТ-ПЦР QuantiTect (Qiagen) и специфического для последовательности определяющего иммортализацию гена зонда TaqMan (ABI), количественный ОТ-ПЦР (использовали систему детекции последовательности ABI PRISM 7000 (изготовленную в ABI)) проводили в следующих условиях:
i) 50°C, 30 минут,
ii) 95°C, 15 минут,
iii) 94°C, 15 секунд→60°C, 1 минута × 35-45 циклов.
С использованием β-актина в качестве внутреннего стандарта уровень экспрессии переводили в цифровую форму на основании каждой кривой амплификации. В качестве контроля использовали значение для клетки, в которую вводили NS-последовательность миРНК. Измерение относительной экспрессии мРНК определяющего иммортализацию гена проводили дважды с одним и тем же геном-мишенью и с одними и теми же штаммами раковых клеток в тех же самых условиях.
На ФИГ. 16-28 показаны проценты относительного количества мРНК определяющих иммортализацию генов в клетках, в которые вводили каждую из миРНК, где процент мРНК определяющего иммортализацию гена в контроле принимали за 100%. Измерения показаны как мРНК-1 и мРНК-2 соответственно на ФИГ. 16-28. Супрессию экспрессии мРНК посредством любой из миРНК (миРНК-1 - миРНК-3) наблюдали для всех генов-мишеней.
(5) Измерение пролиферации штаммов раковых клеток
Пролиферацию штаммов раковых клеток измеряли с использованием реагента для измерения подсчета жизнеспособных клеток SF (Nacalai Tesque Inc.). Через 96 часов после трансфекции, подробно описанной в (3), 10 мкл реагента WST добавляли в каждую лунку. После 3-часовой инкубации при 37°C поглощение при 450 нм и 595 нм (контрольные длины волны) измеряли с использованием считывателя планшетов (Wallac ARVO MX1420 Multilabel Counter: изготовлен в Perkin Elmer). В соответствии с: поглощение при 450 нм - поглощение при 595 нм - поглощение при BG (только культуральная среда) данные переводили в цифровую форму и находили среднее значение для трех лунок. Затем значение показывали как процент, где процент для клетки с введением NS последовательности миРНК принимали за 100%. Измерение пролиферации штаммов раковых клеток проводили дважды с одним и тем же геном-мишенью и с одними и теми же штаммами раковых клеток в тех же самых условиях.
Соответствующие количества клеток после введения миРНК показаны как MTT-1 и MTT-2 соответственно на ФИГ. 16-28, где процент количества клеток после введения NS последовательности миРНК принимали за 100%. Для всех генов-мишеней супрессию пролиферации посредством одной из миРНК (миРНК-1 - миРНК-3) наблюдали в трех видах раковых клеток, что указывает на то, что эти тринадцать видов определяющих иммортализацию генов можно рассматривать как являющиеся молекулами-мишенями для достижения универсальной супрессии пролиферации иммортализованных раковых клеток.
Различение иммортализованных раковых клеток от смертных раковых клеток имеет значение для функционирования в качестве маркера заболевания, так же как для вклада в разработку лекарственных средств. Общий диагноз рака основан на патологических показателях, с помощью которых возможен также диагноз дифференцировки, атипии и т.д. Однако общие патологические анализы не позволяют оценить, являются ли клетки иммортализованными, иными словами, обладают ли клетки неограниченной продолжительностью жизни. Активация теломеразы человека до настоящего времени привлекает внимание в качестве маркера иммортализации. Однако, как показано выше, активацию теломеразы наблюдали также в некоторых здоровых клетках; таким образом, новая идея, что активация теломеразы не всегда немедленно приводит к иммортализации клеток, переходит в фактические знания. Кроме того, поскольку уровень экспрессии теломеразы является очень низким, хотя разработана иммунная система окрашивания, только несколько лабораторий опубликовали свои достижения (Hiyama E et al., Neoplasia 3: 17-26, 2001). Применение маркера по настоящему изобретению для детекции экспрессии определяющего иммортализацию гена позволяет отличать иммортализованные раковые клетки от клеток с ограниченной продолжительностью жизни. Такое различение не являлось возможным посредством общепринятого общего патологического диагноза. Настоящее изобретение, таким образом, обладает большим потенциалом для клинического применения, применимого для раннего диагноза, новых возможностей лечения, прогноза и т.п.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГ. 1 представляет собой схему, иллюстрирующую механизм злокачественного перерождения и иммортализации клетки человека.
ФИГ. 2 представляет собой схему, иллюстрирующую способ выделения гена-мишени в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена UBE2S в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 4 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена RFC4 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 5 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена PTGES2 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 6 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена MAF1 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 7 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена ACVR2B в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена FAM119A в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 9 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена LTB4DH в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 10 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена DPM2 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 11 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена SEPX1 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 12 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена PSMA3 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 13 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена CHCHD3 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 14 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена LSM3 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 15 представляет собой график, показывающий уровни экспрессии гена GTSE1 в различных иммортализованных раковых клетках, с использованием олиго-чипа.
ФИГ. 16 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена UBE2S и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 17 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена RFC4 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 18 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена PTGES2 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 19 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена MAF1 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 20 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена ACVR2B и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 21 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена FAM119A и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 22 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена LTB4DH и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 23 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена DPM2 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 24 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена SEPX1 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 25 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена PSMA3 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 26 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена CHCHD3 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 27 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена LSM3 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
ФИГ. 28 представляет собой график, показывающий эффект супрессии экспрессии гена GTSE1 и супрессии пролиферации клеток, вызываемый миРНК в штаммах раковых клеток (Пример 2).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ВИДЕ ТЕКСТА
SEQ ID NO:27 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (44-64) гена UBE2S.
SEQ ID NO:28 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (146-166) гена UBE2S.
SEQ ID NO:29 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена UBE2S.
SEQ ID NO:30 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена UBE2S.
SEQ ID NO:31 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (897-917) гена RFC4.
SEQ ID NO:32 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (189-209) гена RFC4.
SEQ ID NO:33 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена RFC4.
SEQ ID NO:34 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена RFC4.
SEQ ID NO:35 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (2003-2023) гена PTGES2.
SEQ ID NO:36 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (1105-1125) гена PTGES2.
SEQ ID NO:37 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена PTGES2.
SEQ ID NO:38 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена PTGES2.
SEQ ID NO:39 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (1538-1558) гена MAF1.
SEQ ID NO:40 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (1031-1051) гена MAF1.
SEQ ID NO:41 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена MAF1.
SEQ ID NO:42 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена MAF1.
SEQ ID NO:43 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (626-646) гена ACVR2B.
SEQ ID NO:44 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (208-228) гена ACVR2B.
SEQ ID NO:45 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена ACVR2B.
SEQ ID NO:46 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена ACVR2B.
SEQ ID NO:47 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (754-774) гена FAM119A.
SEQ ID NO:48 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (1068-1088) гена FAM119A.
SEQ ID NO:49 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена FAM119A.
SEQ ID NO:50 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена FAM119A.
SEQ ID NO:51 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (775-795) гена LTB4DH.
SEQ ID NO:52 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (658-678) гена LTB4DH.
SEQ ID NO:53 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена LTB4DH.
SEQ ID NO:54 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена LTB4DH.
SEQ ID NO:55 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (145-165) гена DPM2.
SEQ ID NO:56 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (84-104) гена DPM2.
SEQ ID NO:57 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена DPM2.
SEQ ID NO:58 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена DPM2.
SEQ ID NO:59 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (870-890) гена SEPX1.
SEQ ID NO:60 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (794-814) гена SEPX1.
SEQ ID NO:61 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена SEPX1.
SEQ ID NO:62 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена SEPX1.
SEQ ID NO:63 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (853-873) гена PSMA3.
SEQ ID NO:64 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (686-706) гена PSMA3.
SEQ ID NO:65 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена PSMA3.
SEQ ID NO:66 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена PSMA3.
SEQ ID NO:67 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (546-566) гена CHCHD3.
SEQ ID NO:68 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (1450-1470) гена CHCHD3.
SEQ ID NO:69 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена CHCHD3.
SEQ ID NO:70 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена CHCHD3.
SEQ ID NO:71 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (540-560) гена LSM3.
SEQ ID NO:72 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-1 (37-57) гена LSM3.
SEQ ID NO:73 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена LSM3.
SEQ ID NO:74 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена LSM3.
SEQ ID NO:75 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-2 гена GTSE1.
SEQ ID NO:76 представляет собой последовательность оснований смысловой цепи миРНК-3 гена GTSE1.
Изобретение относится к биотехнологии. Описан маркерный ген для определения иммортализации раковой клетки, причем маркерный ген представляет собой полинуклеотид, обладающий последовательностью, по меньшей мере, из 15 последовательных оснований. Представлен способ определения иммортализованной раковой клетки. Описан маркер иммортализации раковой клетки, представляющий собой полипептид. Представлено антитело к описанному маркеру. Описаны реагент для определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя, по меньшей мере, один член, выбранный из группы, состоящей из маркерного гена и антитела. Представлен способ скрининга вещества на супрессию пролиферации иммортализованных раковых клеток. Представлен ингибитор роста иммортализованной раковой клетки, содержащий в качестве активного ингредиента описанный полинуклеотид. Изобретение позволяет определять иммортализованную раковую клетку. 12 н. и 4 з.п. ф-лы, 28 ил., 3 табл., 2 пр.
1. Маркерный ген для определения иммортализации раковой клетки, причем маркерный ген представляет собой полинуклеотид, обладающий последовательностью, по меньшей мере, из 15 последовательных оснований, которая является комплементарной непрерывной последовательности, по меньшей мере, из 15 оснований внутри любой из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:1-13.
2. Маркерный ген по п.1, где маркерный ген представляет собой зонд или праймер.
3. Способ определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя стадии:
(1) связывания маркерного гена по п.1 или 2 с РНК, приготовленной из биологического образца, который является выделенным из тестируемого субъекта и который может содержать раковую клетку, или с производным РНК;
(2) измерения количества РНК или ее производного, связанных с маркерным геном, с использованием маркерного гена в качестве показателя; и
(3) сравнения количества РНК или ее производного, обнаруженных на стадии (2) (в общем обозначаемого как «количество РНК» здесь и далее), с количеством (в общем обозначаемым как «сравнительное количество РНК» здесь и далее) соответствующей РНК или ее производного в неиммортализованной здоровой или раковой клетке.
4. Способ определения иммортализованной раковой клетки по п.3, дополнительно включающий в себя стадию:
(4) определения, что раковая клетка тестируемого субъекта является иммортализованной, когда количество РНК, обнаруженное на стадии (2), выше, чем сравнительное количество РНК, и определения, что раковая клетка тестируемого субъекта не является иммортализованной, когда количество РНК, обнаруженное на стадии (2), не превышает сравнительное количество РНК.
5. Маркер иммортализации раковой клетки, представляющий собой полипептид, обладающий любой из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:14-26, кодируемых последовательностями оснований, представленными SEQ ID NO:1-13, соответственно.
6. Антитело для распознавания полипептида по п.5, где антитело специфично распознает полипептид, обладающий любой из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:14-26, и его получают из сыворотки или слитых клеток, полученных слиянием клеток селезенки и клеток миеломы, которые получают из животного, которое иммунизируют полипептидом, имеющим, по меньшей мере, 15 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, образующей полипептид из п.5.
7. Способ определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя стадии:
(1') связывания содержащей белок фракции, содержащей полипептид, полученной из биологического образца, который является выделенным из тестируемого субъекта и который может содержать раковую клетку, с антителом по п.6;
(2') измерения количества полипептида, связанного с антителом, с использованием антитела в качестве показателя и
(3') сравнения количества (в общем обозначаемого как «количество полипептида» здесь и далее) полипептида, обнаруженного на стадии (2'), с количеством (в общем обозначаемым как «сравнительное количество полипептида» здесь и далее) соответствующего полипептида в неиммортализованной здоровой или раковой клетке.
8. Способ определения иммортализованной раковой клетки по п.7, дополнительно включающий в себя стадию:
(4') определения, что раковая клетка тестируемого субъекта является иммортализованной, когда количество полипептида, обнаруженного на стадии (2'), выше, чем сравнительное количество полипептида, и определения, что раковая клетка тестируемого субъекта не является иммортализованной, когда количество полипептида, обнаруженное на стадии (2'), не превышает сравнительное количество полипептида.
9. Реагент для определения иммортализованной раковой клетки, включающий в себя, по меньшей мере, один член, выбранный из группы, состоящей из маркерного гена по п.1 и антитела по п.6.
10. Способ скрининга вещества на супрессию пролиферации иммортализованных раковых клеток, включающий в себя стадии:
(A) обеспечения клетки, эндогенно экспрессирующей один из определяющих иммортализацию генов, представленных SEQ ID NO:1-13, или трансфицирования клетки, способной экспрессировать экзогенный генетический материал, одним из указанных генов;
(B) приведения тестируемого материала в контакт с указанной клеткой;
(C) измерения уровня экспрессии одного из определяющих иммортализацию генов, представленных SEQ ID NO:1-13, в клетке, приведенной в контакт с тестируемым материалом;
(D) сравнения уровня экспрессии определяющего иммортализацию гена, обнаруженного на стадии (С), с уровнем экспрессии (в общем обозначаемым как «сравнительный уровень экспрессии» здесь и далее) определяющего иммортализацию гена в клетке, не находящейся в контакте с тестируемым материалом; и
(E) выбора тестируемого материала в качестве вещества-кандидата для супрессии пролиферации иммортализованных раковых клеток, когда уровень экспрессии, обнаруженный на стадии (С), ниже, чем сравнительный уровень экспрессии.
11. Способ скрининга вещества на супрессию пролиферации иммортализованных раковых клеток, включающий в себя стадии:
(А') приведения тестируемого материала в контакт с полипептидом по п.5;
(В') измерения активности полипептида, приведенного в контакт с тестируемым материалом;
(С') определения степени активности полипептида, обнаруженной на стадии (В'), путем сравнения активности полипептида, обнаруженной на стадии (В'), с активностью (в общем обозначаемой как «сравнительная активность» здесь и далее) полипептида, не находящегося в контакте с тестируемым материалом; и
(D') выбора тестируемого материала в качестве вещества-кандидата для супрессии пролиферации иммортализованных раковых клеток, когда активность полипептида, обнаруженная на стадии (В1), ниже, чем сравнительная активность.
12. Ингибитор роста иммортализованной раковой клетки, содержащий в качестве активного ингредиента полинуклеотид, обладающий последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований, которая является комплементарной непрерывной последовательности, по меньшей мере, из 15 оснований внутри любой из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:1-13.
13. Ингибитор роста иммортализованной раковой клетки по п.12, где полинуклеотид обладает одной из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:27-76.
14. Применение полинуклеотида, обладающего последовательностью, по меньшей мере, из 15 оснований, которая является комплементарной непрерывной последовательности, по меньшей мере, из 15 оснований внутри одной из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:1-13, для получения ингибитора роста иммортализованной раковой клетки.
15. Применение по п.14, где полинуклеотид обладает одной из последовательностей оснований, представленных SEQ ID NO:27-76.
16. Способ получения антитела для распознавания полипептида по п.5, где антитело специфично распознает полипептид, обладающий любой из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO:14-26, включающий стадии:
(5) иммунизации тестируемого животного полипептидом, имеющим, по меньшей мере, 15 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности, образующей полипептид из п.5; и
(6) выделения антитела из сыворотки или слитых клеток, полученных слиянием клеток селезенки и клеток миеломы, которые получают из указанного тестируемого животного.
| RU 2155066 С2, 27.08.2000 | |||
| ЕР 0001137943 В1, 29.03.2006. |
