СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АЭРОБНЫХ СПОРОВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ BACILLUS SUBTILIS Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/02 

Способ определения антибактериальной активности аэробных споровых микроорганизмов рода Bacillus.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторным методам определения свойств микробов-антагонистов.

Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам путем диффузии в мясопептонный агар с бумажного диска в чашках Петри (Справочник по микробиологическим и вирусологическим исследованиям. - М.: Медицина, 1982. - С.180-181).

Известен способ профилактики болезней органов дыхания и повышения продуктивности молодняка оленей путем использования пробиотика «Сахабактисубтил» из штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП, адсорбированных на цеолите (RU 2385729 C1, 10.04.2010 г.). Однако данный способ не применяется для определения антибактериальной активности аэробных споровых микроорганизмов в лабораторных условиях.

В основу изобретения положена задача разработки способа определения антибактериальной активности микробов-антагонистов в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Технический результат изобретения - способ эффективного определения антагонистических свойств микробного препарата путем помещения цеолита Хонгуринского месторождения, адсорбировавшего микробы-антагонисты, на Чашки Петри с тест-культурами. В качестве микробов-антагонистов используют штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП. Гранулы цеолита, обработанные суспензией штаммов бактерий, обладают антагонистическими свойствами в отношении тест-культур Е. coli, Str. aureas, Sal. Typhimurium.

Технический результат изобретения достигается следующим образом.

Штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THП-5-ДЕП адсорбируют на цеолите Хонгуринского месторождения. Гранулы цеолита, адсорбировавшие микроорганизмы, помещают в чашки Петри посеянными с тест-культурами микроорганизмов и учитывают антибактериальную активность микробов-антагонистов по зоне задержки роста условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Микроорганизмы, адсорбированные на цеолите, задерживают рост и развитие условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

В качестве микроба-антагониста используют штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THП-5-ДЕП, депонированные в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ). Справки о депонировании выданы 6 февраля 2001 г. за №180/15 и №181/15.

Штаммы бактерий могут быть получены в лаборатории по разработке микробных препаратов ГНУ Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии и ВГНКИ.

Штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THП-5-ДЕП выращивают в мясопептонном агаре рН 7,0-7,2 в течение 5 суток при 37°C, а затем суспензируют в равных соотношениях в физиологическом растворе хлористого натрия в концентрации 2 млрд KOE/мл.

Цеолит Хонгуринского месторождения фракции 2-5 мм отмывают, сушат при 150°C. Затем цеолит помещают в суспензию, содержащую 2 млрд KOE/мл штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THР-5-ДЕП на 60 минут при комнатной температуре из расчета 5 г цеолита на 20 мл суспензии микроорганизмов.

В качестве тест-культур используют штаммы бактерий Е. coli-1257, Str. aureas-209P, Sal. Typhimurium. Посев тест-культур производят по всей поверхности мясопептонного агара в чашках Петри.

Гранулы цеолита после выдержанной экспозиции помещают на середину чашки Петри и ставят в термостат при 37°C. Просмотр роста микроорганизмов в чашках проводят через 72 часа.

В качестве контроля на чашки Петри помещают цеолит, обработанный дистиллированной водой, и бумажные диски с адсорбированными штаммами бактерий-антагонистов Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THП-5-ДЕП.

В чашках Петри с микробами-антагонистами, адсорбированными на цеолите, отсутствует рост условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Отмечается рост штаммов бактерий subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THП-5-ДЕП.

В чашках с цеолитом, обработанным только дистиллированной водой, отмечается рост тест-культур. В пробах с бумажными дисками отмечается рост тест-объектов по краям чашек и рост микробов-антагонистов вокруг дисков.

Таким образом, гранулы цеолита Хонгуринского месторождения, адсорбировавшего штаммы бактерий-антагонистов Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis THП-5-ДЕП, можно использовать для определения антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Результаты по изучению антагонистических свойств штаммов Bacillus subtilis, адсорбированных на цеолите-хонгурине

№ Тест-культуры Результаты просмотра посевов 2 млрд КОЕ/мл 24 ч 72 ч 5 суток Цеолит + Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП 1 E. coli - - - 2 Sal. typhimurium ± - - 3 Str. aureas - - - Контроль (цеолит+вода) 1 E. coli + + + 2 Sal. typhimurium + + + 3 Str. aureas + + + Контроль (бумажные диски+Bacillus subtilis) 1 E. coli ± ± ± 2 Sal. typhimurium ± ± ± 3 Str. aureus ± ± ± Обозначение: (-) - сплошной рост микроба антагониста; (+) - рост тест-культуры; (±) - единичный рост колоний тест-культуры и сплошной рост антагониста.

Способ может быть использован в биотехнологии и ветеринарии. Для определения антибактериальной активности аэробных споровых микроорганизмов Bacillus subtilis проводят посев тест-культур по всей поверхности мясопептонного агара в чашках Петри. Подготавливают гранулы цеолита Хонгуринского месторождения в течение 60 мин при комнатной температуре и обрабатывают их суспензией штаммов бактерий-антагонистов Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП. Помещают их на чашки Петри. Инкубируют и учитывают результаты посева по силе роста бактерий антагонистов после 72 ч инкубирования. Это обеспечивает эффективность определения антибактериальной активности бактерий. 1 табл.

Способ определения антибактериальной активности аэробных споровых микроорганизмов Bacillus subtilis, включающий посев тест-культур по всей поверхности мясо-пептонного агара в чашках Петри, приготовление суспензии штаммов-антагонистов Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП, содержащей 2 млрд KOE/мл, обработку полученной суспензией приготовленных гранул цеолита Хонгуринского месторождения в течение 60 мин при комнатной температуре с последующим помещением их на чашки Петри, инкубацию и учет результатов посева по силе роста бактерий антагонистов после 72 ч инкубирования.