СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 G01N33/15 C12Q1/02 

Изобретение относиться к биотехнологии, а именно к способам определения антагонистической активности пробиотических штаммов.

Известен способ определения антагонистической активности пробиотиков (патент РФ №2000118391, G01N 33/48 от 2002 г.), включающий воздействие пробиотика на бактериальную тест-культуру, характеризующийся тем, что в качестве тест-культуры используют люминесцентные бактерии, а антагонистическую активность пробиотика оценивают по изменению интенсивности биолюминесценции бактерий тест-культуры.

Однако данный способ предназначен для контроля уже разработанных пробиотических препаратов, не позволяет оценивать их антагонистическую активность в отношении представителей условно-патогенной микрофлоры.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому, и взятый за прототип, является способ контроля антагонистической активности препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов, основанный на определении отсроченного антагонизма на плотной питательной среде в отношении изо-, гомо- и гетерогенных производственных штаммов бактерий, применяемых в производстве препаратов для лечения и профилактики дисбактериозов (патент RU 2177152 С2, опубл. 20.12.2001).

Недостаток данного способа также заключается в тестировании ограниченного количества культур пробиотических штаммов и оценке антагонистической активности в отношении непатогенных микроорганизмов. Таким образом, данный метод ограниченно годен для поиска новых пробиотических штаммов бактерий антагонистичных в отношении условно-патогенной микрофлоры, и в большей степени предназначен для контроля анатагонистической активности уже имеющихся пробиотических штаммов.

Технической задачей заявляемого решения является одновременное определение способности подавлять ползучий рост в отношении представителя условно-патогенной микрофлоры Р.vulgaris, культур, растущих на мясопептонном агаре, а также расширение спектра морфологических критериев роста различных изолятов первично-высеваемых культур.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения антагонистически активных штаммов бактерий, включающем выделение чистых культур бактерий и изучение их роста в присутствии тест-штамма, согласно изобретению, первичный посев производят на богатую питательную среду типа уриселект 4, после чего осуществляют пересев на мясопептонный агар культур, различающихся по морфологическим критериям и ферментативной активности, а в качестве тест-штамма используют Р.vulgaris.

Сущность изобретения заключается также в том, что посев исследуемых культур и тест-штамма производят одновременно.

Сущность изобретения заключается также в том, что культуры потенциальных пробиотических штаммов, которые не были подавлены ползучим ростом подвижного штамма Proteus vulgaris, считаются антагонистичными в отношении данного вида микроорганизма.

Способ осуществляют следующим образом.

Материал: источник бактерий, потенциально содержащий антагонистически активные бактерии, растущие на мясопептонном агаре, чашки Петри с питательной средой уриселект 4, чашки Петри с мясопептонным агаром, культура тест-штамма Proteus vulgaris.

Для выделения антагонистически активных штаммов бактерий, культивируемых на мясопептонном агаре, из исследуемого материала готовят суспензию или смыв, который сеют на чашку Петри со средой уриселект 4 способом, позволяющим получить единичные колонии.

После культивирования посевов из единичных колоний, различающихся друг от друга по цвету, форме, краям, размерам и прочим, визуально различимым признакам, делают посевы на чашку с мясопептонным агаром, в виде цифр или мелких штрихов, одновременно с краю чашки Петри, свободном от посевов исследуемых культур, уколом засевают культуру тест-штамма Proteus vulgaris. Чашку Петри с посевами культивируют при температуре 37°С до зарастания культурой тест-штамма Proteus vulgaris всей поверхности чашки Петри.

Культуры потенциальных пробиотических штаммов, которые выросли в виде цифр или штрихов и образовали зоны задержки роста, и соответственно, не были подавлены ползучим ростом подвижного штамма Proteus vulgaris, считают антагонистичными в отношении данного вида микроорганизма.

Для иллюстрации способа приведены примеры.

Пример 1. С целью проверки эффективности поиска культур, обладающих антагонистической активностью, готовят суспензию из подстилки животноводческого помещения, серийные десятикратные разведения этой суспензии высевают на чашки Петри со средой уриселект 4. После инкубации в термостате, в нескольких предельных разведениях, определяют единичные колонии бактерий, различающиеся по цвету, форме, размерам, характеру поверхности и т.д. (всего 6 типов). Из каждого типа колоний были сделаны посевы на мясопептонный агар в виде отдельных цифр. Одновременно посеяли культуру Р.vulgaris. После культивирования в термостате при 37°С 24 ч было обнаружено 2 культуры, имеющие четко выраженные зоны задержки роста.

Таким образом, в приведенном примере видна возможность одномоментного тестирования не менее 5 культур на одном секторе 3-секторальной чашки Петри (и, соответственно, не менее 15-18 культур на одной 3-секторальной чашке Петри, при этом наличие 3-х разных хромогенных субстратов в составе питательной среды уриселект 4, используемой для первичного выделения чистых культур, позволило выявить 6 разных культур, в то время как при культивировании на мясопептонном агаре различия между колониями были менее выражены и визуально выделяли лишь 2 различимых типа колоний).

Пример 2. Для сравнения предложенного способа в плане специфичности с общеупотребимым методом суспензии 2-х культур, обладающих, и 2-х культур, не обладающих антагонистичной активностью, по результатам предложенного нами способа смешивают с суспензией бактерий тест-штамма Proteus vulgaris в одинаковых концентрациях, в качестве контроля берут чистые культуры.

После культивирования проводили высев серийных разведении смесей культур и чистых культур на среду уриселект 4 и после инкубации в термостате при 37°С подсчитывали колонии Proteus vulgaris и исследуемых культур.

Таблица

 Культура 1*Культура 2*Культура 3**Культура 4**Тестируемая культура, кое/мл6,7×10⁶4,2×10⁷1,3×10⁴2,4×10²P.vulgaris, кое/мл2,5×10²1,8×10³3,6×10⁵3,9×10⁵Примечание: * - культура, обладающая антагонистической активностью в отношении Р.vulgaris, ** - культура не обладающая антагонистической активностью в отношении Р.vulgaris.

Как следует из таблицы, заявляемый способ не уступает аналогу по способности различать культуры микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью.

Таким образом, заявляемый способ позволяет проводить эффективный поиск штаммов бактерий, обладающих антагонистической активностью в отношении такого представителя условно-патогенной микрофлоры, как Р. vulgaris, путем тестирования больших количеств широкого спектра видов микроорганизмов, культивируемых на мясопептонном агаре. В связи с этим мы можем считать целесообразным использование заявленного нами способа с целью разработки пробиотиков.

Изобретение относиться к биотехнологии, а именно к способам определения антагонистической активности пробиотических штаммов. Сущность способа: выделяют чистые культуры бактерий, первичный посев производят на богатую питательную среду типа уриселект 4, после чего осуществляют пересев на мясопептонный агар культур, различающихся по морфологическим критериям и ферментативной активности, изучают их рост в присутствии тест-штамма Proteus vulgaris. Культуры, которые не были подавлены ползучим ростом подвижного штамма Proteus vulgaris, считаются антагонистичными в отношении данного вида микроорганизма. Использование способа позволяет проводить массовый поиск широкого видового спектра пробиотических штаммов бактерий, обладающих антагонистической активностью в отношении Р.vulgaris, путем тестирования больших количеств культур микроорганизмов, высеваемых из разнообразных источников. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения антагонистически активных штаммов бактерий, включающий выделение чистых культур бактерий и изучение их роста в присутствии тест-штамма P.vulgaris, отличающийся тем, что первичный посев производят на богатую питательную среду типа уриселект 4, после чего осуществляют пересев на мясопептонный агар культур, различающихся по морфологическим критериям и ферментативной активности, а в качестве тест-штамма используют P.vulgaris.2. Способ по п.1. отличающийся тем, что посев исследуемых культур и тест штамма производят одновременно.3. Способ по п.1. отличающийся тем, что культуры потенциальных пробиотических штаммов, которые не были подавлены ползучим ростом подвижного штамма Proteus vulgaris, считаются антагонистичными в отношении данного вида микроорганизма.