ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ СЕМЕЙСТВА ГЕРПЕС-ВИРУСОВ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/63 A61P31/22 

Изобретение относится к медицине, а именно к синтетическим биологически активным производным карбопентоксисульфаниловой кислоты.

Завяленное вещество имеет выраженную противовирусную активность, направленную, преимущественно, против различных вирусов семейства герпеса.

Может быть использовано в медицине, ветеринарии и косметологии, для профилактики и лечения заболеваний, связанных с семейством герпес-вирусов.

Одну из наиболее серьезных проблем современной медицины представляют вирусные инфекции, большинство из которых крайне плохо поддается лечению или вообще не имеет адекватной противовирусной терапии. Это связано как с недостаточной эффективностью существующих препаратов, так и быстрой изменчивостью возбудителей, приводящей к появлению устойчивых форм (http://www.medinfo.ru/sovety/derm/02.phtml).

Схожие проблемы актуальны и для ветеринарии.

Наиболее используемыми препаратами для лечения широко распространенных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса, являются ацикловир - синтетический ациклический аналог дизоксигуанозина и фамвир (фамцикловир), который трансформируется в организме в активное противовирусное соединение - пенцикловир (http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_1843.htm). Каждый из этих препаратов имеет определенные недостатки. Ацикловир менее активен по отношению к вирусам герпеса второго типа, фамцикловир имеет расширенные противопоказания, однако значительная часть циркулирующих герпес-вирусов в настоящее время приобрела устойчивость к этим длительно используемым препаратам (P.A.Furman, D.M.Coen, M.H.St.Clair and P.A.Schaffer Acyclovir-resistant mutants of herpes simplex vims type 1 express altered DNA polymerase or reduced acyclovir phosphorylating activities. J. Virol., 1981, December; 3: 936-941) (копия ссылки прилагается).

В качестве прототипа выбран наиболее распространенный противогерпетический препарат - ацикловир - 2-амино-1,9-дигидро-9-[(2-гидроксиэтокси)метил]-6Н-пурин-6-он, (http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_290.htm) (копия ссылки прилагается):

.

Его недостатком является отмеченное выше обстоятельство - приобретенная устойчивость к данному препарату большой части герпес-вирусов.

Задачей настоящего изобретения является создание препарата с выраженной активностью против вирусов герпеса.

Согласно изобретению эта задача решается путем синтеза нового вещества, представляющего собой соль (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты общей формулы:

,

где X - Na, К, NH₄; лекарственное средство может содержаться в таблетках, в том числе сублингвальных, или в капсулах, или в суппозиториях, или в каплях, или в микстурах, или в мазях, кремах или других формах для нанесения на кожу и слизистые, или в орально-букальной пленке, или в спрее, или в жидкости для парентерального введения, или в жевательной резинке.

Синтез заявленного вещества осуществляется в несколько этапов.

I. Синтез амилового эфира фенилкарбаминовой кислоты.

К 11,5 г (0,096 моль) фенилизоцианата, помещенного в стакан, по каплям при перемешивании прибавили 8,5 г (0,096 моль) амилового спирта. Наблюдали разогрев реакционной массы. Через 1 час смесь затвердела в виде бесцветных кристаллов. Выход амилового эфира фенилкарбаминовой кислоты - около 100%.

II. Синтез хлорангидрида карбопентоксисульфаниловой кислоты.

К 17,5 г (0,150 моль) хлорсульфоновой кислоты, нагретой до 30°С, при перемешивнии медленно прибавили 2,07 г (0,010 моль) амилового эфира фенилкарбаминовой кислоты, поддерживая температуры реакционной массы не выше 35°С. Затем медленно нагревали смесь до 50°С и выдерживали ее при температуре 50-55°С в течение 2 часов. Полученную сульфомассу при перемешивании вылили на лед, поддерживая температуру не выше 20°С. Осадок отфильтровали, промыли ледяной водой до рН фильтрата 7. Осадок сушили на воздухе, а затем в эксикаторе. Выход хлорангидрида карбопентоксисульфаниловой кислоты около 100%.

III. Синтез (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты.

К смеси 2,2 г 2,6-дихлоранилина (0,0136 моль) и 3,23 г пиридина (0,0406 моль) при температуре 85°С порциями прибавляли 6,2 г хлорангидрида карбопентоксисульфаниловой кислоты (0,0203 моль). Затем в течение 45 мин перемешивали реакционную массу при температуре 80°С. После к массе добавляли 20 мл горячей воды, подкисляли смесь соляной кислотой до рН 3-4 и охлаждали до комнатной температуры. Полученный осадок отфильтровали, промыли водой до исчезновения запаха пиридина и высушили. После перекристаллизации из 80% этанола выход целевого продукта составил 2,5 г (40% от теоретического).

IV. Синтез конечного продукта - натриевой соли (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты.

В 5 мл этилового спирта (абс.) растворили 0,232 г едкого натра и в 30 мл этилового спирта (абс.) растворили 2,5 г (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты. Затем смешали два раствора и перемешивали 20 минут. После отогнали этиловый спирт под вакуумом. Оставшийся осадок высушили. Выход продукта составил 2,1 г (80% от теоретического).

Синтез калиевой и аммониевой солей осуществляется аналогично.

Индивидуальность веществ доказана методом тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol UV-254, элюент четыреххлористый углерод - изопропанол=2:1. Структура синтезированных веществ доказана методом ПМР спектроскопии.

Таблица 1 Физико-химические характеристики целевых соединений. Х Т плав., °С ПМР спектр, м.д. NH Ar ОСН₂ СН₃, СН₂ Na (I) 120 9,75; 9,9 7,2-7,7 4,1 0,9; 1,38; 1,62 К (II) 123 9,8; 10,0 7,3-7,8 4,15 0,94; 1,42; 1,65 NH₄ ⁺ (III) 110 (разл.) *) *) 4,2 0,91; 1,40; 1,63 *) Область ПМР спектра аммониевой соли в слабом поле (>7 м.д.) не является характеристичной: наблюдается один широкий сигнал, обусловленный образованием в растворе сильных водородных связей.

Противовирусная активность заявляемого вещества была определена на модели пневмонии у белых мышей, вызванной вирусом простого герпеса 1 типа.

Вирус простого герпеса 1 типа (штамм ЕС) накапливали в клетках Vero, выращенных на среде MEM с добавлением 0,2% сыворотки крупного рогатого скота, 50 мкг/мл гентамицина. Титрование вируса проводили на клетках Vero, выращенных в 96-луночных планшетах. Учет разультатов проводили после появления выраженного цитопатического действия (ЦПД) в контроле вируса. Визуально оценивали степень интактности клеточного монослоя, за титр вируса принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного материала, способного вызвать визуальные проявления ЦПД в культуре клеток (CTD50).

Для оценки вирусоингибирующего действия препаратов белые беспородные мыши весом 12-15 г (питомник «Рапполово», Ленинградская область) были заражены интраназально под легким эфирным наркозом вирусом простого герпеса в дозе 106 (CTD50)/0,05 мл. Тестируемый препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса по лечебно-профилактической схеме (за 24 и 1 час до заражения, через 24 и 48 часов после заражения животных). На третий день легкие зараженных животных извлекали, гомогенизировали в присутствии 10-кратного объема фосфатного буфера и готовили из них 10-кратные разведения от 10-1 до 10-6. Разведения гомогената легких использовали для заражения интактной культуры клеток Vero и титрования вирусного потомства. Положительным контролем служили легкие мышей, которым вместо исследуемого препарата вводили внутрибрюшинно физиологический раствор, отрицательным - легкие мышей, которым по той же схеме вводили ацикловир в дозе 50 мг/кг веса. В каждой опытной группе было по 10 животных.

Материал легких также был изучен гистологически.

Таблица 2 Результаты титрования вируса. Препарат Титр вируса в легких мышей на 3 сутки после инфицирования, Lg CTD₅₀ Контроль 3,6±0,15 Заявленное вещество 1,0±0,11 Ацикловир 1,4±0,34

Как видно из представленных данных, препарат обладает достоверной вирусингибирующей активностью на модели герпетической пневмонии in vivo и превосходит ацикловир в той же дозе.

Таблица 3 Морфометрические показатели динамики патологического процесса в легких инфицированных животных в условиях применения химиопрепаратов на различных сроках герпетической пневмонии. Препарат Срок опята (в сутках) Количество очагов воспаления у одного животного Площадь очага воспаления в срезе Контроль 2 10 76±5,9 4 10 405±111,3 6 10 343±47,5 Ацикловир 2 8 55±9,4 4 3 58±14,7 6 3 24±6,4 Заявленное вещество 2 3 47±7,3 4 2 49±12,1 6 1 14±5,5

Определение активности против вирусов герпеса 1-го и 2-го типов.

Вирус простого герпеса (штамм ЕС) выращивали в культуре клеток Vero, выращенных на среде MEM с добавлением 0,2% сыворотки крупного рогатого скота и тестируемых препаратов 50 мг/л.

Таблица 4 Противовирусная активность. Препарат Число (%) неизмененных клеток Вирус герпеса 1-го типа Вирус герпеса 2-го типа Контроль (неинфецированные клетки) 10000 (100%) 10000 (100%) Ацикловир 7000 (65%) 7000 (70%) Заявленное вещество 8000 (80%) 9000 (90%)

Таким образом, установлено, что противовирусная активность заявленного вещества существенно превосходит таковую у ацикловира, в особенности против вируса герпеса 2-го типа.

Заявленное вещество может содержаться в таблетках или в капсулах, или в суппозиториях, или в каплях, или в микстурах, или в мазях, кремах, или других формах для нанесения на кожу и слизистые, или в орально-букальной пленке, или в спрее, или в жидкости для парентерального введения, или в жевательной резинке.

Заявленное вещество проявляет, практически, одинаковую противовирусную активность при Х=Na, К или NH₄.

Изобретение относится к медицине, а именно средству с активностью против семейства герпес-вирусов, представляющему собой соль (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты общей формулы:

где X - Na, К, NH₄. Изобретение обеспечивает новое средство, обладающее выраженной активностью против вирусов герпеса. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Лекарственное средство с активностью против семейства герпес-вирусов, отличающееся тем, что представляет собой соль (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты общей формулы:

где Х - Na, К, NH₄.

2. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что содержится в таблетках, в том числе, сублингвальных, или в капсулах, или в суппозиториях, или в каплях, или в микстурах, или в мазях, кремах или других формах для нанесения на кожу и слизистые, или в орально-букальной пленке, или в спрее, или в жидкости для парентерального введения, или в жевательной резинке.