Штамм культивируемых клеток растений LIтноSреRмUм сRYтнRоRнIRоN SIев ет ZUcc - продуцент шиконина Советский патент 1992 года по МПК C12N5/04 C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

Шиконин обладает бактерицидным, противоопухолевым, рано.заживляющим и анти- оксидантным действием; за рубежом используется в медицине, а также в парфюмерии и пищевой промышленности. В Японии воробейник краснокорневой выращивается на плантациях, при этом в течение 5-7 лет в его корнях накапливается до 2 % шико- нина. В настоящее время в Японии освоено биотехнологическое получение шиконина

1.

Известно, что за рубежом получены каллусные культуры растений воробейника краснокорневого, продуцирующие шиконин. В этих культурах содержание шиконина колеблется в пределах 1,7-2,5% от сухой массы каллусов 2.

Описание каллусных культур, их характеристик в литературе отсутствует, также

отсутствуют ссылки на депонирование штаммов - продуцентов шиконина в доступных коллекциях.

Цель изобретения - получение штамма культивируемых клеток воробейника краснокорневого, продуцирующего шиконин.

Такой штамм получен в Биолого-почвенном институте ДВО АН СССР и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений при Институте физиологии растений СН СССР им. К.А.Тимирязева под номером ВСКК (ВР) N° 36. Наименование штамма - ВК-39.

Штамм ВК-39 характеризуется следующими признаками.

Исходный материал: корень дикорэсгу- щего растения воробейник краснокорневой (Lithospermum crythrorhizon Sieb. et Zucc.), заготовленный в Партизанском районе Приморского края в 1986 г. Для посадки в культуру in vitro отобран корень интенсивно-красного цвета диаметром 20

(Л

С

vj о VI

о VI

СО

мм. Эксплантаты изолировали из корневых дисков толщиной 2-3 мм. Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции красного цвета. Ростовой индекс 15 для каллусов начальной массой 150 кг, содержание сухого вещества 5,8 - 6,0% от сырой биомассы. Способ культивирования - выращивание в накопительном режиме при отсутствии освещения при 25 ± 1°С, относительной влажности воздуха 70 ± 10% на питательной среде следующего состава, мг/л воды:

МН4МОз350-450 КМОз 1500-2300 КН2Р04 150-190 CaClt 6H20 590-680 Мд504-7Н20 350-400 НзВОз 4,2-8,0 MnS04 4H20 15,6-26,7 CoCl2 2H20 0,02-0,03 CuS04 5H20 0,07-0,08 ZnS04-7H20 6,0-10.3 Na2MoOv2H:0 0,2-0,3 Kt 0,53 - 0,90 FeS047H20 25,0-30,5 Гидрохлорид тиамина 0,15-0,25 Гидрохлорид пиридоксина 0,4-0,6 Никотиновая кислота 0,4-0,6 мезо-Инозит 80-120 Индолилуксусная кислота 0,15-0,25 Кинетин 1,5 - 2.5 Сахароза 25 - 35 г Агар 5,8-6,2 г Динэтриевая соль ЭДТА 33,6-41,0 причем рН сред до автоклавирсвания 5,6 - 5,8.

Номер пассажа 35-й, пассивирование каллусов проводят с интервалом 25 сут, сбор каллусов для получения из них шико- нина - после 35 сут культивирования.

Цитологическая и кариологическая характеристика.

Ткань содержит клетки овальной формы среднего размера мкм. Максимум ми- тотической активности наблюдается на 6-й день культивирования. Распределение клеток по числу хромосом следующее:

исло хромосом 28 36 42 48 56

% клеток 22 20 14 13 31

Способность к морфогенезу.

Редко наблюдается спонтанный ризогеХарактеристика биосинтеза шиконина. Содержание шиконина в каллусах увеличивается параллельно с ростом культуры и достигает 5 - 6% от сухой биомассы на 35-й день культивирования. Достигнутый уровень продуктивности стабильно сохраняется при пассивировании культуры в течение 2 лет. Шиконин накапливается только в клетках и в среду не выделяется.

П р и м е р. В колбы Эрленмейерз емкостью 100 мл разлили по 30 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:

МН4МОз400

КМОз 1900

КН2Р04170

CaCl2- 6НгО655

fogS04-7H20370

НзВОз6,2

MnSCM 4H2022,3

CoCl2-2H200,025

CuSCM-5H200,075

ZnS04-7H208,6

Па2Мо04-2Н200,25

К 0,83

FeS04-7H2027.8

Динатриевая соль ЭДТА37.3

Гидро лорид тиамина02

Гидрохлорид пиридоксина0,5

Никотиновая кислота 0,5

мезо- Инозит100

Инд- липуксусная кислота0.2

Кинетин2

Сахароза200QO

Агар6000

рН 5.6-5.8. . .

Колбы со средой автоклавировали пои 117°С в течение 20 мин, затем охлаждали. На поверхность агара помещали каллусы штамма ВК-39 - по три инокулята массой 150 мг в каждую колбу. Культуры инкубировали в темноте при 25°С и относительной влажности воздуха 70% в течение 35 сут. Затем каллусы извлекли из колб и взвесили (данные в таблице). После сушки каллусов в течение 6 ч под током горячего (50°С) воздуха в них определяли содержание шиконина. Для этого каллусы из каждой колбы отдельно измельчали в ступке. Точную навеску (в пределах 30 мг) экстрагировали гексаном в соотношении 1:100. Аликвоту экстракта в количестве 25 мкл разбавляли гексаном до 900 мкм, затем добавляли 100 мкл раствора КОН. Оптическую плотность растворов за- 5 меряли при длине волны 622 нм на спектрофотометре, .концентрацию шиконина определяли по калибровочному графику. Содержание шиконина в пробах составило 5,5-5,8%.

В таблице представлены данные исследований содержания шиконина в каллусах штамма ВК-39.

Полученный штамм ВК-39 кэллусной культуры воробейника краснокорневого позволяет при выращивании на одной питательной среде получить одновременно с хорошим ростом высокое содержание шиконина. Содержание шикснина в клетках штамма ВК-39 в 2 - 3 раза превышает его содержание в корнях интактного растения. Формула изобретения Штамм культивируемых клеток растений Lithospermum erythrorhizcn Sieb. et Zucc. - BCKK (BP) № 36 - продуцент шиконина.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности. Цель изобретения - получение каллусного штамма воробейника крас- нокорневого, продуцирующего шиконин. Каллусный штамм воробейнике крзснокорне- вого ВК-39 получен в результате селекции калуссов корневого происхождения. Ростовой индекс культуры 15, содержание шикони- на5-6% от сухой массы клеток. 1 табл,