Описание изобретения
Настоящая заявка заявляет приоритет временной заявки на патент США № 60/904787, зарегистрированной 5 марта 2007 года, которая включается сюда в качестве ссылки во всей ее полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к экстрактам бактериальных штаммов, пригодным для использования при лечении таких показаний, как расстройства пищеварительного или мочевого тракта, к композициям, содержащим эти экстракты, и к способам получения экстрактов с использованием сред, которые не вызывают риска появления прионного заболевания.
Уровень техники и сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим бактериальные экстракты, пригодным для использования при лечении таких показаний, как расстройства мочевого или пищеварительного тракта. Экстракты могут содержать бактериальные лизаты из культур, выбранных из одного или более штаммов Escherichia coli. В некоторых вариантах осуществления экстракты могут содержать один или более видов, выбранных из следующих штаммов E.coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089. Эти штаммы хранятся в соответствии с Будапештским договором. Штаммы, показанные в списке с номером, содержащим I, индексируются Collection Nationale de Culture des Microorganismes, Institute Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris, France. Все другие штаммы индексируются National Collection of Type Cultures in London.
В некоторых вариантах осуществления экстракт приготавливают из всех этих штаммов. В других вариантах осуществления выбирают только некоторые из штаммов. В некоторых вариантах осуществления, например, один или более штаммов выбирают из группы "I" и один или более штаммов выбирают из группы "NCTC".
В некоторых вариантах осуществления один или более конкретных штаммов, перечисленных выше, могут отсутствовать или заменяться другим штаммом E.coli или других видов бактерий.
Экстракты могут быть получены способом щелочного лизирования после того, как клетки выращивают до получения соответствующей оптической плотности в культурной среде. В некоторых вариантах осуществления каждую из бактерий выращивают на среде, которая не вызывает риска появления заболевания, родственного прионному, или риска других заболеваний, которые могут передаваться через потребление продуктов, полученных из среды на животной основе. Например, в некоторых вариантах осуществления для выращивания клеток используется среда на растительной основе, такая как среда на основе сои. В некоторых вариантах осуществления для роста клеток может использоваться синтетическая среда или среда, содержащая биологические экстракты, такие как экстракт дрожжей и лошадиная сыворотка, которые также не дают рисков появления таких заболеваний.
Лизаты могут также фильтроваться для удаления нуклеиновых кислот и клеточных остатков больших размеров. Вследствие фильтрации в некоторых вариантах осуществления количество нуклеиновой кислоты, присутствующей в экстрактах, менее чем 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления несолюбилизированные соединения, такие как остатки оболочек клеток, и недостаточно деградированные липополисахариды (LPS) также удаляют фильтрацией. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления полученный экстракт содержит растворимые молекулярные компоненты и не содержит значительных количеств нерастворимого материала или материала в виде частиц.
Сахаридные компоненты, включая липополисахаридные (LPS) компоненты, могут консервироваться в экстрактах. В течение процесса лизирования сахариды могут химически модифицироваться, например, расщепляться на более мелкие структуры или замещаться другими функциональными группами.
Рацемизация аминокислот в течение процесса лизирования также создает D-аминокислоты из существующих в природе L-аминокислот, находящихся в природных белках. D-аминокислоты могут быть полезны при увеличении времени эффективности экстрактов, поскольку они не перевариваются эффективно в кишечнике у млекопитающих. Таким образом, антигенные молекулы в экстрактах, которые химически модифицируются во время лизирования, чтобы они содержали D-аминокислоты, остаются в организме пациента в течение продолжительного времени, делая потенциально возможным более сильное иммуностимулирующее действие.
Хотя бактериальные экстракты используются в предшествующем уровне техники для стимулирования иммунной системы против заболеваний пищеварительного и мочевого тракта, имеется необходимость в лучшей стандартизации и контроле этих экстрактов, чтобы сделать их более безопасными, более эффективными и более долгодействующими. Например, ранее считалось, что сахаридные компоненты, включая потенциально токсичные липополисахаридные (LPS) компоненты, должны удаляться из бактериальных экстрактов по причинам безопасности. (См., например, патент США № 5424287.) Однако настоящее изобретение предусматривает способ, который приводит в результате к химической модификации компонентов LPS, достаточной для того, чтобы сахариды безопасно удерживались. Удерживание этих компонентов может улучшить эффективность, а также обеспечить дополнительные антигены.
Например, авторы обнаружили, что мониторинг pH и времени лизирования делает возможным достаточное разложение потенциально аллергенных или токсичных компонентов клеточных оболочек. Известные ранее условия лизирования при более низких pH или более коротком времени, в противоположность этому, дают экстракты, в которых компоненты клеточных оболочек и LPS недостаточно модифицируются химически. (См., например, патент Великобритании GB 2054374 A). Полученные экстракты являются слишком аллергенными, чтобы безопасно вводиться пациентам. В целом, авторы обнаружили, что продукты, лизируемые при слишком низких pH и/или при слишком коротком времени, имеют более высокую токсичность, более низкую экстракцию белка и более низкую фильтруемость.
В дополнение к этому, согласно настоящему изобретению выращивают бактериальные штаммы в культурных средах, которые не дают рисков появления заболеваний, таких как прионные заболевания.
Способ фильтрации может также влиять в некоторых случаях на свойства полученного экстракта, поскольку размер пор фильтра и, иногда, химические свойства поверхности фильтра изменяют тип материалов, которые удаляются и удерживаются. Например, настоящее изобретение использует способ фильтрации, который удерживает определенные сахариды, но удаляет другие молекулярные компоненты, такие как нуклеиновые кислоты.
Таким образом, настоящее изобретение предусматривает параметры, которые стандартизируют бактериальные экстракты, чтобы помочь поддерживать соответствующую безопасность и эффективность.
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Блок-схема системы проточной фильтрации вдоль потока (TFF) для получения бактериальных экстрактов после лизирования бактерий. Блок-схема показывает две различные конфигурации для фильтров: параллельный режим, где все фильтры работают одновременно, и серпентинный режим, где фильтры конфигурируются в последовательном режиме.
Фиг.2: Активность экстрактов в исследовании мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) при исходной концентрации биомассы для лизирования 12,5 г/л (часть A) и 25 г/л (часть B). (См. пример 5A относительно дополнительных подробностей).
Фиг.3: Активность экстрактов в исследовании PBMC при исходной концентрации биомассы для лизирования 25 г/л (часть A) и 100 г/л (часть B).
Фиг.4: Активность экстрактов в исследовании мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) при времени лизирования 24 часа (часть A) и 72 часа (часть B).
Фиг.5: Влияние концентрации NaOH во время лизирования на активность макрофагов по отношению к закиси азота (NO).
Фиг.6: Средние общие значения для колониеобразующих единиц (CFU) в ткани мочевого пузыря (часть A) и почки (часть B) для различных экспериментальных групп.
Фиг.7: Регистрация гибели в экспериментальных группах в течение периода в 21 день после инфицирования 104 CFU Salmonella typhimurium.
Подробное описание изобретения
Определения
Экстракт: Экстракт, как здесь определено, обозначает материал, полученный после лизирования одного или более бактериальных штаммов. В некоторых случаях экстракт получают только из одного штамма, в то время как в других экстракт представляет собой смесь экстрактов из нескольких различных штаммов.
Щелочное лизирование: Это способ лизирования бактериальных клеток при основных условиях, таких как использование органических или неорганических оснований.
Лизат: Экстракт бактерий, полученный от процедуры лизирования клеток.
Фильтрация: Способ фильтрации, как здесь описано, обозначает прохождение экстракта или смеси экстрактов через один или более фильтров, таких как микрофильтры (то есть микрофильтрацию) или ультрафильтры (то есть ультрафильтрацию). Такая фильтрация может не удалять обязательно 100% компонентов, предназначенных для удаления. В некоторых случаях фильтрацию повторяют за несколько проходов или циклов.
Начальный pH: Этот термин обозначает pH, измеренный при начале процедуры, такой как бактериальное лизирование или фильтрация.
Сахариды: Сахарид, как здесь определено, включает моносахариды, дисахариды, а также сахариды больших размеров, такие как линейные и разветвленные полисахариды. Сахариды также включают замещенные или химически модифицированные сахариды, такие как липополисахариды (LPS) и их химически модифицированные варианты.
D-аминокислоты: Этот термин относится к аминокислотам, которые существуют в правовращательных изомерных формах, в противоположность биосинтетически полученным L-аминокислотам, которые существуют в левовращательных изомерных формах.
Рацемизация: Это термин показывает, по меньшей мере, частичную химическую модификацию L-аминокислот до D-аминокислот.
Среда, которая исключает риск появления заболеваний на прионной основе, обозначает культурную среду, используемую на любой стадии получения экстрактов, которая не содержит материалов, таких как сыворотка или мясные экстракты, взятые от животных, таких как коровы или овцы, или от любого другого животного, которое может передавать заболевания на прионной основе. Примеры таких сред включают среды на растительной основе или синтетические химически определенные среды, а также среды с использованием лошадиной сыворотки или среды, содержащие материалы, взятые от видов животных, которые не передают прионные заболевания. Примеры заболеваний на прионной основе включают, например, заболевание коровьим бешенством, почесуху и заболевание Крейцфельда-Якоба.
Неживотная среда представляет собой среду, которая не содержит компонентов, полученных от животных. Примеры включают среды на растительной основе (т.е. растительные среды), такие как соевая среда, и синтетические среды.
Лечение, как здесь используется, обозначает, например, как лечение текущих инфекций, так и других состояний, а также предотвращение или защиту, например, от развития новых инфекций.
Субъект, как здесь используется, обозначает любой животный субъект, включая субъектов млекопитающих, таких как люди и домашние млекопитающие.
Понятно, что конкретные бактериальные штаммы, идентифицируемые здесь и используемые в настоящем изобретении, могут включать штамм, полученный от исходного депозита, упоминаемого здесь, или от его генетического клона, включая штаммы, которые повторно депонированы в более позднее время с различными кодовыми наименованиями депонентов, но которые считаются генетически таким же штаммом, как и исходная депонированная версия.
Все числа, используемые здесь, являются приблизительными, принимая во внимание ошибки, неизбежные при их измерениях, округление и значимые цифры.
Получение экстрактов
Бактериальные экстракты по настоящему изобретению могут быть получены посредством ферментации с последующим тепловым дезактивированием, концентрирования и сбора биомассы, щелочного лизирования отдельной бактериальной биомассы или щелочного лизирования смесей бактериальной биомассы при определенных условиях. Щелочные лизаты при различных условиях могут смешиваться перед очисткой посредством фильтрации. Полученный фильтрат может дополнительно очищаться, например, с удалением материала в виде частиц, а может также лиофилизироваться и/или перерабатываться.
Для каждого штамма, для получения достаточного количества материала, ферментационные культуры могут начинаться с рабочей маточной серии с последующей инокуляцией в ферментационных контейнерах больших размеров.
Используемые среды могут быть одинаковыми для каждого вида. Однако вспомогательные факторы роста могут вводиться для усиления роста некоторых видов. В некоторых вариантах осуществления среду, которая исключает риск появления заболевания на прионной основе, используют для выращивания, по меньшей мере, некоторых, или для всех штаммов. Примеры включают неживотные среды, такие как среды на растительной основе и синтетические среды. Другие примеры включают среду, которая включает лошадиную сыворотку или другой животный экстракт, который отбирают от видов животных, которые не вызывают опасности появления прионного заболевания, в противоположность штаммам, выращенным в присутствии бычьей сыворотки или мясных экстрактов, которые могут давать такие риски.
В некоторых вариантах осуществления ферментация может начинаться с малых культур, таких как от 0,1 до 1,0 литра, инкубируемых в течение от приблизительно 3 до 6 часов при 30-40°C, например, при 37°C, для получения оптической плотности (OD) на 700 нм от 3,0 до 5,0. После стадии мелкомасштабной культуры дополнительное культивирование в одном или в нескольких ферментерах больших размеров может осуществляться при 30°C-40°C в течение времени от 3 часов до 20 часов, например, в течение 3-10 часов или 8 часов.
После ферментации биомасса от каждого штамма или от множества штаммов может дезактивироваться с помощью тепловой обработки, концентрирования и замораживания. После оттаивания замороженной биомассы бактериальная суспензия может затем разбавляться и подщелачиваться для лизирования бактериальных клеток концентрированным раствором ионов гидроксида, таких как NaOH. В некоторых вариантах осуществления лизируется от приблизительно 10 до приблизительно 120 г/л бактериальной сухой массы от одного штамма или их смеси, например, от приблизительно 15 до приблизительно 80 г/л, или от приблизительно 15 до приблизительно 35 г/л, например, 15, 20, 25, 30 или 35 г/л. В некоторых вариантах осуществления лизируется от приблизительно 40 до приблизительно 80 г/л, например, 40, 50, 60, 70 или 80 г/л. (Концентрацию бактериальной сухой массы определяют по количеству сухой биомассы на литр лизирования). (Концентрацию сухой массы измеряют посредством сушки 5 мл материала в малой фарфоровой чашке при 105°C до тех пор, пока она не достигнет постоянной массы, а затем регистрации массы в граммах на литр). В некоторых вариантах осуществления используется концентрация сильного основания от 0,01 н. до 1,2 н., например, от 0,10 н. до 1,1 н. или от 0,10 н. до 0,65 н., или от 0,10 н. до 0,4 н., или в диапазоне с крайними точками от 0,1, 0,2, 0,3 или 0,4 н., или от 0,6 н. до 1,1 н., или в диапазоне с крайними точками от 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 или 1,1 н., или используется такая концентрация основания, чтобы достигнуть начального pH 12 или выше или pH больше чем 12, pH больше чем 12 и меньше чем 13,5, например, больше чем 12,5, больше чем 12,6, больше чем 12,8 или от pH 12,6 до pH 13,4. pH во время лизирования при экстракции солюбилизированного соединения может понижаться. Таким образом, pH может устанавливаться во время процедуры. Температура лизирования может составлять от 30 до 60°C, например, от 35 до 40°C, например, 37°C. Время лизирования может изменяться от 20 часов до нескольких дней, например, составлять 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, или от 30 до 120 часов, или от 30 до 50 часов, например, 30, 35, 40, 45 или 50 часов, или от 60 до 120 часов, например, 60, 72, 84, 96, 108 или 120 часов. Затем экстракты могут доводиться обратно до более низких pH, совместно смешиваться по желанию и фильтроваться.
После лизирования солюбилизированная сухая масса может составлять от 20 до 180 мг/мл. (Солюбилизированную сухую массу определяют таким же способом, как бактериальную сухую массу, описанную выше, и она может альтернативно выражаться в единицах мг/г, предполагая, что плотность растворимого лизата составляет 1 г/мл). Оставшуюся концентрацию белка измеряют способом Lowry, она может составлять от 8 до 75 мг/мл, например, от 10 до 70 мг/мл, от 20 до 60 мг/мл, или находиться в диапазоне с крайними точками от 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70 мг/мл. Концентрация сахаридов, измеренная с помощью антронного способа для восстанавливающих сахаров в целом, после лизирования смеси штаммов может составлять от 0,8 до 4 мг/мл, например, от 1 до 3,5 мг/мл, от 1,2 до 3 мг/мл, или находиться в диапазоне с крайними точками от 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4 мг/мл.
Может осуществляться лизирование за один раз только одного штамма или смеси всех желаемых штаммов. Например, смешанный экстракт может быть получен посредством смешивания, например, двух или более бактериальных лизатов. Каждый такой лизат может содержать от 10 г/л сухой массы биомассы до 90 г/л, например, 15-85 г/л, или 20-80 г/л, или 25-75 г/л, или 30-70 г/л, или 35-65 г/л, или 40-60 г/л, или 15-35 г/л, или 40-80 г/л. Каждый такой лизат может содержать, например, от приблизительно 20% до 80% экстракта в целом по объему. Объемные пропорции смешивания двух лизатов могут составлять, например, 25%-75% или 75%-25%, 70%-30%, или 30%-70%, или 60%-40%, или 40%-60%, или 50-50%.
Затем лизаты могут очищаться с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Например, лизаты могут центрифугироваться при 9000×g, затем могут использоваться один или несколько заходов фильтрации на 0,2-микронном фильтре для очистки экстракта. В некоторых случаях могут использоваться последовательные заходы фильтрации на фильтрах с большими размерами пор с последующей фильтрацией на 0,2-микронном фильтре. Способы ультрафильтрации также могут использоваться, чтобы помочь экстрагировать растворимые материалы из экстракта, например, рециркулируя пермеат от ультрафильтрации для дополнительной микрофильтрации.
В некоторых вариантах осуществления способ проточной фильтрации вдоль потока (TFF) может использоваться для фильтрования экстрактов и для экстрагирования солюбилизированных молекул из клеточных остатков больших размеров. (См. фиг.1). (См., например, Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson, Editor. Interpharm. Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., p.126 to 135 - ISBN:0-935184-72-4). В начале такого способа TFF, разбавленный бактериальный лизат может храниться в первом резервуаре. Начинается работа петли микрофильтрации (MF), и продукт прокачивают и полученный ретентат от MF рециклируют, в то время как пермеат от MF переносят во второй резервуар.
После достижения соответствующего уровня концентрации начинается работа петли ультрафильтрации (UF). Пермеат от UF можно рециркулировать обратно в первый резервуар для непрерывной экстракции солюбилизированных соединений из лизата, в то время как ретентат от UF может храниться во втором резервуаре. В течение непрерывной экстракции объемы в резервуарах 1 и 2 могут устанавливаться с помощью регулирования скоростей потока пермеатов от микрофильтрации и ультрафильтрации.
Несколько таких циклов экстракции могут осуществляться с помощью либо TFF, либо других способов фильтрации. В вариантах осуществления, которые используют TFF, в конце последнего цикла, петля ультрафильтрации может отключаться и петля микрофильтрации может работать одна, и пермеат от MF переносится в резервуар 2.
Петля микрофильтрации может соединяться с фильтрами с размерами пор от 1,2 микрон до 0,1 микрон, такими как фильтры с размерами пор от 0,65 до 0,2 микрон или 0,45 микрон. Поперечный поток может находиться в пределах между 1000 л/ч·м2 (LHM) и 3000 LHM, например, между 1500 и 2500 LHM, или 2000 LHM при перепаде давления на мембране (TMP) от 0,6 до 2 бар, например, в пределах между 0,8 и 1,5 бар, или 1,0 бар. Петля ультрафильтрации может соединяться с фильтрами с размерами пор от 10 КДа до 1000 КДа, например, от 10 КДа до 100 КДа или от 10 КДа до 30 КДа, или от 30 КДа до 100 КДа. Поперечный поток может находиться в пределах между 30 LHM и 1000 LHM, например, между 20 и 500 LHM с TMP от 0,2 до 1,5 бар, например, в пределах между 0,4 и 1,2 бар, или 0,5 бар.
5-20 объемов диафильтрации можно использовать для экстрагирования солюбилизированных соединений из бактериальных клеточных оболочек. В некоторых вариантах осуществления используют 8-15 объемов. Следовательно, например, в некоторых вариантах осуществления может использоваться 5-15 циклов фильтрации, в некоторых случаях 8-15 циклов, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 циклов.
После фильтрации экстракты могут дополнительно концентрироваться или центрифугироваться, если это желательно. Например, может осуществляться дополнительная микрофильтрация с использованием фильтра с более мелкими порами, такого как 0,2-микронный фильтр. После фильтрации выход солюбилизированных белков, измеренный согласно Lowry, может составлять 50-90% или более чем 60%. После фильтрации экстракт может лиофилизироваться перед приготовлением его для использования.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выбор условий лизирования может осуществляться так, чтобы получить "сильное" или "умеренное" лизирование. Например, в некоторых вариантах осуществления сильное лизирование может достигаться с помощью лизирования от приблизительно 15 до приблизительно 35 г/л бактериальной сухой массы, например, 15, 20, 25, 30 и 35 г/л, или меньших диапазонов, ограниченных этими концентрациями (например, 15-20, 20-25, 20-30, и т.п.), с помощью 0,6-1,1 н. растворов ионов гидроксида, например, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 или 1,1 н., или меньших диапазонов, ограниченных 60-120 часами, например, 60, 70, 80, 90, 100, 110 и 120 часов, при 30-40°C, например, при 35-40°C, 30-35°C или 37°C. Таким образом, как здесь используется, "сильное" лизирование включает использование концентрации бактериальной сухой массы, концентрации ионов гидроксида, времени и температуры, попадающих в каждый из самых широких диапазонов, приведенных выше. В других вариантах осуществления умеренное лизирование может достигаться с помощью лизирования от приблизительно 40 до приблизительно 80 г/л бактериальной сухой массы (например, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80) с помощью 0,1-0,4 н. растворов ионов гидроксида (то есть 0,1, 0,2, 0,3 или 0,4) в течение 30-50 часов (например, 30, 35, 40, 45 или 50 часов) при 30-40°C, например, 35-40°C, 30-35°C или 37°C. Следовательно, как здесь используется, "умеренное" лизирование включает использование концентрации бактериальной сухой массы, концентрации ионов гидроксида, времени и температуры, попадающих в каждый из самых широких диапазонов, приведенных выше. В некоторых вариантах осуществления могут быть получены смеси двух бактериальных лизатов, таких как сильный и умеренный лизат, как описано выше, такие как 10%-90% смесь, смесь 20/80, 25/75, 35/65, 50/50 по объему. (См., например, примеры 8 и 9 ниже.) В некоторых вариантах осуществления все штаммы, которые должны использоваться в экстрактах, могут подвергаться как сильному, так и умеренному лизированию, с последующим совместным смешиванием полученных лизатов. Или альтернативно, некоторые штаммы могут подвергаться сильному лизированию, в то время как другие подвергаются умеренному лизированию. Фильтрация этих лизатов может осуществляться до или после смешивания, например, с помощью способа TFF через петлю MF с 0,65-0,2-микронным фильтром, например, 0,6-, 0,55-, 0,5-, 0,45-, 0,4-, 0,35-, 0,3- или 0,25-микронным фильтром, и петлю UF с 10- или 30-КДа фильтром, в течение, в целом, от 8 до 15 циклов, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 циклов. После приготовления экстракты по настоящему изобретению могут очищаться для удаления материала в виде частиц.
Химические свойства бактериальных экстрактов
Некоторые варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением могут содержать, например, 5-75 мг/мл белков или 10-65 мг/мл, или 20-45 мг/мл, или 5-40 мг/мл, или 5-20 мг/мл, белков или находиться в диапазоне с крайними точками от 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75 мг/мл; 1,5-2,5 мг/мл свободных аминокислот (A.A.) или 1,5-2 мг/мл, или 2-2,5 мг/мл свободных A.A., или находиться в диапазоне с крайними точками от 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 или 2,5 мг/мл свободных A.A., вычисленных по отношению к глутаминовой кислоте (147,1 г/моль); и 0,3-4,5 мг/мл полисахаридов и моносахаридов или 0,3-4 мг/мл, или 0,4-4 мг/мл, или 0,5-3,5 мг/мл, или 0,6-3 мг/мл или 0,3-1 мг/мл, или находиться в диапазоне с крайними точками от 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 или 4,5 мг/мл полисахаридов и моносахаридов. Например, некоторые варианты осуществления содержат приблизительно 5-9 мг/мл белков, 2 мг/мл свободных аминокислот (A.A.), вычисленных по отношению к глутаминовой кислоте (147,1 г/моль), и/или приблизительно 0,3-0,6 мг/мл полисахаридов и моносахаридов.
В некоторых вариантах осуществления концентрация эквивалентов LPS на основе хромогенного исследования с использованием лизата амебоцитов Limulus (LAL) меньше чем 5000 нг/мл, или меньше чем 2000 нг/мл, или меньше чем 1000 нг/мл, или меньше чем 750 нг/мл, или меньше чем 500 нг/мл, или меньше чем 200 нг/мл, или меньше чем 100 нг/мл.
Лизирование бактерий в соответствии с настоящим изобретением может приводить к частичному гидролизу амфифильных соединений, таких как липополисахариды и липопептиды. Лизирование бактерий в соответствии с настоящим изобретением может также приводить к частичному гидролизу белков, а также к деаминированию, деамидированию и к частичной рацемизации аминокислот из L в D. В одном из аналитических исследований экстракта в соответствии с настоящим изобретением после полного гидролиза экстракта с помощью HCl и дериватизации аминокислот, наблюдают газохроматографические пики, представляющие, каждый, D-аспарагиновую кислоту и D-аспарагин, D-глутаминовую кислоту и D-глутамин, D-серин, D-метионин, D-гистидин, D-аланин, D-аргинин, D-фенилаланин, D-тирозин, D-лейцин, D-лизин, D-валин, D-треонин. Процент D-аминокислот этих видов в этом исследовании находится в пределах от 3% до 80%. Следовательно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения делают возможной рацемизацию одного или нескольких соединений из серина, метионина, аспарагиновой кислоты и аспарагина, треонина, гистидина, аланина, аргинина, тирозина, фенилаланина, лейцина и лизина, таких как все упоминаемые выше аминокислоты, или любой выбранной из более чем одной, но менее чем все упоминаемые выше аминокислоты, такие, как, например, серин, аспарагиновая кислота, аспарагин, аланин, фенилаланин, тирозин и лизин, или выбора из этих аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 10% одной или более из упомянутых выше аминокислот может рацемизироваться из L в D. В других вариантах осуществления может рацемизироваться, по меньшей мере, 30% одной или более из упомянутых выше аминокислот.
Биологические активности бактериальных экстрактов
Экстракты в соответствии с настоящим изобретением могут быть эффективными для лечения пациентов, страдающих от расстройств мочевого или пищеварительного тракта, таких как инфекции пищеварительного и мочевого тракта, или имеющих риск их развития. Экстракты в соответствии с настоящим изобретением могут быть эффективными при предотвращении возвратной инфекции мочевого тракта. Примеры расстройств, которые могут лечиться с помощью экстрактов по настоящему изобретению, включают E.coli и другие бактериальные инфекции, уретрит, тубулоинтерстициальный нефрит, обструктивный пиелонефрит, инфекции мочевого тракта, вызванные обструктивной и рефлюкс-уропатией, цистит, включая хронический цистит, простатит, включая хронический простатит, простатоцистит, воспалительные заболевания тазовых органов у женщин, болезнь Крона и синдром раздраженной толстой кишки.
Биологическая активность экстрактов может определяться с помощью нескольких анализов. Например, анализ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) исследует продуцирование цитокинов IL-6 из PBMC и может осуществлять скрининг способности экстракта к стимулированию иммунной системы. Например, в некоторых вариантах осуществления концентрация IL-6 in vitro, измеренная в супернатантах PBMC, стимулируемых экстрактами по настоящему изобретению, находится в пределах от 2000 пг/мл до 70000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 50000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 30000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 20000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 10000 пг/мл, или от 5000 пг/мл до 70000 пг/мл, от 5000 пг/мл до 50000 пг/мл, от 5000 пг/мл до 30000 пг/мл, от 5000 пг/мл до 25000 пг/мл, или от 5000 пг/мл до 10000 пг/мл, или от 15000 пг/мл до 25000 пг/мл. Когда LPS используют как контрольный агонист (при 0,01 мкг/мл), полученные значения находятся в пределах, в зависимости от доноров, от 5000 пг/мл до 70000 пг/мл.
Исследования оксида азота (NO) у грызунов измеряют продуцирование NO макрофагами грызунов, что также указывает на иммунное стимулирование. Например, макрофаги продуцируют NO, чтобы убивать вторгающиеся бактерии. В некоторых вариантах осуществления активность закиси азота (NO) in vitro для вариантов осуществления настоящего изобретения, исследуемая при концентрациях, находящихся в пределах от 0,001 мг/мл до 10 мг/мл растворимой сухой массы, обеспечивает максимальную реакцию в пределах от 3 мкМ до 100 мкМ оксида азота или от 3 мкМ до 90 мкМ, от 3 мкМ до 80 мкМ, от 3 мкМ до 70 мкМ, от 3 мкМ до 60 мкМ, от 3 мкМ до 50 мкМ, от 3 мкМ до 40 мкМ, от 3 мкМ до 30 мкМ, от 3 мкМ до 20 мкМ, от 3 мкМ до 10 мкМ, или от 5 мкМ до 80 мкМ, от 5 мкМ до 60 мкМ, от 5 мкМ до 40 мкМ, от 5 мкМ до 20 мкМ, или от 10 мкМ до 80 мкМ, от 10 мкМ до 70 мкМ, от 10 мкМ до 50 мкМ, от 10 до 30 мкМ, или от 10 мкМ до 15 мкМ, или она находится в диапазоне с крайними точками от 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мкМ.
Активности, наблюдаемые на мононуклеарных клетках периферической крови человека и макрофагах грызунов in vitro, могут зависеть от таких переменных, как количество бактериальной сухой массы, которая должна лизироваться, то есть от "исходного материала" для лизирования, от продолжительности щелочного лизирования и начального процента NaOH или начального pH, используемого при лизировании.
Сочетание активности при исследованиях in vitro, таких как исследования с помощью PBMC и NO, с определением концентрации LPS, например, с помощью LAL, также может обеспечить получение информации относительно баланса активности как функции риска появления токсичности для данного бактериального экстракта.
Активности, наблюдаемые in vivo на животных в моделях инфекции, показывают, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения имеют защитные воздействия. См., например, пример 9, показывающий повторное лечение животных иллюстративными экстрактами в соответствии с настоящим изобретением. На модели in vivo инфекции E.coli мочевого тракта (пример 8), животные, получающие профилактические повторные пероральные введения иллюстративных экстрактов в соответствии с настоящим изобретением, показывают более низкое количество бактерий в мочевом тракте (мочевой пузырь и почки).
Например, частота выживания за 13 дней после провоцирования, по меньшей мере, 8 невосприимчивых к LPS мышей уропатогенным штаммом E.coli 1677 составляет, по меньшей мере, 60%, когда этих мышей впервые лечат в течение 10 дней эффективным количеством соединений согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения. Доза уропатогенной E.coli для провоцирования может выбираться таким образом, что нелеченые мыши или мыши, которых лечат водой или пустым контрольным препаратом, содержащим наполнители, но не экстракт, имеют частоту выживания 60% или меньше, например, 50% или меньше. В некоторых случаях частота выживания мышей, которых лечат соединениями согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, в такой модели составляет, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95%.
В качестве другого примера, частота выживания за 13 дней после провоцирования, по меньшей мере, 8 мышей, имеющих восприимчивость к LPS дикого типа, Salmonella thyphimurium, составляет, по меньшей мере, 60%, когда этих мышей впервые лечат в течение 10 дней эффективным количеством соединения согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения. Доза Salmonella thyphimurium для провоцирования может выбираться так, что нелеченые мыши или мыши, которых лечат водой или пустым контрольным препаратом, содержащим наполнители, но не экстракт, имеют частоту выживания 60% или меньше, например, 50% или меньше. В некоторых случаях частота выживания для мышей, которых лечат экстрактом, составляет, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95%.
Композиции, содержащие бактериальные экстракты
Экстракт в соответствии с настоящим изобретением может приготавливаться с помощью ряда различных путей для возможного введения. Например, могут быть получены пероральные таблетки, капсулы и пилюли, а также жидкие препараты или аэрозоли. Препараты для вливания или инъекция может также могут быть получены.
Варианты осуществления настоящего изобретения могут приготавливаться, например, как твердые дозированные формы или жидкие дозированные формы. Примеры твердых дозированных форм могут включать, например, таблетки, например, таблетки с покрытием, жевательные таблетки, шипучие таблетки, сублингвальные таблетки, гранулы, порошки или капсулы), содержащие экстракт и, необязательно, одну или более пищевых и/или диетических добавок. Твердые дозированные формы могут также содержать разбавители, наполнители и/или другие эксципиенты. Могут добавляться другие компоненты наполнителей, такие как консерванты, красители, ароматизирующие вещества и подсластители. Является также возможным приготовление порошков или препаратов в форме гранул. Жидкие дозированные формы, такие как растворы, сиропы, суспензии или капли, также могут использоваться для перорального способа введения.
Рабочие примеры
Пример 1. Получение культуры штаммов E.coli
Среду для E.coli I-081 (E81), E.coli I-082 (E82), E.coli I-083 (E83), E.coli I-084 (E84), E.coli I-085 (E85), E.coli I-086 (E86), E.coli I-087 (E87), E.coli I-088 (E88), E.coli I-089 (E89), E.coli NCTC 8603 (E8603), E.coli NCTC 8621 (E8621), E.coli NCTC 8622 (E8622), E.coli NCTC 8623 (E8623), E.coli NCTC 9026 (E9026), E.coli NCTC 9111 (E9111), E.coli NCTC 9119 (E9119), E.coli NCTC 9707 (E9707) и E.coli NCTC 9708 (E9708) получают посредством растворения следующих компонентов в очищенной воде: хлорид натрия, 3,75 г/л; моногидрофосфат натрия, 2,5 г/л; ацетат натрия, 0,625 г/л; растительный пептон (папаиновый гидролизат сои), 50 г/л; инозин, 0,125 г/л; хлорид кальция, 0,025 г/л; хлорид калия, 0,125 г/л; гидрокарбонат натрия, 0,75 г/л; аргинин, 1 г/л; пируват натрия, 0,35 г/л; глюкоза, 3 г/л; и "раствор концентрированных элементов" 0,625 мл/л (который содержит сульфат меди, 3 мг/л; хлорид железа, 830 мг/л; сульфат цинка, 860 мг/л; и серную кислоту, 1,1 мл/л.).
0,1 л среды инокулируют 1,5 мл замороженных бактерий и инкубируют в 300-мл колбе Эрленмейера при 37°C в течение 4 часов при перемешивании. Затем 1,0 л среды в 3000-мл колбе Эрленмейера инокулируют 30 мл из предыдущей 300-мл культуры и инкубируют опять при 37°C в течение 4 часов при перемешивании.
Оптическая плотность для последовательных стадий культивирования
1
2
Такие же среды, как выше, приготавливают для ферментера для предварительной ферментации, но с добавлением 0,08 мл/л полипропиленгликоля. Один литр культуры от предыдущей стадии инкубирования переносят в ферментер для предварительной ферментации. Температуру инкубирования поддерживают при 30°C, и ферментер для предварительной ферментации перемешивают. pH не поддерживают. Скорость потока стерильного воздуха доводят до 3,3 л/мин. Через 6 часов два ферментера для предварительной ферментации по 25 литров переносят в ферментер больших размеров.
Оптическая плотность для культур из ферментера для предварительной ферментации
2
Такие же среды, как описано выше, приготавливают для последующего инкубирования в крупномасштабных ферментерах, но с добавлением 0,05 мл/л полипропиленгликоля и 6 г/л глюкозы перед стерилизацией. Температуру инкубирования поддерживают при 37°C, при перемешивании и при аэрации в течение инкубирования. pH поддерживают при 6,8. 12 кг глюкозы добавляют в течение культивирования. Приблизительно через 10,5 часов культуры дезактивируют посредством нагрева до температуры 90-100°C и переносят в резервуар для сбора. Затем биологическую массу отделяют от культурных сред и концентрируют посредством центрифугирования.
В соответствии с описанными средами и условиями культивирования культуры приготавливают, как показано в таблицах и описаниях ниже.
мер
при
мера
мер
при
мера
био-
массы [мг/мл]
Пример 1.20
NCTC9111 культивируют с помощью синтетической среды при таких же условиях, как описано в примере 1.2. Среду приготавливают посредством растворения 540 л очищенной воды, 0,2220 кг инозина, 0,3330 кг моногидрата лимонной кислоты, 1,4430 кг глутаминовой кислоты, 1,1655 кг хлорида аммония, 0,7825 кг сульфата магния·2Н2О, 1,5096 кг фосфата калия (КН2РО4), 0,3330 кг аргинина, 0,1110 кг урацила, 0,0189 кг хлорида кальция, 11,8200 кг хлорида натрия, 0,5435 кг L-лейцина, 0,5435 кг L-лизина HCl, 0,5435 кг L-серина, 0,5435 кг L-метионина, 0,5435 кг L-валина, 0,5435 кг L-аланина, 0,5435 кг L-аспарагина, 14,0000 л гидроксида аммония, 0,3420 л гидроксида калия, 40,5000 кг глюкозы, 4,1667 г хлорида железа, 4,1667 г хлорида кобальта, 4,1667 г молибдата натрия, 4,1667 г сульфата марганца, 4,1667 г сульфата цинк, 4,1667 г сульфата никеля, 0,0833 г борной кислоты, 0,1667 г сульфата меди, 1,8333 мл серной кислоты (95-97%).
Пример 2: Щелочное лизирование клеток
Пример 2.1
Одну аликвоту каждого из следующих штаммов E81, E82, E83, E084, E085, E086, E087, E088, E89, E9111, E 8603, E 8621, E 8622, E8623, E 026, E9119, E9707 и E9708, содержащую 1810 г бактериальной сухой массы, оттаивают при комнатной температуре, затем разбавляют очищенной водой до получения 26 г/л бактериальной биомассы (сухая масса). Осуществляют подщелачивание при 0,8 M гидроксида натрия. pH измеряют через 2 часа лизирования, и составляет 13,1. Затем лизирование осуществляют в течение 120 часов при 35-40°C при непрерывном перемешивании. После инкубирования pH доводят до 11,3 с помощью концентрированной HCl. (Растворимая сухая масса) SDW: 59,4 мг/мл; белок: 17,4 мг/мл. Растворимую сухую массу определяют посредством получения 5 мл растворимой фракции, полученной от лизирования, и ее сушки до получения постоянной массы в фарфоровой чашке при 105°C.
Пример 2.2
В соответствии с примерами 1.1-1.19 3 аликвоты E81, E82, E084, E086, E087, E89, 2 аликвоты E83 и E085, 4 аликвоты E088, 6 аликвот E9111, 9 аликвот E 8603, E9119, 7 аликвот E8621, E9707 и 8 аликвот E 8622, E8623, E9026 и E9708, содержащих в целом 9264 г бактериальной сухой массы, оттаивают при комнатной температуре, затем разбавляют очищенной водой до получения концентрации бактериальной биомассы 50,1 г/л (сухая масса). Подщелачивание при 0,2 н. ионов гидроксида составляет 12,3. Лизирование осуществляют в течение 32 часов при 35-40°C при непрерывном перемешивании. Во время лизирования pH отслеживают таким образом, что он не уменьшается более чем на 1,3 единицы pH. pH доводят до 11,3 с помощью концентрированной HCl. (Растворимая сухая масса) SDW: 60,7 мг/мл; белок: 32,0 мг/мл.
Пример 2.3
В соответствии с таблицей 2, биомассу разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 58 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 1 дня при 35-40°C при непрерывном перемешивании. (Растворимая сухая масса) SDW: 96,8 мг/мл; белок: 35,3 мг/мл.
Пример 2.4
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до 92 г/л концентрации бактериальной биомассы. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M с NaOH при 10н. Лизирование осуществляют в течение 1 дня при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 146,6 мг/мл; белок: 62,9 мг/мл.
Пример 2.5
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 58 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4 M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 7 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 97,7 мг/мл; белок: 42,4 мг/мл.
Пример 2.6
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 92 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 7 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 153,0 мг/мл; белок: 78,9 мг/мл.
Пример 2.7
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 58 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 98,6 мг/мл; белок: 29,6 мг/мл.
Пример 2.8
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 92 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 127,4 мг/мл; белок: 60 мг/мл.
Пример 2.9
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 43 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,2M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 168 часов при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 43,2 мг/мл; белок: 8,2 мг/мл.
Пример 2.10
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 57 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 69,5 мг/мл; белок: 20,2 мг/мл.
Пример 2.11
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 30 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 1M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 86,9 мг/мл; белок: 13 мг/мл.
Пример 2.12
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 27 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 1M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 91,3 мг/мл; белок: 11,8 мг/мл.
Пример 2.13
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 14 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,1M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 1 дня при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 25,2 мг/мл; белок: 5,8 мг/мл.
Пример 2.14
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 14 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,2M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 26,6 мг/мл; белок: 5,7 мг/мл.
Пример 2.15
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 14 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,1M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 10 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 20,0 мг/мл; белок: 2,1 мг/мл.
Пример 2.16
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 114 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 1M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 1 дня при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 163,3 мг/мл; белок: 68,4 мг/мл.
Пример 2.17
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 114 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,4M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 163,0 мг/мл; белок: 60,3 мг/мл.
Пример 2.18
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 114 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 1M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 10 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 171,2 мг/мл; белок: 71,0 мг/мл.
Пример 2.19
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 25 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,45M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 4 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 48,5 мг/мл; белок: 15,2 мг/мл; A.A: 4,0 мг/мл; сахар: 0,86 мг/мл.
Пример 2.20
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 28 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,6M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 4 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 59,4 мг/мл; белок: 16,8 мг/мл; A.A: 5,4 мг/мл; сахар: 1,22 мг/мл.
Пример 2.21
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 58 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,2M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 4 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 64,4 мг/мл; белок: 32,4 мг/мл; A.A: 5,6 мг/мл; сахар: 1,84 мг/мл.
Пример 2.22
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 56 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,2M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 3 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 61,0 мг/мл; белок: 30,0 мг/мл; A.A: 5,6 мг/мл; сахар: 1,88 мг/мл.
Пример 2.23
В соответствии с таблицей 2, биомассы разбавляют до концентрации бактериальной биомассы 39 г/л. Подщелачивание осуществляют с помощью 0,7M NaOH. Лизирование осуществляют в течение 4 дней при 35-40°C при непрерывном перемешивании. SDW: 78,32 мг/мл; белок: 20,60 мг/мл; A.A: 7,8 мг/мл; сахар: 1,54 мг/мл.
Пример 2.24
Одну аликвоту каждого из следующих штаммов E82, E83, E084, E086, E087, E088, E9111, E 8603, E 8621, E 8622, E8623, E 026, E9119, E9707 и E9708, содержащих 1810 г бактериальной сухой массы, оттаивают при комнатной температуре, затем разбавляют очищенной водой до получения 25 г/л бактериальной биомассы (сухая масса). Подщелачивание осуществляют с помощью 1,0M гидроксида натрия. pH измеряют через 2 часа лизирования, и он составляет 13,5. Затем лизирование осуществляют в течение 72 часов при 35-40°C при непрерывном перемешивании. После инкубирования pH доводят до 11,4 с помощью концентрированной HCl.
(Растворимая сухая масса) SDW: 75,4 мг/мл; белок: 14,8 мг/мл; A.A: 5,4 мг/мл; сахар: 0,9 мг/мл.
Пример 3: Смеси лизатов
Несколько бактериальных экстрактов смешивают и устанавливают рН с результатами, приведенными ниже:
Пример 3.1
0,845 кг E.coli из примера 2.4 смешивают с 1,4 кг E.coli примера 2,3. Смесь разбавляют очищенной водой до 12 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: растворимая сухая масса (SDW): 29,7 мг/мл; белок: 10,0 мг/мл.
Пример 3.2
1,4 кг E.coli из примера 2.7 смешивают с 0,85 кг E.coli из примера 2,8. Смесь разбавляют очищенной водой до 12 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: растворимая сухая масса (SDW): 32,3 мг/мл; белок: 10,3 мг/мл. SDW измеряют, как описано в примере 2. Концентрацию белка измеряют с помощью анализа согласно Lowry (см. European Pharmacopoeia 2.5.33, "total protein - method 2").
Пример 3.3
1,4 кг E.coli из примера 2.5 смешивают с 0,86 кг E.coli из примера 2,6. Смесь разбавляют очищенной водой до 12 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 26,8 мг/мл; белок: 9,6 мг/мл.
Пример 3.4
2,4 кг E.coli из примера 2.7 смешивают с 1,5 кг E.coli из примера 2.8. Смесь разбавляют очищенной водой до 20 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 22,0 мг/мл; белок: 9,5 мг/мл.
Пример 3.5
9,0 кг E.coli из примера 2.9 разбавляют очищенной водой до 9,3 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 45,7 мг/мл; белок: 20,6 мг/мл.
Пример 3.6
8.1 кг E.coli из примера 2.10 разбавляют очищенной водой до 12 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 39,7 мг/мл; белок: 17,3 мг/мл.
Пример 3.7
3,2 кг E.coli из примера 2.11 смешивают с 3,2 кг E.coli из примера 2.12. Смесь разбавляют очищенной водой вплоть до 12,8 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 39,9 мг/мл; белок: 8,0 мг/мл.
Пример 3.8
248 кг E.coli из примера 2.19 разбавляют очищенной водой до 400 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 31,6 мг/мл; белок: 10,2 мг/мл; свободные аминокислоты (A.A.): 2,6 мг/мл; сахар: 0,59 мг/мл. Концентрацию сахара анализируют после кислотного гидролиза и дериватизации в соответствии с D. Herbert et al., Meth. Microbiol. 5B: 266 et seq. (1971). Концентрацию свободной аминокислоты измеряют посредством преобразования аминокислоты в изоиндольные производные и измерения коэффициента поглощения на 340 нм, в соответствии с Roth M., Fluorescence reaction for amino acids, Anal.Chem., 43, 880-882, (1971). Результаты выражают в эквивалентах глутаминовой кислоты.
Пример 3.9
248 кг E.coli из примера 2.20 разбавляют очищенной водой до 400 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 38,9 мг/мл; белок: 10,8 мг/мл; A.A.: 3,6 мг/мл; сахар: 0,74 мг/мл.
Пример 3.10
247 кг E.coli из примера 2.21 разбавляют очищенной водой до 400 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 40,08 мг/мл; белок: 20,0 мг/мл; A.A.: 3,6 мг/мл; сахар: 1,17 мг/мл.
Пример 3.11
247 кг E.coli из примера 2.22 разбавляют очищенной водой до 400 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 43,9 мг/мл; белок: 19,1 мг/мл; аминокислоты (A.A.): 3,9 мг/мл; сахара: 1,27 мг/мл.
Пример 3.12
1,9 кг E.coli из примера 2.21 смешивают с 6 кг E.coli из примера 2.23. Смесь разбавляют очищенной водой до 12 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 45,4 мг/мл; белок: 12,6 мг/мл; A.A.: 3,8 мг/мл; сахар: 0,82 мг/мл.
Пример 3.13
4 кг E.coli из примера 2.21 смешивают с 4 кг E.coli из примера 2.23. Смесь разбавляют очищенной водой до 12 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 47,0 мг/мл; белок: 15,0 мг/мл; A.A.: 3,9 мг/мл; сахар: 1,14 мг/мл.
Пример 3.14
72,4 кг E.coli из примера 2.1 смешивают с 185,2 кг E.coli из примера 2.2. Смесь разбавляют очищенной водой до 400 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 40,8 мг/мл; белок: 17,7 мг/мл; A.A.: 3,7 мг/мл; сахар: 1,24 мг/мл.
Пример 3.15
75,4 кг E.coli из примера 2.24 смешивают с 185,2 кг E.coli из примера 2.2. Смесь разбавляют очищенной водой до 400 кг. Разбавленную смесь бактериальных лизатов переносят в резервуар для микрофильтрации. Аналитические результаты представляют собой: SDW: 43,6 мг/мл; белок: 17,0 мг/мл; A.A.: 3,3 мг/мл; сахар: 1,16 мг/мл.
Пример 4: Очистка лизатов
Пример 4.1
Смесь бактериальных лизатов из примера 3.1 переносят в резервуар для микрофильтрации (MF). Узел микрофильтрации (MF) использует 0,45-микронный фильтр для проточной фильтрации вдоль потока (TFF) (PALL Procette) в серпентинном режиме или фильтр Schleicher & Schuell в параллельном режиме. (См. фиг.1 относительно примера блок-схемы установки TFF). Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2000 л/ч·м2 (LHM), а перепад давления на мембране (TMP) при 1,3 бар. Пермеат переносят в резервуар для ультрафильтрации (UF).
После того как объем лизата в резервуаре для микрофильтрации достигает половины от начального объема, запускают узел UF. Поперечный поток доводят до 1500 LHM и TMP до 0,3 бар. Объемы в резервуарах, как для MF (начальный объем для MF называют ViMF), так и для UF, поддерживают при одинаковом уровне. При каждом объеме диафильтрации (соответствующем ViMF), после экстракции белка следует измерение белков с помощью анализа микробляшек по Рэдфорду. С помощью этого измерения определяют количество циклов экстракции для экстрагирования всех солюбилизированных соединений.
После 10 объемов диафильтрации UF останавливают и бактериальный лизат концентрируют в резервуарах для MF. Извлекаемый объем составляет 9,55 кг. Затем этот продукт разбавляют до 7,0 мг/мл, а затем фильтруют через 0,2-микронный стерильный фильтр. Растворимая сухая масса (SDW): 24,2 мг/мл; белок: 6,4 мг/мл. A.A: 1,3 мг/мл, сахар: 0,5 мг/мл. Процент D-аминокислот: 29% D-Ala, 4% D-Thr, 11% D-Leu, 45% D-Ser, 36% D-Asx, 29% D-Met, 26% D-Phe, 21% D-Glx, 25% D-Tyr, 9% D-Lys.
Продуцирование NOx (оксида азота от макрофагов) измеряют после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления со следующими результатами: C1: 6,3 мкМ, C2: 7,4 мкМ и C3: 13,1 мкМ.
Несколько дополнительных смесей фильтруют с помощью проточной фильтрации вдоль потока (TFF), как описано ниже.
Пример 4.2
Лизат из примера 3.2 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2500 LHM и TMP при 1,30 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 38,2 LHM. Выход экстракции по сухой массе составляет 65%, выход экстракции по белку составляет 80% и выход по объему составляет 80%. Полученный концентрат содержит SDW: 26,1 мг/мл; белок: 8,1 мг/мл; A.A.: 1,4 мг/мл; сахар: 0,6 мг/мл; ДНК: 4,8 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 29% D-Ala, 4% D-Thr, 11% D-Leu, 45% D-Ser, 36% D-Asx, 29% D-Met, 26% D-Phe, 21% D-Glx, 25% D-Tyr, 9% D-Lys. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 5,5 мкМ, C2: 7,5 мкМ, C3: 5,5 мкМ.
Пример 4.3
Лизат из примера 3.3 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2450 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,3 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 26,2 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 65%, выход экстракции по белку составляет 75% и выход по объему составляет 88%. Полученный концентрат содержит SDW: 24,5 мг/мл; белок: 7,0 мг/мл; A.A.: 2,1 мг/мл; сахар: 0,5 мг/мл; ДНК: 8,2 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 45% D-Ala, 11% D-Leu, 48% D-Ser, 44% D-Asx, 41% D-Met, 26% D-Phe, 25% D-Glx, 38% D-Tyr, 27% D-Lys. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 5,1 мкМ, C2: 6,8 мкМ, C3: 13,7 мкМ.
Пример 4.4
Лизат из примера 3.4 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2000 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,8 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 22,5 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 67%, выход экстракции по белку составляет 84% и выход по объему составляет 92%. Полученный концентрат содержит SDW: 21,5 мг/мл; белок: 6,1 мг/мл; A.A.: 1,5 мг/мл; сахар: 0,3 мг/мл; ДНК: 5,6 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 44% D-Ala, 15% D-Thr, 12% D-Leu, 48% D-Ser, 40% D-Asx, 40% D-Met, 30% D-Phe, 26% D-Glx, 31% D-Tyr, 18% D-Lys.
Пример 4.5
Лизат из примера 3.5 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2000 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,3 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 27,7 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 72%, выход экстракции по белку составляет 69% и выход по объему составляет 86%. Полученный концентрат содержит SDW: 36,9 мг/мл; белок: 16,9 мг/мл; A.A.: 2,8 мг/мл; сахар: 0,815 мг/мл; ДНК: 46,7 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 27% D-Ala, 16% D-Thr, 11% D-Leu, 48% D-Ser, 40% D-Asx, 39% D-Met, 36% D-Phe, 32% D-Glx, 31% D-Tyr. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 6,2 мкМ, C2: 10,9 мкМ, C3: 18,3 мкМ.
Пример 4.6
Лизат из примера 3.6 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2000 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,3 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 15,7 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 53%, выход экстракции по белку составляет 51% и выход по объему составляет 81%. Полученный концентрат содержит SDW: 30,1 мг/мл; белок: 12,7 мг/мл; A.A.: 2,6 мг/мл; сахар: 0,364 мг/мл. Процент D-аминокислот: 40% D-Ala, 16% D-Thr, 12% D-Leu, 49% D-Ser, 43% D-Asx, 44% D-Met, 40% D-Phe, 38% D-Glx, 36% D-Tyr, 24% D-Lys. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 5,8 мкМ, C2: 7,1 мкМ, C3: 15,1 мкМ.
Пример 4.7
Лизат из примера 3.7 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2000 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,35 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 30,0 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 82%, выход экстракции по белку составляет 83% и выход по объему составляет 92%. Полученный концентрат содержит SDW: 38,2 мг/мл; белок: 5,4 мг/мл. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 0,4 мкМ, C2: 2,1 мкМ, C3: 16,3 мкМ.
Пример 4.8
500 мл лизата из примера 2.13 центрифугируют в течение 30 минут при 9000 g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Выход по объему составляет 45%. Полученный концентрат содержит SDW: 25,21 мг/мл; белок: 5,85 мг/мл; ДНК: 7,5 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 24% D-Ala, 16% D-Thr, 9% D-Leu, 43% D-Ser, 20% D-Asx, 16% D-Met, 10% D-Phe, 8% D-Glx, 7% D-Tyr.
Пример 4.9
500 мл лизата из примера 2.14 центрифугируют в течение 30 минут при 9000 g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Выход по объему составляет 53%. Полученный концентрат содержит SDW: 26,62 мг/мл; белок: 5,75 мг/мл; ДНК: 6,5 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 35% D-Ala, 22% D-Thr, 10% D-Leu, 45% D-Ser, 35% D-Asx, 35% D-Met, 31% D-Phe, 24% D-Glx, 22% D-Tyr, 12% D-Lys. PBMC при 1 мг активной сухой массы/мл: IL-6:9232 пг/мл.
Пример 4.10
500 мл лизата из примера 2.15 центрифугируют в течение 30 минут при 9000×g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Выход по объему составляет 53%. Полученный концентрат содержит SDW: 20 мг/мл; белок: 2,13 мг/мл; ДНК: 3,5 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 35% D-Ala, 4% D-Thr, 11% D-Leu, 46% D-Ser, 34% D-Asx, 32% D-Met, 24% D-Phe, 24% D-Glx, 15% D-Tyr. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,01 мг/мл (C1), 0,1 мг/мл (C2) и 1,0 мг/мл (C3); C1: 3,6 мкМ, C2: 4,4 мкМ, C3: 7,9 мкМ.
Пример 4.11
500 мл лизата из примера 2.16 центрифугируют в течение 30 минут при 9000 g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Выход по объему составляет 33%. Полученный концентрат содержит SDW: 163,33 мг/мл; белок: 68,42 мг/мл; ДНК: 14,1 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 38% D-Thr, 1% D-Leu, 49% D-Ser, 43% D-Asx, 64% D-Met, 30% D-Phe, 31% D-Glx, 4% D-Tyr.
Пример 4.12
500 мл лизата из примера 2.17 центрифугируют в течение 30 минут при 9000×g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Выход по объему составляет 17%. Полученный концентрат содержит SDW: 162,78 мг/мл; белок: 60,26 мг/мл; ДНК: 14,8 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 10% D-Leu, 40% D-Ser, 34% D-Asx, 62% D-Met, 27% D-Phe, 23% D-Glx, 5% D-Tyr.
Пример 4.13
500 мл лизата из примера 2.18 центрифугируют в течение 30 минут при 9000 g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Выход по объему составляет 13%. Полученный концентрат содержит SDW: 171,16 мг/мл; белок: 71,02 мг/мл; ДНК: 16,9 мкг/мл.
Пример 4.14
Лизат из примера 3.8 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2300 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,5 бар. UF останавливают после 11 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 32,5 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 86%, выход экстракции по белку составляет 87% и выход по объему составляет 90%. Полученный концентрат содержит SDW: 26,6 мг/мл; белок: 8,1 мг/мл; A.A.: 2,3 мг/мл; сахар: 0,42 мг/мл; ДНК: 68,5 мкг/мл. PBMC при 1 мг активной сухой массы/мл: IL-6: 29898 пг/мл, IL-10: 446 пг/мл, TNF-α: 3429 пг/мл. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,02 мг/мл (C1), 0,2 мг/мл (C2) и 2,0 мг/мл (C3); C1: 2,3 мкМ, C2: 16,6 мкМ, C3: 4,0 мкМ.
Пример 4.15
Лизат из примера 3.9 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2375 (л/ч·м2) LHM и TMP (перепад давления на мембране) при 1,3 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 32,5 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 83%, выход экстракции по белку составляет 79% и выход по объему составляет 92%. Полученный концентрат содержит SDW: 24,9 мг/мл; белок: 7,2 мг/мл; A.A.: 2,3 мг/мл; сахар: 0,49 мг/мл. PBMC при 1 мг активной сухой массы/мл: IL-6: 23709 пг/мл, IL-10: 385 пг/мл, TNF-α: 2917 пг/мл. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,02 мг/мл (C1), 0,2 мг/мл (C2) и 2,0 мг/мл (C3); C1: 1,1 мкМ, C2: 13,8 мкМ, C3: 4,2 мкМ.
Пример 4.16
Лизат из примера 3.10 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2500 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,0 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 15,0 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 58%, выход экстракции по белку составляет 59% и выход по объему составляет 79%. Полученный концентрат содержит SDW: 22,0 мг/мл; белок: 8,1 мг/мл; A.A.: 1,6 мг/мл; сахар: 0,46 мг/мл; ДНК: 23,9 мкг/мл. PBMC при 1 мг активной сухой массы/мл: IL-6: 21458 пг/мл, IL-10: 281 пг/мл, TNF-α: 123 пг/мл. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,02 мг/мл (C1), 0,2 мг/мл (C2) и 2,0 мг/мл (C3); C1: 14,6 мкМ C2: 23,8 мкМ, C3: 16,9 мкМ. Процент D-аминокислот: 27% D-Ala, 22% D-Thr, 11% D-Leu, 44% D-Ser, 27% D-Asx, 26% D-Met, 22% D-Phe, 16% D-Glx, 15% D-Tyr, 8% D-Lys.
Пример 4.17
Лизат из примера 3.11 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2500 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,0 бар. UF останавливают после 10 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 17,5 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 69%, выход экстракции по белку составляет 69% и выход по объему составляет 78%. Полученный концентрат содержит SDW: 22,2 мг/мл; белок: 8,3 мг/мл; A.A.: 1,8 мг/мл; сахар: 0,5 мг/мл; ДНК: 33,3 мкг/мл. PBMC при 1 мг активной сухой массы/мл: IL-6: 19304 пг/мл, IL-10: 343 пг/мл, TNF-α: 220 пг/мл. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,02 мг/мл (C1, 0,2 мг/мл (C2) и 2,0 мг/мл (C3); C1: 14,4 мкМ C2: 20,5 мкМ C3: 18,9 мкМ. Процент D-аминокислот: 30% D-Ala, 18% D-Thr, 10% D-Leu, 44% D-Ser, 29% D-Asx, 28% D-Met, 23% D-Phe, 18% D-Glx, 18% D-Tyr, 11% D-Lys.
Семьдесят литров жидкой формы нейтрализуют 196 мл HCl 25%, а затем смешивают с 10,44 кг маннита. Затем смесь лиофилизируют. в течение цикла лиофилизации продукт замораживают при -50°C, затем нагревают до -25°C. Давление в лиофильной сушке поддерживают в пределах между 0,2 и 0,5 мбар и контролируют посредством инжекции фильтрованного воздуха. Затем, при вторичной десикации, продукт нагревают до его конечной температуры лиофилизации (+30°C), в то же время поддерживая уровень вакуума ниже 0,2 мбар. Когда цикл лиофилизации завершается, нормальное давление в лиофильной сушке восстанавливается с помощью фильтрованного воздуха. Лиофилизат просеивают через присоединенное вибрационное сито. Извлекают 11,95 кг лиофилизата.
Пример 4.18
500 мл лизата из примера 3.13 центрифугируют в течение 30 минут при 9000×g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Полученный концентрат содержит SDW: 42,8 мг/мл; белок: 12,5 мг/мл; A.A.: 3,5 мг/мл; сахар: 1,13 мг/мл; ДНК: 14,1 мкг/мл. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 0,4 мкМ, C2: 5,7 мкМ, C3: 25,1 мкМ. PBMC для разбавленного объема мл концентрата: разбавление 100: IL-6: 2101 пг/мл. Процент D-аминокислот: 25% D-Ala, 12% D-Thr, 10% D-Leu, 45% D-Ser, 35% D-Asx, 35% D-Met, 29% D-Phe, 26% D-Glx.
Пример 4.19
500 мл лизата из примера 3.12 центрифугируют в течение 30 минут при 9000×g. Затем супернатант фильтруют последовательно через фильтры с пористостью 0,8 мкм, 0,45 мкм и 0,2 мкм. pH доводят до 10,5 с помощью HCl. Полученный концентрат содержит SDW: 38 мг/мл; белок: 9,7 мг/мл; A.A.: 3,1 мг/мл; сахар: 0,82 мг/мл; ДНК: 80,1 мкг/мл. Продуцирование NOx после 20000-кратного (C1), 2000-кратного (C2) и 200-кратного (C3) разбавления: C1: 0,3 мкМ, C2: 2,6 мкМ, C3: 19,2 мкМ. PBMC для разбавленного объема мл концентрата: разбавление 100: IL-6: 2802 пг/мл. Процент D-аминокислот: 35% D-Ala, 25% D-Thr, 10% D-Leu, 46% D-Ser, 40% D-Asx, 38% D-Met, 34% D-Phe, 32% D-Glx, 32% D-Tyr, 24% D-Lys.
Пример 4.20
Лизат из примера 3.14 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2500 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,2 бар. UF останавливают после 13 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 16,0 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 64%, выход экстракции по белку составляет 62% и выход по объему составляет 78%. Полученный концентрат содержит SDW: 22,4 мг/мл; белок: 8,7 мг/мл; A.A.: 1,8 мг/мл; сахар: 0,54 мг/мл; ДНК: 39,1 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 32% D-Ala, 18% D-Thr, PBMC при 1 мг активной сухой массы/мл: IL-6: 22303 пг/мл, IL-10: 561 пг/мл, TNF-α: 336 пг/мл. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,02 мг/мл (C1, 0,2 мг/мл (C2), и 2,0 мг/мл (C3): C1: 11,3 мкМ, C2: 15,3 мкМ, C3: 13,5 мкМ. Процент D-аминокислот: 32% D-Ala, 18% D-Thr, 10% D-Leu, 44% D-Ser, 26% D-Asx, 23% D-Met, 17% D-Phe, 15% D-Glx, 14% D-Tyr, 9% D-Lys.
Пример 4.21
Лизат из примера 3.15 переносят в резервуар для MF. Установка для TFF является сходной с примером 4.1. Поперечный поток для серпентинного режима устанавливают при 2500 (л/ч·м2) LHM и (перепад давления на мембране) TMP при 1,0 бар. UF останавливают после 13 объемов диафильтрации, и поток пермеата в первом цикле составляет 15,0 л/ч·м2. Выход экстракции по сухой массе составляет 69%, выход экстракции по белку составляет 66% и выход по объему составляет 77%. Полученный концентрат содержит SDW: 21,4 мг/мл; белок: 7,6 мг/мл; A.A.: 1,6 мг/мл; сахар: 0,5 мг/мл; ДНК: 25,9 мкг/мл. Процент D-аминокислот: 12,5% D-Ala, 3,4% Val, 16,6%, 65% D-Ser, 26,1% D-Asx, 18,8% D-Met, 15,6% D-Glx, 9,1% D-Lys. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл: 0,02 мг/мл (C1), 0,2 мг/мл (C2), и 2,0 мг/мл (C3): C1: 10,3 мкМ, C2: 15,2 мкМ, C3: 12,3 мкМ.
Жидкую форму лиофилизируют, как описано в примере 4.17. Содержание белка (Lowry) составляет 44 мг белка на грамм лиофилизата. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл лиофилизата: 0,01 мг/мл (C1), 0,1 мг/мл (C2) и 1,0 мг/мл (C3): C1: 6,4 мкМ, C2: 12,9 мкМ, C3: 19,4 мкМ.
Капсулы получают посредством смешивания 50,4 кг лиофилизата с 64,68 кг крахмала 1500 PT, 2,52 кг стеарата магния и 50,4 кг маннита. Продуцирование NOx в мг активной сухой массы/мл капсулы: 0,01 мг/мл (C1), 0,1 мг/мл (C2) и 1,0 мг/мл (C3): C1: 6,8 мкМ, C2: 12,1 мкМ, C3: 19,1 мкМ.
Пример 5
Пример 5A: Влияние количества "исходного материала" на активность бактериальных лизатов, измеренную по секреции IL-6 PBMC человека
Получение PBMC человека и культуры клеток
Периферическую кровь от здоровых доноров (Centre de transfusion, Hôpital Universitaire, Geneva) центрифугируют для получения лейкоцитарной пленки. Лейкоцитарную пленку смешивают со сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, Sigma, Buchs, Switzerland), наслаивают на Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia) до 1,077 г/мл и центрифугируют (2800 об/мин, 20°C, 25 мин). Клетки, которые собирают с границы раздела, промывают дважды в HBSS при 800 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре и осевшие на дно клетки повторно суспендируют в HBSS. Отсчеты клеток осуществляют с использованием сетки Нойбауэра. Все культивирование клеток осуществляют в среде RPMI-1640, дополненной пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (100 мкг/мл), L-глутамином (2 ммоль/л) и 10% фетальной сывороткой теленка (FCS), все получают от Sigma. Для стимулирования in vitro клетки культивируют при концентрации 1×106 жизнеспособных клеток/лунка.
Стимулирование и измерение IL-6 в супернатантах культур
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) инкубируют при 37°C и в 5% атмосфере CO2 с продуктами по настоящему изобретению исследуют при 0,25, 0,5, 1 и 2 мг/мл "растворимой сухой массы, SDW" в культурной среде RPMI-1640.
Супернатанты культур собирают после 24 час и концентрацию IL-6 измеряют с помощью иммуносорбентного анализа со связанными ферментами (ELISA) (Human IL-6 ELISA Set, BD OptEIA, San Diego, USA), в соответствии с инструкциями производителя. Предел детектирования составляет 10 пг IL-6/мл. Активность сначала исследуют в тесте с помощью PBMC. (См. фиг.2a и 2b, показывающие влияние увеличения количества "исходного материала" (концентрации бактериальной биомассы, выраженной в граммах сухой массы на литр лизата) от 12,5 г/л (фиг.2a) до 25 г/л (фиг.2b). Активность экстрактов зависит от количества "исходного материала", которое подвергается щелочному лизированию (12,5 г/л по сравнению с 25 г/л). Процент NaOH (2% об./об.) и время щелочного лизирования (72 час) являются постоянными. Фиг.3a и 3b показывают влияние увеличения количества исходного материала от 25 г/л до 100 г/л. Время щелочного лизирования фиксируют при 168 час, и процент NaOH фиксируют при 1%.
В соответствии с фиг.2 и 3, чем выше уровень "исходного материала", тем выше полученная активность.
Пример 5B: Влияние продолжительности лизирования на активность продуктов по настоящему изобретению при исследовании с помощью PBMC человека
"Исходный материал" составляет 12,5 г/л, и его обрабатывают 2% NaOH в течение либо 24 час (фиг.4a), либо 72 час (фиг.4b). В соответствии с этими фигурами, более продолжительное время лизирования приводит к получению более низкой активности.
Пример 6: Влияние начального процента NaOH (об./об.) на активность бактериальных лизатов по настоящему изобретению при исследовании выделения оксида азота у грызунов
Самцов мышей C57/BL6 в возрасте шесть недель (самцы в возрасте шесть недель, качество SPF, Charles Rivier, FR) умерщвляют ингаляцией СО2. Тазобедренный сустав, бедро и голень задней конечности удаляют. Костный мозг извлекают из просвета позвоночника с помощью инъекции среды Игла, модифицированной Дульбекко (DH) через кость после отрезания обеих конечных частей. После промывки стволовые клетки повторно суспендируют (40000 клеток/мл) в среде DH, дополненной 20% лошадиной сывороткой и 30% супернатантом клеток L929. Суспензию клеток инкубируют в течение 8 дней в инкубаторе при 37°C в атмосфере 8% CO2 и в атмосфере с насыщенной влажностью. Затем макрофаги отделяют с помощью PBS со льдом, промывают и повторно суспендируют в среде DH, дополненной 5% фетальной сывороткой теленка (FCS), аминокислотами и антибиотикамии (среда DHE). Плотность клеток доводят до 700000 клеток/мл. Водные растворы продуктов последовательно разбавляют в среде DHE непосредственно в планшетах для микротитрования. Продукты исследуют по три раза, и каждый планшет для микротитрования содержит отрицательный контроль, состоящий из среды. Конечный объем в каждой лунке составляет 100 мкл. 100 мкл суспензии клеток добавляют к разбавленным продуктам и клетки инкубируют в течение 22 час в инкубаторе при 37°C, в атмосфере 8% CO2 и в атмосфере насыщенной влажности. В конце периода инкубирования 100 мкл супернатанта переносят в другой планшет для микротитрования и концентрацию полученного нитрита в каждом супернатанте определяют посредством осуществления реакции Грисса. 100 мкл реагента Грисса (5 мг/мл сульфаниламида+0,5 мг/мл гидрохлорида N-(1-нафтил)этилендиамина) в 2,5% водного раствора фосфорной кислоты добавляют в каждую лунку. Планшеты для микротитрования считывают с помощью спектрофотометра (SpectraMax Plus, Molecular Devices) на 562 нм, сравнивая с эталоном на 690 нм. Концентрация нитрита пропорциональна содержанию оксида азота, которая образуется. Содержание нитрита определяют на основе стандартных кривых. Результаты приводятся в мкМ оксида азота (NO) как среднее значение ± стандартное отклонение и изображаются на графике как кривая доза-ответ.
В исследованиях, показанных на фиг.5, количество исходного материала (25 г/л) и время лизирования (168 час) являются сходными, исследуемый параметр представляет собой концентрацию NaOH (1% для части A по сравнению с 4% для части B), используемую для получения обоих лизатов. Более низкая активность наблюдается, когда используют 4% NaOH (B на фиг.5) по сравнению с 1% NaOH (A на фиг.5), что говорит о вероятной зависимой от дозы щелочной деградации молекул, подобных эндотоксинам.
В зависимости от исходного материала, концентрации NaOH и времени лизирования могут генерироваться различные иммунологические активности при исследовании NO макрофагов.
Пример 7: Хромогенное исследование с использованием лизата амебоцитов Limulus (LAL)
Для определения присутствия молекул, подобных эндотоксинам, исследование LAL осуществляют с помощью Chromogenic - LAL Kit от Bio-Whittaker.
Это исследование основано на активировании посредством липополисахаридов (LPS) или продуктов сравнимой структуры с помощью ферментативного каскада, присутствующего в LAL. Это ферментативное активирование демонстрируется посредством отщепления хромогена, связанного с пептидом, с помощью протеазы. Ферментативную реакцию осуществляют при 37°C и образование хромогена со временем измеряют на 405 нм. Регистрируют время, необходимое для получения 0,2 единицы D.O., и эндотоксичную активность вычисляют по отношению к стандарту LPS (стандартные кривые).
Результаты такого иллюстративного эксперимента на экстрактах в соответствии с настоящим изобретением выражены в таблице, ниже, в EU (единицы эндотоксина) по отношению к стандартному препарату LPS E.coli (1 EU соответствует 0,09 нг эквивалента LPS).
Пример 8: Влияние вариантов осуществления настоящего изобретения на модели инфекции мочевого тракта Escherichia coli для невосприимчивого к LPS штамма мышей
Варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением исследуют на модели инфекции мочевого тракта E.coli у невосприимчивых к LPS мышей. (См. Hopkins et al., Inheritance of susceptibility to induced Escherichia coli bladder and kidney infections in female C3H/HeJ mice., J Infect Dis. 2003 Feb 1; 187(3): 418-23). Три группы самок мышей C3H/HeJ в возрасте 10-12 недель (по 8 мышей в каждой группе) лечат перорально одним из трех различных экстрактов (см. ниже) в течение 10 дней перед инфицированием E.coli. Мыши C3H/HeJ содержат мутацию в гене Toll-подобного рецептора TLR4 и являются невосприимчивыми к агонистам TLR4, таким как липополисахариды (LPS). По этой причине эта модель является пригодной для использования при детектировании влияния лекарственных средств, действующих путями, иными, чем TLR4.
Мышей выдерживают в течение периода лечения при нормальных условиях при температуре окружающей среды 18-26°C и при относительной влажности от 30 до 70%. Программу освещения устанавливают на цикл свет-темнота 12:12 часов. Животных кормят стандартным питанием, поставляемым лабораториями Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, В). Водопроводную воду подают ad libitum, за исключением тех случаев, когда здесь указано иное.
Три исследуемых экстракта представляют собой:
a) экстракт, полученный сильным лизированием штаммов 18 E.coli,
b) экстракт, полученный умеренным лизированием штаммов 18 E.coli,
c) экстракт, полученный смешиванием a) и b) (1/4 и 3/4 соответственно).
25 мг бактериального экстракта дают каждой мыши перорально один раз день в течение 10 последовательных дней. Мышей инокулируют интравезикально фосфатным буферным солевым раствором (PBS) или уропатогенным штаммом E.coli 1677 в соответствии с протоколом минимального инокулирования, что понижает вероятность связанной с обратным потоком инокуляции почки и вызывает инфекции у всех инокулированных животных. Штамм E.coli 1677, выделенный из мочи женщин с лихорадочным UTI, используют в этих экспериментах. Этот штамм представляет собой O6 и содержит гены, например, гемолизина, аэробактина, P fimbriae, и типа 1 fimbriae, но, например, не афимбриального адгезина I, цитотоксичного некротизирующего фактора 1 и S fimbriae. Для приготовления инокулума бактерии выращивают из замороженного бульона с помощью 2 пассажей в триптозной питательной среде (Difco Laboratories), промывают PBS и повторно суспендируют до концентраций 2Ч1010 бактерий/мл. Мышам не дают воды в течение 1 часа и мочу удаляют из их мочевых пузырей непосредственно перед инокуляцией. Десять микролитров бактериального инокулума вливают в мочевой пузырь посредством уретральной катетеризации под изофлурановой анестезией, что приводит к получению дозы 2Ч108 E.coli на мышь. Животным позволяют восстановиться после анестезии и опять дают воду через 1 час.
Мышей умерщвляют через 10 дней после инокуляции для оценки интенсивности инфицирования мочевого пузыря и почек. Мочевой пузырь и обе почки у каждого животного удаляют, взвешивают и гомогенизируют в стерильном PBS, после чего гомогенаты последовательно наносят на пластины агара Левина с эозином - метиленовым голубым (Difco Laboratories). Количество колоний E.coli на каждой пластине подсчитывают после инкубирования в течение ночи при 37°C и используют для вычисления общего количества бактерий в каждом мочевом пузыре или паре почек.
Точный тест Фишера для наименьшего значимого различия используют для определения статистически значимых различий между средними общими значениями колониеобразующих единиц (CFU) для различных групп мышей (PBS, нелеченая инфицированная группа и леченая и инфицированная группа). Данные по инфекции мочевого пузыря и почек преобразуют с использованием общего CFU=log10 [(CFU+100)/мг ткань], где CFU представляет собой общее количество колониеобразующих единиц, подсчитанное на образец ткани.
Полученные результаты показаны на фиг.6a и 6b, для мочевого пузыря и почек, соответственно. В итоге, 3 исследуемых бактериальных лизата уменьшают с коэффициентом >3 (мочевой пузырь) и >2 (почки) полученные логарифмические значения, что указывает на то, что количество колоний, культивируемых из мочевого пузыря и почек, уменьшается, по меньшей мере, с коэффициентом 1000 и 100, соответственно. Поскольку результаты генерируются у мышей C3H/HeJ, наблюдаемые воздействия являются независимыми от TLR4.
Пример 9: Влияние вариантов осуществления настоящего изобретения на модели грызунов при внутрибрюшинной инфекции Salmonella typhimurium для штамма мышей, восприимчивых к LPS
Три экстракта по настоящему изобретению, описанных в примере 8, также исследуют на мышах C57/bl, которые имеют нормальную восприимчивость к LPS. Три исследуемых экстракта представляют собой:
a) экстракт, полученный сильным лизированием 18 штаммов E.coli,
b) экстракт, полученный умеренным лизированием 18 штаммов E.coli,
c) экстракт, полученный смешиванием a) и b) (1/4 и ѕ, соответственно).
Мышь C57BL/6 выдерживают в течение 7 дней перед пероральным лечением веществами, рассмотренными выше. Эксперимент состоит из 4 экспериментальных групп - из 3 групп, которые лечат соединениями по настоящему изобретению, и контрольной группы. Каждая экспериментальная группа содержит 20 мышей. Мыши в контрольной группе получают симуляцию лечения с использованием перорального введения 0,5 мл воды ежедневно в течение 10 дней. Для других групп экстракты растворяют ежедневно в дистиллированной воде, чтобы получить отдельную дозу в конечном объеме 0,5 мл. Этот 0,5-мл объем дают каждой мыши перорально один раз день в течение 10 последовательных дней перед тем, как все мыши провоцируются Salmonella. По 10 мг бактериального экстракта дают каждому животному при каждом введении.
Для провоцирования суспензию штамма 415 Salmonella typhimurium (I. Mechnikov Institute for Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences) вводят как внутрибрюшинную инъекцию каждой мыши.
Предварительное провоцирование для подбора дозы (не показано) находится в пределах от 102 до 105 CFU Salmonellae на мышь. Дозу 104 CFU выбирают для основного эксперимента, поскольку эта доза обеспечивает приблизительно 50% выживших из нелеченых животных. После провоцирования мышей выдерживают при условиях, стандартных для лабораторных животных. Ежедневное наблюдение и регистрацию умерших осуществляют в течение периода 21 день после инфицирования.
Антиинфекционная эффективность соединений (см. таблицы, ниже) оценивается в соответствии с частотой выживания (SR) после инфицирования, средней продолжительностью жизни (ADL) после инфицирования, фактором защиты (DF) и с получением индекса эффективности (EI), который вычисляют для каждой экспериментальной группы. SR берется как процент живых животных в экспериментальной группе в день 21 после инфицирования. ADL, DF и EI вычисляют с использованием следующих формул:
ADL=(X1+X2+...+Xn):N,
где ADL представляет собой среднюю продолжительность жизни, X1-Xn представляют собой продолжительности жизни после инфицирования для экспериментальных мышей №1-№n, и N представляет собой общее количество животных в экспериментальной группе.
DF=CD:ED,
где DF представляет собой фактор защиты, CD представляет собой процент умерших в контрольной группе и ED представляет собой процент умерших в экспериментальной группе.
EI=[(DF-1):DF]Ч100%,
где EI представляет собой полученный индекс эффективности и DF представляет собой фактор защиты.
Регистрация смертей в экспериментальной группе в течение периода в 21 день после инфицирования 104 CFU Salmonella typhimurium. Такие же результаты представлены на фиг.7.
тельное лечение
вания
Эффективность защиты экстрактами на модели мышей C57BL/6 от смертельной инфекции Salmonella thyphimurium
(%)
Экстракты (a) и (c), которые получают от сильного щелочного лизирования (сильное) и из смеси сильного и умеренного лизирования (смесь), хорошо переносятся. Экстракт (b), который получают от умеренного лизирования (умеренное), демонстрирует более высокую токсичность, чем другие. Уменьшение размеров тела мышей и замедление роста мышей наблюдают, хотя не измеряют, в группе, которую лечат экстрактом (b). Четыре из 20 мышей в экспериментальной группе (b) или "умеренное" умирают в течение курса лечения. Таким образом, только 16 мышей в этой группе провоцируют позднее Salmonellae.
В контрольной группе мышей, которых предварительно лечат водой, частота выживания в течение периода наблюдения (21 день) составляет 58% и ADL составляет 15,3 дня. Экстракт (b), видимо, не обеспечивает получения защиты против инфекции Salmonella, и экстракт ускоряет гибель инфицированных животных. Конкретно, 90% мышей умирают на день 7 после инфицирования, и ADL составляет 3,3 дня. Частота выживания в этой группе на день 21 после инфицирования составляет всего лишь 6% (см. таблицу выше и фиг.7).
В противоположность этому, экстракты (a) и (c), которые получают от сильного лизирования (сильное) или из смеси от сильного и умеренного лизирования (смесь), повышают стойкость мышей к инфекции Salmonella thyphimurium. Оба вещества показывают хорошую эффективность защиты. Конкретно, частота выживания после провоцирования экстрактом (c) (смесь) составляет 90%, в то время как для экстракта (a) (сильное) она составляет 85% (таблицы выше и фиг.7).
Дополнительные примеры
Экстракт одного или более бактериальных штаммов Escherichia coli, где в течение получения экстракта один или более бактериальных штаммов лизируют при pH более чем 12, и экстракт обрабатывают с тем, чтобы удалить нуклеиновые кислоты; и где экстракт не вызывает риска появления прионного заболевания при введении пациенту.
Экстракт по предыдущему параграфу, полученный, по меньшей мере, из одного штамма E.coli, выбранного из NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708, и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
Экстракт по предыдущему параграфу, полученный из каждого из следующих штаммов E.coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
Экстракт по любому из трех предыдущих параграфов, где экстракт содержит менее чем 100 мкг/мл нуклеиновой кислоты.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт содержит, по меньшей мере, 0,3 мг/мл сахаридов.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где, по меньшей мере, один сахарид выбирают из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов.
Экстракт по предыдущему параграфу, где, по меньшей мере, один полисахарид представляет собой разветвленный полисахарид.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где, по меньшей мере, один сахарид является химически модифицированным.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт содержит 0,3-4,5 мг/мл сахаридов.
Экстракт по любому из параграфов, упоминаемых выше, где лизирование осуществляют при pH от 12,6 до 13,4.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт получают с помощью лизирования в течение периода от 30 до 120 часов от 15 до 80 г/л биомассы.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт обрабатывают с тем, чтобы удалить материал в виде частиц и/или нерастворимые компоненты.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт содержит 1,5-2,5 мг/мл свободных аминокислот.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где каждый бактериальный штамм культивируют в среде, которая не вызывает риска появления прионного заболевания.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где каждый бактериальный штамм, из которого получают экстракт, культивируют в растительной или синтетической среде.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где, по меньшей мере, одна аминокислота, выбранная из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, гистидина, аланина, аргинина, тирозина, метионина, фенилаланина и лизина, является рацемизированной, по меньшей мере, на 10%.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где свободные аминокислоты экстракта содержат 1-80% D-аминокислот.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где свободные аминокислоты экстракта содержат 10-45% D-аминокислот.
Экстракт по предыдущему параграфу, где свободные аминокислоты экстракта содержат 25-35% D-аминокислот.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт содержит, по меньшей мере, одну D-аминокислоту, выбранную из D-аспарагиновой кислоты и D-аспарагина, D-глутаминовой кислоты и D-глутамина, D-серина, D-метионина, D-гистидина, D-аланина, D-аргинина, D-фенилаланина, D-тирозина, D-лейцина, D-лизина, D-валина и D-треонина.
Экстракт по предыдущему параграфу, где концентрация любой из D-аминокислот находится в пределах между 1 и 50% от концентрации свободных аминокислот.
Экстракт по предыдущему параграфу, где концентрация любой из D-аминокислота находится в пределах между 10 и 40% от концентрации свободных аминокислот.
Экстракт по предыдущему параграфу, где концентрация любой из D-аминокислота находится в пределах между 15 и 35% от концентрации свободных аминокислот.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт содержит меньше чем 5000 нг эквивалентов LPS согласно хромогенному исследованию с использованием лизата амебоцитов Limulus (LAL).
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где экстракт содержит 8-75 мг/мл одного или более белков.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где один или более белков имеют молекулярные массы менее чем 30 кДа.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где один или более белков имеют молекулярные массы менее чем 10 кДа.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где частота выживания, по меньшей мере, 8 мышей, невосприимчивых к LPS, за 13 дней после провоцирования уропатогенным штаммом 1677 E.coli составляет, по меньшей мере, 70%, при этом дозу уропатогенного штамма E.coli 1677 выбирают так, что частота выживания, по меньшей мере, 8 контрольных мышей составляет 60% или ниже.
Экстракт по предыдущему параграфу, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 80%.
Экстракт по предыдущему параграфу, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 90%.
Экстракт по любому из предыдущих параграфов, где частота выживания, по меньшей мере, 8 мышей с восприимчивостью к LPS дикого типа за 13 дней после провоцирования Salmonella thyphimurium составляет, по меньшей мере, 70%, при этом дозу Salmonella thyphimurium выбирают так, что частота выживания, по меньшей мере, 8 контрольных мышей составляет 60% или ниже.
Экстракт по предыдущему параграфу, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 80%.
Экстракт по предыдущему параграфу, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 90%.
Фармацевтическая композиция, содержащая экстракт по любому из упоминаемых выше параграфов.
Способ лечения субъекта, страдающего от развития расстройства пищеварительного или мочевого тракта или имеющего риск его появления, включающий введение эффективного количества любого из экстрактов из приведенных выше параграфов упомянутому субъекту.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором упомянутый субъект представляет собой человека.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором расстройство пищеварительного или мочевого тракта выбирают из уретрита, тубулоинтерстициального нефрита, обструктивного пиелонефрита, инфекции мочевого тракта, вызванной обструктивной и рефлюкс-уропатией, цистита, включая хронический цистит, простатита, включая хронический простатит, простатоцистита, воспалительных заболеваний тазовых органов у женщин, болезни Крона и синдрома раздраженной толстой кишки.
Способ приготовления экстракта, полученного из одного или более штаммов of E.coli, включающий следующие стадии:
(a) культивирование каждого штамма в среде, которая не вызывает риска появления прионного заболевания;
(b) лизирование каждого штамма при pH более чем 12 и
(c) прохождение продукта из (b), по меньшей мере, один раз через микрофильтр и, по меньшей мере, один раз через ультрафильтр.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором экстракт получают, по меньшей мере, из одного штамма E.coli, выбранного из NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором экстракт получают из каждого из следующих штаммов E.coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором лизирование осуществляют при начальном pH более чем 12,5.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором лизирование осуществляют при начальном pH от 12,6 до 13,4.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором лизирование осуществляют при начальной концентрации ионов гидроксида от 0,1 н. до 1,1 н.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором лизирование осуществляют при начальной концентрации ионов гидроксида от 0,2 н. до 1 н.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором лизирование осуществляют в течение периода от 20 часов до 10 дней при 30-60°C.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором лизирование осуществляют в течение периода от 40 часов до 72 часов при 35-40°C.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором микрофильтр имеет поры размером 0,45 микрон и ультрафильтр имеет поры размером 30 КДа.
Способ по любому из предыдущих параграфов, кроме того, включающий прохождение продукта (c) через второй микрофильтр с порами размером 0,2 микрон.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором стадию (c) осуществляют с помощью проточной фильтрации вдоль потока.
Способ по предыдущему параграфу, в котором проточную фильтрацию вдоль потока осуществляют в течение 5-15 циклов.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором проточную фильтрацию вдоль потока осуществляют, как приведено на фиг.1.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором проточную фильтрацию вдоль потока осуществляют, как приведено на фиг.1, в серпентинном режиме.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором стадию (b) осуществляют с 10-120 г/л сухой массы бактериального материала.
Способ по любому из предыдущих параграфов, в котором стадию (b) осуществляют с 15-80 г/л сухой массы бактериального материала.
Продукт, полученный любым способом по предыдущим параграфам.
Способ лечения субъекта, страдающего от развития расстройства пищеварительного или мочевого тракта или имеющего риск его появления, включающий введение эффективного количества любого из продуктов любого из способов из приведенных выше параграфов упомянутому субъекту.
Способ по предыдущему параграфу, в котором субъект представляет собой человека.
Изобретение относится к области медицины и фармации и представляет собой иммуностимулирующий экстракт из одного или более бактериальных штаммов Escherichia coli, где в течение получения экстракта один или более бактериальных штаммов лизируют при pH более чем 12, и экстракт обрабатывают с тем, чтобы удалить нуклеиновые кислоты; и где экстракт не вызывает риска появления прионного заболевания при введении пациенту, содержит менее чем 100 мкг/мл нуклеиновой кислоты, содержит химически модифицированные сахариды, включая химически модифицированный липополисахарид, и содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, серина, гистидина, аланина, аргинина, тирозина, метионина, фенилаланина и лизина, которая является рацемизированной, по меньшей мере, на 10%. Изобретение обеспечивает максимальную безопасность и эффективность при его применении. 6 н. и 46 з.п. ф-лы, 9 пр., 6 табл., 7 ил.
1. Иммуностимулирующий экстракт из одного или более бактериальных штаммов Escherichia coli, где в течение получения экстракта один или более бактериальных штаммов лизируют при pH более чем 12, и экстракт обрабатывают с тем, чтобы удалить нуклеиновые кислоты; и где экстракт:
не вызывает риска появления прионного заболевания при введении пациенту,
содержит менее чем 100 мкг/мл нуклеиновой кислоты,
содержит химически модифицированные сахариды, включая химически модифицированный липополисахарид, и
содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, серина, гистидина, аланина, аргинина, тирозина, метионина, фенилаланина и лизина, которая является рацемизированной, по меньшей мере, на 10%.
2. Экстракт по п.1, полученный, по меньшей мере, из одного штамма E.coli, выбранного из NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
3. Экстракт по п.1, полученный из каждого из следующих штаммов E.coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
4. Экстракт по п.1, 2 или 3, где экстракт содержит, по меньшей мере, 0,3 мг/мл сахаридов.
5. Экстракт по п.4, где экстракт содержит 0,3-4,5 мг/мл сахаридов.
6. Экстракт по п.4, где, по меньшей мере, один сахарид выбирают из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов.
7. Экстракт по п.6, где, по меньшей мере, один полисахарид представляет собой разветвленный полисахарид.
8. Экстракт по любому из пп.1-3 или 5-7, где лизирование осуществляют при pH от 12,6 до 13,4.
9. Экстракт по любому из пп.1-3 или 5-7, где экстракт обрабатывают с тем, чтобы удалить материал в виде частиц и/или нерастворимые компоненты.
10. Экстракт по любому из пп.1-3 или 5-7, где каждый бактериальный штамм культивируют в среде, которая не вызывает риска появления прионного заболевания.
11. Экстракт по п.10, где каждый бактериальный штамм, из которого получают экстракт, культивируют в растительной или синтетической среде.
12. Экстракт по любому из пп.1-3, 5-7 или 11, где экстракт содержит 1,5-2,5 мг/мл свободных аминокислот.
13. Экстракт по п.12, где свободные аминокислоты в экстракте содержат 1-80% D-аминокислот.
14. Экстракт по п.13, где свободные аминокислоты в экстракте содержат 10-45% D-аминокислот.
15. Экстракт по п.14, где свободные аминокислоты в экстракте содержат 25-35% D-аминокислот.
16. Экстракт по любому из пп.1-3, 5-7, 11, 14 или 15, где экстракт содержит, по меньшей мере, одну D-аминокислоту, выбранную из D-аспарагиновой кислоты и D-аспарагина, D-глутаминовой кислоты и D-глутамина, D-серина, D-метионина, D-гистидина, D-аланина, D-аргинина, D-фенилаланина, D-тирозина, D-лейцина, D-лизина, D-валина и D-треонина.
17. Экстракт по п.16, где концентрация любой из D-аминокислот находится в пределах между 1 и 50% от концентрации свободных аминокислот.
18. Экстракт по п.17, где концентрация любой из D-аминокислот находится в пределах между 10 и 40% от концентрации свободных аминокислот.
19. Экстракт по п.18, где концентрация любой из D-аминокислот находится в пределах между 15 и 35% от концентрации свободных аминокислот.
20. Экстракт по любому из пп.1-3, 5-7, 11, 14, 15 или 17-19, где экстракт содержит меньше чем 5000 нг LPS эквивалентов согласно хромогенному исследованию лизата амебоцитов Limulus (LAL).
21. Экстракт по любому из пп.1-3, 5-7, 11, 14, 15 или 17-19, где экстракт содержит 8-75 мг/мл одного или более белков.
22. Экстракт по п.21, где один или более белков имеют молекулярные массы менее чем 30 кДа.
23. Экстракт по п.21, где один или более белков имеют молекулярные массы менее чем 10 кДа.
24. Экстракт по любому из пп.1-3, 5-7, 11, 14, 15, 17-19, 22 или 23, где частота выживания, по меньшей мере, 8 невосприимчивых к LPS мышей за 13 дней после провоцирования уропатогенным штаммом E.coli 1677 составляет, по меньшей мере, 70%, при этом дозу уропатогенного штамма E.coli 1677 выбирают так, что частота выживания, по меньшей мере, 8 контрольных мышей, которых лечат водой, составляет 60% или ниже, и где экспериментальных и контрольных мышей лечат экстрактом или водой в течение периода 10 дней перед провоцированием.
25. Экстракт по п.24, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 80%.
26. Экстракт по п.24, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 90%.
27. Экстракт по любому из пп.1-3, 5-7, 11, 14, 15, 17-19, 22, 23, 25 или 26, где частота выживания, по меньшей мере, 8 мышей с восприимчивостью к LPS дикого типа за 13 дней после провоцирования Salmonella thyphimurium составляет, по меньшей мере, 70%, при этом дозу Salmonella thyphimurium выбирают так, что частота выживания, по меньшей мере, 8 контрольных мышей, которых лечат водой, составляет 60% или ниже, и где экспериментальных и контрольных мышей лечат экстрактом или водой в течение периода от 10 дней перед провоцированием.
28. Экстракт по п.27, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 80%.
29. Экстракт по п.27, где частота выживания составляет, по меньшей мере, 90%.
30. Иммуностимулирующая фармацевтическая композиция, пригодная для введения субъекту-человеку, содержащая экстракт по любому из пп.1-29.
31. Способ лечения субъекта, страдающего от развития расстройства пищеварительного или мочевого тракта или имеющего риск его появления, включающий введение эффективного количества экстракта по любому из пп.1-29 или фармацевтической композиции по п.30 указанному субъекту.
32. Способ по п.31, в котором указанный субъект представляет собой человека или домашнее млекопитающее.
33. Способ по п.31 или 32, в котором расстройство пищеварительного или мочевого тракта выбирают из уретрита, тубулоинтерстициального нефрита, обструктивного пиелонефрита, инфекции мочевого тракта, вызванной обструктивной и рефлюкс-уропатией, цистита, включая хронический цистит, простатита, включая хронический простатит, простатоцистита, воспалительных заболеваний тазовых органов у женщин, болезни Крона и синдрома раздраженной толстой кишки.
34. Способ приготовления экстракта по любому из пп.1-29, полученного из одного или более штаммов E.coli, включающий следующие стадии:
(a) культивирование каждого штамма в среде, которая не вызывает риска появления прионного заболевания;
(b) лизирование каждого штамма при pH более чем 12 и
(c) прохождение продукта из (b), по меньшей мере, один раз через микрофильтр и, по меньшей мере, один раз через ультрафильтр.
35. Способ по п.34, в котором экстракт получают, по меньшей мере, из одного штамма E.coli, выбранного из NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
36. Способ по п.34, в котором экстракт получают из каждого из следующих штаммов E.coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089.
37. Способ по любому из пп.34, 35 или 36, в котором лизирование осуществляют при начальном pH более чем 12,5.
38. Способ по п.37, в котором лизирование осуществляют при начальном pH от 12,6 до 13,4.
39. Способ по любому из пп.34, 35 или 36, в котором, по меньшей мере, стадию лизирования осуществляют при начальной концентрации ионов гидроксида от 0,1 н. до 1,1 н.
40. Способ по любому из пп.34, 35 или 36, в котором, по меньшей мере, стадию лизирования осуществляют при начальной концентрации ионов гидроксида от 0,2 н. до 1 н.
41. Способ по любому из пп.34-36 или 38, в котором, по меньшей мере, стадию лизирования осуществляют в течение периода от 30 до 50 ч при 30-40°С.
42. Способ по любому из пп.34-36 или 38, в котором, по меньшей мере, стадию лизирования осуществляют в течение периода от 60 до 120 ч при 30-40°С.
43. Способ по любому из пп.34-36 или 38, в котором микрофильтр имеет поры размером 0,45 мкм и ультрафильтр имеет поры размером 30 КДа.
44. Способ по любому из пп.34-36 или 38, кроме того, включающий прохождение продукта из (с) через второй микрофильтр с порами размером 0,2 мкм.
45. Способ по любому из пп.34-36 или 38, в котором стадию (с) осуществляют с помощью проточной фильтрации вдоль потока.
46. Способ по п.45, в котором проточную фильтрацию вдоль потока осуществляют в течение 5-15 циклов.
47. Способ по любому из пп.34-36, 38 или 46, в котором стадию (b) осуществляют с 10-120 г/л сухой массы бактериального материала.
48. Способ по любому из пп.34-36, 38 или 46, включающий лизирование, по меньшей мере, одного штамма при условиях сильного лизирования и лизирование, по меньшей мере, одного штамма при условиях умеренного лизирования, и кроме того, включающий совместное смешивание продуктов сильного и умеренного лизирования.
49. Способ по любому из пп.34-36, 38 или 46, включающий лизирование каждого штамма при условиях как сильного, так и умеренного лизирования, и кроме того, включающий совместное смешивание продуктов сильного и умеренного лизирования.
50. Продукт, представляющий собой иммуностимулирующий экстракт, полученный способом по любому из пп.34-49.
51. Способ лечения субъекта, страдающего от развития расстройства пищеварительного или мочевого тракта или имеющего риск его появления, включающий введение эффективного количества продукта по п.50 указанному субъекту.
52. Способ по п.51, в котором субъект представляет собой человека или домашнее млекопитающее.
| Jason L | |||
| Wright et | |||
| al | |||
| Extraction of plasmid DNA using reactor scale alkaline lysis and selective precipitation for scalable transient transfection | |||
| Скоропечатный станок для печатания со стеклянных пластинок | 1922 |
|
SU35A1 |
| СПОСОБ ПЕРЕКАЧИВАНИЯ АГРЕССИВНЫХ ЖИДКОСТЕЙ | 1993 |
|
RU2054374C1 |
| US 4952500 A1, 28.08.1990 | |||
| US 5424287 A, 13.06.1995 | |||
| ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ НЕФОТОСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ НИТЧАТОЙ БАКТЕРИИ И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ | 1996 |
|
RU2188029C2 |
