СТАБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКА В РАСТВОРЕ Российский патент 2009 года по МПК C08J5/00 B65D1/02 A61K38/48 A61J1/05 

Область техники изобретения

Данное изобретение, помимо прочего, относится к применению в качестве материала внутренней стенки в контейнере для содержания и хранения фармацевтической композиции белка, в частности, витамин К-зависимого белка системы свертывания крови, такого как фактор VIIa, материала, который снижает или минимизирует тенденцию рассматриваемого белка к димер-, олиго- и/или полимеризации и/или, возможно, подвергаться другим процессам, которые способствуют потере активности рассматриваемого белка. В частности, изобретение важно для содержания и временного хранения жидкой композиции белка, особенно водной композиции белка.

Уровень техники изобретения

Группа белков, известных как витамин К-зависимые зимогенные белки системы свертывания крови, примером которых является фактор VII (FVII), представляет особый интерес в контексте данного изобретения. Рассматриваемые белки, которые имеют сходную белковую доменную структуру и содержат домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 Gla-остатками, составляют важный класс факторов свертывания, который вовлечен в естественно происходящий физиологический процесс, известный как гемостаз. Процесс гемостаза, который осуществляется в ответ на кровотечение, возникающее как результат вызванного повреждения стенки кровеносного сосуда, например, при травме или хирургических вмешательствах, инициируется образованием комплекса между тканевым фактором (TF), который становится доступным циркулирующей крови после повреждения стенки кровеносного сосуда, и активированной формой FVII (FVIIa), которая присутствует в циркуляции в количестве, соответствующем приблизительно 1% общей массы белка FVII. Образованный комплекс прикрепляется к TF-несущей клетке, и он активирует фактор X (FX) и фактор IX (FIX) с образованием их активированных форм (FXa и FIXa, соответственно) на клеточной поверхности. FIXa активирует протромбин в тромбин, который, в свою очередь, активирует фактор VIII (FVIII), фактор V (FV), фактор XI (FXI) и фактор XIII (FXIII) с образованием их активированных форм (FVIIIa, FVa, FXIa и FXIIIa, соответственно).

Кроме того, ограниченное количество тромбина, образованного на упомянутой исходной стадии гемостаза, также активирует тромбоциты крови, заставляя их изменить форму и представлять заряженные фосфолипиды на их поверхности. Названная поверхность активированных тромбоцитов образует матрицу для последующей дальнейшей активации FX и полного образования тромбина. Дальнейшая активация FX на поверхности активированных тромбоцитов происходит через комплекс FIXa-FVIIIa, образованный на поверхности активированного тромбоцита, а FXa затем превращает протромбин в тромбин пока еще на поверхности. Тромбин затем превращает фибриноген в фибрин, который является нерастворимым и который стабилизирует исходную тромбоцитарную закупоривающую массу. Описанный процесс компартментализован, то есть локализован в участке экспрессии TF или выделения, минимизируя вследствие этого риск системной активации системы свертывания. Нерастворимый фибрин, образующий сгусток, дополнительно стабилизируется в результате FXIII-катализируемого сшивания волокон фибрина.

Среди белков фактор VII (FVII) представляет особый интерес в контексте изобретения; белки FVII встречаются у млекопитающих (включая человека) и у других многочисленных видов животных (например, некоторых рыб). В плазме FVII существует, главным образом, в виде одноцепочечного зимогена, который расщепляется за счет FXa до его двухцепочечной активированной формы, обозначаемой FVIIa. Рекомбинантный активированный фактор VIIa (rFVIIa) был разработан как прогемостатический агент. Исследования показали, что введение rFVIIa приводит к быстрому и высокоэффективному прогемостатическому ответу у субъектов с гемофилией, у которых возникают кровотечения, которые невозможно лечить продуктами факторов свертывания, таких как FVIII или FIX, вследствие образования антител. Кроме того, кровотечения у субъектов с недостаточностью фактора VII, а также у субъектов, имеющих нормальную систему свертывания, но испытывающих сильное кровотечение (например, как последствие тяжелой травмы), можно успешно лечить FVIIa. В проведенных исследованиях никакие вредные побочные действия rFVIIa (в частности, появление тромбоэмболии) не были отмечены.

Введение дополнительного экзогенного FVIIa увеличивает образование тромбина на поверхности активированных тромбоцитов; этот факт был показан на пациентах с гемофилией с недостаточностью FIX или FVIII и, поэтому, с недостаточностью большинства возможных путей полного образования тромбина. Аналогично, у пациентов со сниженным количеством тромбоцитов или нарушенной функцией тромбоцитов введение дополнительного FVIIa увеличивает образование тромбоцитов.

Коммерческие препараты рекомбинантного FVIIa (rhFVIIa) человека продают как NovoSeven™ (Novo Nordisk A/S, Denmark), который поставляют в виде сублимированного препарата в ампулах, содержащих, например, 1,2 мг rhFVIIa,

5,84 мг NaCl, 2,94 мг CaCl₂·2H₂O, 2,64 мг глицилглицина, 0,14 мг полисорбата™ 80, 60,00 мг маннита, и который восстанавливают перед применением, используя 2,0 мл воды для инъекций (WFI). Полученный раствор после восстановления можно использовать в течение 24 часов, если хранят максимум при 25°С. В настоящее время никакие жидкие или высококонцентрированные композиции FVIIa коммерчески не поставляются, однако ясно, что жидкая композиция FVIIa с адекватной активностью и стабильностью является крайне желательной.

Вообще, на стабильность белка в растворе, помимо прочего, могут оказывать влияние такие факторы, как ионная сила, рН, температура, повторные циклы замораживания/оттаивания или воздействие разрушающих сил сдвига. Активный белок может быть утрачен в результате различных видов физической или физико-химической нестабильности, включая тенденцию к денатурации и/или агрегации (образование растворимых или нерастворимых агрегатов), а также химической нестабильности, включая, например, тенденцию к гидролизу, деамидированию и/или окислению, упомянутые среди прочих. Для общего ознакомления со стабильностью белковых фармацевтических препаратов смотри, например, Manning et al., Pharmaceutical Research 6: 903-918 (1989).

Тогда как возможные проявления белковой нестабильности достаточно установлены, в значительной степени невозможно сделать надежными предсказания, касающиеся типов нестабильности, которые следует ожидать для определенного белка. Многочисленные виды нестабильности могут привести к образованию белковых побочных продуктов или белковых производных, проявляющих, например, сниженную активность, повышенную токсичность и/или повышенную иммуногенность. Таким образом, например, в случае FVIIa, который является сериновой протеиназой, фрагментация белка вследствие автопротеолиза представляет собой деградацию, которую следует учитывать.

Преципитация белка из раствора, в лучшем случае, может приводить к неоднородности лекарственной формы и количества, а также к засорению шприцев или, в самом худшем случае, к тромбозу у субъекта, которого лечат. Кроме того, посттрансляционные модификации, например, такие как гамма-карбоксилирование определенных остатков глутаминовой кислоты на N-конце белка или введение углеводородных боковых цепей, могут создавать участки, которые потенциально являются чувствительными к химической модификации при хранении.

Таким образом, безопасность и эффективность любой фармацевтической композиции белка непосредственно связаны с его стабильностью. В этом отношении сохранение стабильности жидкой лекарственной формы вообще является более необходимым, чем в случае твердого препарата, например лиофилизированного препарата, который предназначен для растворения или восстановления в соответствующем жидком наполнителе незадолго перед введением, из-за значительно повышенного потенциала молекулярного движения в жидкой фазе и, вследствие этого, повышенной вероятности молекулярных взаимодействий. Кроме того, сохранение стабильности концентрированной жидкой композиции белка вообще является более необходимым, чем в случае более разбавленных жидких композиций, вследствие большей склонности к образованию агрегатов при более высоких белковых концентрациях.

Данное изобретение, явившееся результатом наблюдений, что жидкие водные препараты/композиции FVII (в данном случае как FVIIa), которые хранили в определенных типах контейнеров, проявляют неудовлетворительно высокую скорость и/или степень образования агрегатов. На основании указанных наблюдений проводили исследования, позволившие разработать критерии, в соответствии с которыми можно значительно улучшить стабильность жидкой фазы не только FVII, но также родственных типов белков.

Краткое описание изобретения

В данном изобретении установлено, что на стабильность фактора VIIa (FVIIa) в водных растворах (то есть в водных композициях) в отношении образования агрегатов (димеров, олигомеров или полимеров) оказывает значительное влияние природа материала, являющегося материалом внутренней стенки контейнера, в котором хранят водную композицию, и идентифицирован целый ряд типов материалов, которые, как оказалось, являются желательными материалами в отношении минимизации образования агрегатов (и возможно других форм деградации) и в связи с этим для минимизации потери активности белка.

Как уже упоминалось выше, FVII является одним из целого ряда белков (примерами которых являются так называемые витамин К-зависимые зимогенные белки свертывания, также упоминавшиеся выше), которые имеют сходную белковую доменную структуру и которые включают в себя домен с γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), содержащий от 9 до 12 остатков Gla на аминоконце; белок описанного типа для удобства иногда называют «Gla-доменный белок». Оказалось, что образование физиологически активных форм не только FVII (дающий FVIIa), но также других белков этого типа связано со сродством, в частности, Gla-домена упомянутых белков к связыванию иона кальция (Ca²⁺). Имеются указания, основанные на результатах, полученных для FVII (в виде FVIIa) (смотри рабочие примеры, представленные в описании), что минимизация образования белковых агрегатов, которые наблюдают при использовании некоторых типов материалов как материалов внутренней стенки в контейнерах, в контексте данного изобретения, может быть связана, вполне обратимым способом, со степенью, с которой материал внутренней стенки способен высвобождать определенные ионы металлов, особенно ионы определенных трехвалентных металлов и, возможно, ионы двухвалентных металлов, в раствор и что, как полагают, этот вывод можно экстраполировать на Gla-доменные белки в большей степени, чем на FVII.

Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, один аспект изобретения имеет отношение к применению материала, выбранного из следующего:

стекла, покрытого диоксидом кремния;

стекла, покрытого силиконом;

полимеров нециклических олефинов;

циклоолефиновых полимеров;

сополимеров циклоолефин/линейный олефин,

в виде материала внутренней стенки контейнера, который содержит (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть стеночного участка, и который содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксимасляной кислотой (Gla), с 9-12 Gla-остатками.

В других родственных аспектах изобретения представляют, по крайней мере, частично заполненный контейнер, имеющий в качестве материала внутренней стенки контейнера материал, выбранный из материалов, упомянутых непосредственно выше, где контейнер включает в себя (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть стеночного участка, и содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксимасляной кислотой (Gla), с 9-12 Gla-остатками.

Другие подробности, касающиеся аспектов и воплощений изобретения, описываются ниже.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Образование димеров/олигомеров в контейнерах, сделанных из различных материалов

Порции свежеприготовленной водной композиции rFVIIa (смотри ниже), имеющей рН 5,0 (корректировали добавлением небольших количеств 0,1 М, или 1 М HCl, или NaOH), хранили при 30°С в течение 12 недель в ампулах (контейнерах), сделанных из различных материалов, которые указаны в таблице 1, ниже. Композиция rFVIIa имела следующий состав:

rFVIIa 1 мг/мл хлорид кальция 1,47 мг/мл хлорид натрия 2,92 мг/мл глицилглицин 1,32 мг/мл гистидин 1,55 мг/мл ацетат натрия 0,82 мг/мл

Процентное содержание димер + олигомеры (выраженное как процент от исходного количества FVIIa в композиции) в нулевое время и через 2, 4, 8 и 12 недель, соответственно, определяли гельпроникающей высокоэффективной жидкостной хроматографией (ГП-ВЭЖХ), проводимой на колонке Waters Protein Pak™ 300 SW, 7,5Ч300 мм, используя 0,2 М сульфат аммония, рН 7,0, как подвижную фазу; скорость потока 0,5 мл/мин. Определение проводили по спектрофотометрическому поглощению при 215 нм. Результаты суммированы в таблице 1.

Из результатов очевидно, что образование димер + олигомеры rFVIIa в контейнерах из стекла типа I быстро снижалось, если контейнеры были промыты и прогреты (стерилизованы), но что наилучшие результаты были получены с ампулами из стекла типа I, покрытого диоксидом кремния, и ампулами из CZ™-смолы, что составило приблизительно в равной степени хорошие результаты в отношении минимизации образования димер/олигомер.

Таблица 1 Контейнер Т=0
% димер+
олигомер Т=2 неделям
30°С
% димер+
олигомер Т=4 неделям
30°С
% димер+
олигомер Т=8 неделям
30°С
% димер+
олигомер Т=12 неделям
30°С
% димер+
олигомер А 0,5 5,9 9,1 15,1 19,3 В 0,9 4,9 4,3 4,4 - С 0,5 1,9 2,3 2,7 2,7 D 1,1 1,9 2,4 2,7 2,8 А: необработанная стеклянная ампула, стекло типа I (боросиликатное стекло), Ph. Eur.
В: ампула из стекла типа I (Ph. Eur.), которое было промыто водой при 90°С, а затем нагрето до 300°С.
С: ампула из покрытого диоксидом кремния стекла типа I (Ph. Eur.), (Schott, тип I Plus™).
D: Пластмассовая ампула из смолы CZ™ (daikyo Seiko).

Пример 2. Образование димеров/олигомеров в картриджах

Порции свежеприготовленной водной композиции rFVIIa, имеющей такой же состав, как описано выше в примере 1, и аналогично приведенной к рН 5,0, хранили при 30°С в течение 12 недель в картриджах (контейнерах), сделанных из необработанного стекла типа I (боросиликатное стекло), Ph. Eur., и промытого, обработанного силиконом и термообработанного стекла типа I (боросиликатное стекло), Ph. Eur., соответственно. Процентное содержание димер + олигомеры определяли (как описано выше в примере 1) в нулевое время и через 2, 4 и 12 недель, соответственно. Результаты суммированы в таблице 2.

Результаты показывают, что обработанные силиконом и термообработанные картриджи оказались значительно лучше, чем необработанные картриджи в отношении минимизации образования димер/олигомер.

Таблица 2 Контейнер Димер + олигомеры (%) T=0 T=2 неделям T=4 неделям T=12 неделям A * 2,7 5,0 7,0 B 0,6 2,1 2,5 2,8 А: 1,5 мл картридж для шприц-ручек, сделанный из необработанного стекла типа I (боросиликатное стекло), Ph. Eur., и снабженный галоген-каучуковым поршнем, диаметр 7,2 мм (West Pharmaceutical Services, cat. No. 4002, который подвергали обработке силиконом Dow Corning Medical Fluid 369 и автоклавировали) и пластинчатой крышкой, которая пенетрируется иглой.
В: картридж, как в А, но промытый, обработанный 1% эмульсией силиконового масла, приготовленной из эмульсии силиконового масла Wacker E2 (приблизительно 35% силиконовое масло), а затем нагретый максимум при 330°С в течение максимум 5 часов; поршень и крышка такие, как в А.
* Достоверное значение не получено.

Пример 3. Образование димеров/олигомеров rFVIIa в присутствии добавленных ионов алюминия (Al³⁺)

Ион алюминия (в виде 100 мкМ водного раствора AlCl₃·6H₂O в деионизованной воде) добавляли (в двух различных конечных концентрациях) к порциям свежеприготовленной водной композиции rFVIIa, имеющей такой же состав, как описан в примере 1, выше, помещенным в ампулы, сделанные из смолы CZ™, и имеющим разные значения рН - от 4,0 до 6,0, скорректированные добавлением небольших аликвот раствора 0,1 М, или 1 М HCl, или NaOH. Ампулы хранили при 30°С.

Процентное содержание агрегатов димер + олигомер FVII определяли (как описано выше в примере 1) в нулевое время и через 1 и 2 недели, соответственно. Результаты суммированы в таблице 3, ниже, из которых очевидно, что процентное содержание димер + олигомеры rFVIIa увеличивалось со временем при увеличении добавленной конечной концентрации Al³⁺ при всех четырех тестируемых значениях рН.

Подробное описание изобретения

Как уже указано выше, первый аспект изобретения имеет отношение к применению материала, выбранного из следующего:

стекла, покрытого диоксидом кремния;

стекла, покрытого силиконом;

полимеров нециклических олефинов;

циклоолефиновых полимеров;

сополимеров циклоолефин/линейный олефин,

в качестве материала внутренней стенки в контейнере, который включает в себя (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не являющихся частью стеночного участка, и который содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 Gla-остатками.

В тесной связи с последним аспектом изобретения в следующем аспекте изобретения представляют, по крайней мере, частично заполненный контейнер, имеющий в качестве материала внутренней стенки контейнера материал, выбранный из упомянутых непосредственно выше материалов, контейнер, который включает в себя (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не являющихся частью стеночного участка, и который содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 Gla-остатками.

Как отмечено выше, предпочтительные материалы для внутренней стенки контейнера в контексте данного изобретения включают в себя различные сорта/типы стекла, на которое наносят покрытие из диоксида кремния (диоксид кремния, SiO₂); одним таким материалом, который очень хорошо подходит, является стекло «типа I» (которое описывают в Европейской фармакопее, Ph. Eur.), покрытое диоксидом кремния. Что касается описания и идентификационных тестов для стекла типа I и других типов фармацевтически подходящего стекла (типы I, II, III и IV), смотри, например, раздел 3.2.1. Ph.Eur. (4^th Edition).

Контейнеры из стекла типа I описывают в разделе 3.2.1. Ph.Eur. (4^th Edition).

Контейнеры из стекла типа I описывают в разделе 3.2.1. Ph.Eur. (4^th Edition, on line) следующим образом:

«Они представляют собой нейтральное стекло и имеют высокую гидролитическую резистентность вследствие химического состава самого стекла»,

нейтральное стекло описывают следующим образом:

«Нейтральное стекло является боросиликатным стеклом, содержащим значительные количества оксида бора, оксидов алюминия или щелочноземельных металлов. Благодаря его составу нейтральное стекло имеет высокую термостойкость и очень высокую гидролитическую устойчивость».

Покрытие из диоксида кремния на внутренней стенке контейнера данного типа имеет, по существу, однородную толщину, по крайней мере, приблизительно 0,05 мкм, хотя, как полагают, обычно более желательной является, по существу, однородная толщина в диапазоне приблизительно от 0,1 мкм до 0,2 мкм. Оказалось, что химическое осаждение с испарением (CVD) является способом, который очень хорошо подходит для нанесения такого достаточно однородного плотного покрытия из диоксида кремния на стеклянные поверхности, а контейнеры из стекла типа I (например, ампулы), имеющие покрытие из диоксида кремния, которое наносят по способу CVD на внутреннюю поверхность контейнера и которое очень подходит для применения в контексте изобретения, поставляются коммерчески, например контейнеры Schott Type I plus™ фирмы Schott Glaskontor, Mullheim/Baden, Germany.

Можно сделать ссылку, например, на следующую статью на WorldWideWed в отношении описания способов CVD: http://www.azom.com/details.asp?ArticleD=1552.

Как уже отмечено выше, другие предпочтительные материалы для внутренней стенки контейнера в контексте изобретения включают в себя различные сорта/типы стекла, которое покрывают силиконом, обычно после первоначального промывания или погружения в воду или другие водные среды, чтобы удалить выщелачиваемые водой вещества или разновидности. Как отмечалось ранее, предпочтительным типом стекла в этой связи является стекло типа I (Ph.Eur.).

Термин «силикон» широко используют в описании, чтобы указать не только на силиконы сами по себе, которые обычно представляют собой полимерные диалкилированные или моноалкилированные + моноарилированные силоксаны, но также на сополимеры, обычно блоксополимеры и привитые сополимеры, содержащие силиконовые сегменты и сегменты из других полимерных материалов, таких как полистиролы, полиолефины, полиамиды или полиуретаны.

Покрывающий материал соответственно может представлять собой масло поли(диалкилсилоксана) или сополимер, а подходящие типы поли(диалкилсилоксана) в этой связи включают в себя поли(диметилсилоксан) (PDMS), поли(дипропилсилоксан) и поли(дигексилсилоксан).

Вязкость масла, когда наносят на компоненты, может иметь важное значение, особенно для устранения феномена "скольжение-прилипание", который может возникать, например, если рассматриваемый контейнер представляет собой картридж или подобное устройство, содержащее перемещаемый поршень, используемый для удаления жидкости (белковая композиция) из контейнера. Большая вязкость уменьшает риск появления феномена "скольжение-прилипание", который препятствует ровному перемещению поршня. В одном воплощении изобретения покрытие содержит гидрофилизированное масло линейного или разветвленного поли(диалкилсилоксана). Вязкость масла при нанесении на компонент предпочтительно составляет свыше 200000 сантистокс, такая как свыше 500000 сантистокс.

В предпочтительных воплощениях силиконовое покрытие содержит поперечно-сшитое или гелеобразное силиконовое масло, такое как гидрофилизированное масло поли(диалкилсилоксана), или смесь поперечно-сшитого и несшитого масла. При использовании поперечно-сшитого или гелеобразного масла миграционная способность масла значительно снижается, а покрытие можно рассматривать как твердый материал.

Поперечно-сшитое или отвержденное силиконовое масло обычно получают, применяя масло силикона с линейной или разветвленной цепью с реакционно-способными функционализированными группами, которые используют для сшивания с покрытием на последующей стадии. Существует целый ряд различных подходящих способов сшивки, например отверждение облучением УФ-излучением, отверждение нагреванием при повышенной температуре и отверждение в присутствии воды. Сшитое силиконовое масло также можно получать, сначала используя масло силикона с прямой или разветвленной цепью, а затем облучая масло высокоэнергетическим источником излучения, например электронным источником, или источником рентгеновского излучения. Поперечно-сшитое силиконовое масло соответственно может быть маслом с чистотой, соответствующей медицинским целям, например MDX™, поставляемое Dow Corning (MDX4-4159 Fluid); другие подходящие типы масла включают в себя силиконовое масло Wacker E2, поставляемое в виде приблизительно 35% водной эмульсии.

В другом воплощении силиконовое покрытие содержит гидрофилизированные блок-сополимер и привитой сополимер поли(диалкилсилоксана). Сополимер может представлять собой любой блок-сополимер и привитой сополимер, который содержит полимерные сегменты поли(диалкилсилоксана), такие как PDMS. Полимерные сегменты, например, можно комбинировать с полимерными сегментами полистирола, полиолефинов, поламидов или полиуретана с образованием требуемого сополимера. Сополимер можно получать по любому подходящему известному способу, например последовательной анионной полимеризацией или различными способами привитой сополимеризации.

Гидрофильность силиконового покрытия может быть достигнута любым подходящим способом, например, подвергая покрытие окислительной обработке, такой как плазменная обработка или обработка коронным разрядом, после нанесения на стеклянную поверхность.

Гидрофильность также может быть достигнута посредством блокирования концевой группы сополимера гидрофильными группами или сегментами цепи. Гидрофильная группа, например, может быть отрицательно заряженной химической группой или группой фосфорилхолина (PC), а сегмент цепи, например, может представлять собой поли(оксид этилена) (PEO) или поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA).

Обработанные плазмой поверхности можно модифицировать, чтобы уменьшить белковую абсорбцию связыванием гидрофильных полимерных сегментов или функциональных групп. Эти полимерные сегменты или функциональные группы могут быть одного и того же вида, который описан выше, и, кроме того, могут быть связаны с функциональными группами, образованными во время плазменной обработки.

Толщина силиконового покрытия зависит от определенного покрытия и предпочтительно составляет от 0,005 до 10 мкм, более предпочтительно от 0,01 до 1 мкм. Оптимальная толщина зависит от размера, формы и типа контейнера и легко может быть установлена любым специалистом в данной области. В случае, например, картриджа с перемещаемым поршнем или частью плунжера, если покрытие оказывается слишком тонким, оно может отрываться при использовании, вследствие этого увеличивая трение между поршнем и стеночной частью. Когда толщина покрытия достигает определенного значения плато, сила трения становится приблизительно постоянной, даже если толщина еще увеличивается. Что касается состава любого покрытия, покрытие предпочтительно должно быть настолько тонким, насколько возможно, чтобы снизить стоимость. Такое тонкое покрытие соответственно может иметь толщину от 0,005 до 0,4 мкм, такую как от 0,015 до 0,25 мкм, более предпочтительно приблизительно 0,2 мкм.

В зависимости от миграционной способности силиконового покрытия гидрофильные группы при покрытии будут иметь тенденцию к поиску в покрытии уходящих поверхностных гидрофобных групп, обусловленных гидрофобностью окружающего воздуха. В случае контейнера, который должен быть заполнен жидкой водной композицией белка, содержащего Gla-домен, чтобы минимизировать любую тенденцию белка в его жидкой водной композиции абсорбировать во внутреннею поверхность контейнера, желательно, чтобы покрытие оставалось гидрофильным во время хранения до тех пор, пока жидкая белковая композиция не будет внесена в контейнер. Это довольно просто достигают заполнением контейнера белковой композицией вскоре после осуществления процесса покрытия.

Как показано выше, другие предпочтительные материалы для внутренней стенки контейнера в контексте данного изобретения включают в себя полимеры нециклических (то есть, с прямой или разветвленной цепью) олефинов, то есть, полиалкены. Из числа таких материалов подходящие полимеры, полученные из одиночного мономера, включают в себя полиэтилены и полипропилены, многочисленные виды которых являются частично кристаллическими по структуре. Сополимеры нециклических олефинов [например, сополимеры этилена (этена) и пропилена (пропена)] также представляют интерес как материалы для внутренней стенки в контексте изобретения.

Как также отмечено выше, другие предпочтительные материалы для внутренней стенки контейнера в контексте данного изобретения включают в себя полимеры циклоолефина, а их подходящие типы включают в себя полимеры, состоящие, по существу, на 100% из 5-7-членных алифатических циклических углеводородных колец. Подходящие коммерчески поставляемые контейнеры, сделанные из циклоолефинового полимерного материала, включают в себя контейнеры, приготовленные из смолы CZ™, поставляемые фирмой Daikyo Seiko Ltd., Tokyo, Japan. Другие подходящие полимерные материалы описанного типа включают в себя Zeonor™ и Zeonex™, оба от фирмы Nippon Zeon Co. Ltd., Tokyo, Japan.

Подходящие типы сополимеров циклоолефин/линейный олефин включают в себя материалы с аморфной структурой, такие как высокопрозрачные сополимеры типа Topas™ (поставляемые фирмой Ticona GmbH, Frankfurt am Main, Germany), которые доступны в виде целого ряда разновидностей (например, Topas™ 8007, Topas™ 5013, Topas™ 6013, Topas™ 6015, Topas™ 6017).

Другой аспект изобретения имеет отношение к применению твердофазного материала, который при инкубации, по крайней мере, в течение 24 часов при температуре, не превышающей 40°С, в контакте в водой или водным раствором, имеющим рН приблизительно от 3 до 8, высвобождает, в лучшем случае, приблизительно 3 мкМ иона трехвалентного металла в раствор; контейнер заключает в себе (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть стеночного участка, и который содержит препарат белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla) с 9-12 остатками Gla.

В тесной связи с описанным последним аспектом изобретения в еще одном аспекте изобретения представляют, по крайней мере, частично заполненный контейнер, имеющий в качестве материала внутренней стенки контейнера твердофазный материал, который при инкубации, по крайней мере, в течение 24 часов при температуре, не превышающей 40°С, в контакте с водой или водным раствором, имеющим рН приблизительно от 3 до 8, высвобождает, в лучшем случае, приблизительно 3 мкМ иона трехвалентного металла в раствор; контейнер заключает в себе (i) стеночный участок и (ii) одну или более перегородок, не составляющих часть стеночного участка, и содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), содержащий 9-12 остатков Gla.

Хотя полагают (как показано выше), что приемлемый верхний предел для высвобождаемого уровня/концентрации ионов трехвалентных металлов составляет приблизительно 3 мкМ (то есть, высвобождаемый уровень приблизительно ≤3 мкМ), высвобождаемый уровень, в лучшем случае, приблизительно 2,5 мкМ (то есть, приблизительно ≤2,5 мкМ), более желательно, самое большое приблизительно 1 мкМ (то есть, приблизительно ≤1 мкМ), такой уровень как, самое большое, приблизительно 0,5 мкМ (то есть приблизительно ≤0,5 мкМ), как оказалось, является благоприятным.

Относительно ионов трехвалентных металлов в контексте двух последних аспектов данного изобретения, оказалось, что высвобождение Al³⁺ является особенно нежелательным, Fe³⁺ представляет следующий пример иона трехвалентного металла, высвобождения которого в раствор следует избегать.

Кроме устранения высвобождения в раствор ионов трехвалентных металлов еще считают желательным избегать высвобождения в раствор некоторых ионов двухвалентных металлов, особенно Zn²⁺. В этой связи высвобождаемые уровни, вероятно, не должны превышать приблизительно 3 мкМ (то есть, высвобождаемый уровень приблизительно ≤3 мкМ), более предпочтительно, самое большое, приблизительно 1 мкМ (то есть, высвобождаемый уровень приблизительно ≤1 мкМ), такой как, самое большое, приблизительно 0,5 мкМ (то есть, приблизительно ≤0,5 мкМ).

С этой точки зрения следует упомянуть, что хотя покрытые стеклянные материалы, особенно стекло, покрытое диоксидом кремния (особенно покрытое диоксидом кремния стекло типа I), и покрытое силиконом стекло (особенно покрытое силиконом стекло типа I) рассматривают среди предпочтительных материалов для внутренней стенки в контексте различных аспектов изобретения, для того чтобы соответствовать изложенным выше критериям относительно высвобождения в раствор ионов трехвалентных или двухвалентных металлов, в некоторых воплощениях может оказаться достаточным применять стекло, особенно стекло типа I (Ph. Eur.), которое подвергали промыванию или экстракции, что снижает уровень экстрагируемых ионов трехвалентных и двухвалентных металлов, присутствующих в/на поверхности стекла. Такие обработки включают в себя погружение (экстракцию) в горячую (предпочтительно, по крайней мере, 90°С) воду или другие водные среды, например, раствор сульфата аммония, или обработку диоксидом серы.

Как уже отмечалось, белки, особенно подходящие в контексте данного изобретения, являются белками, содержащими домен с аминоконцевыми γ-карбоксиглутаминовыми кислотами (Gla), с 9-12 остатками Gla. Такие белки включают в себя так называемые «витамин К-зависимые зимогенные белки системы свертывания», примерами которых являются протромбин, фактор VII (FVII), фактор IX, фактор X и белок С. Оказалось, что Gla-домен таких белков вовлечен в связывание ионов кальция такими белками, и, как полагают, кальций-связанная форма является ответственной за опосредующую ассоциацию с фосфолипидными мембранами; относительно дальнейшей информации и подробного описания структуры, касающихся таких Gla-доменных белков, можно упомянуть, например, H.R. Roberts et al., “Molecular Biology and Biochemistry of the Coagulation Factors and Pathways of Hemostasis”, pp. 1409 et seq., Chapter 112, in Williams Hematology, 6^th edition (editors E. Beutler et al.), McGraw-Hill, 2001.

Gla-доменные белки рассматриваемого типа проявляют очень высокую степень гомологии аминокислотной последовательности из первых 42 остатков. В соответствии с H.R. Roberts (loc. cit) в настоящее время вообще полагают, что связывание Gla-содержащих белков - факторов свертывания, с липидными поверхностями опосредуется мембранной вставкой из гидрофобных остатков в первые десять аминокислот Gla-домена, и что ионы кальция являются существенными в этой связи, так как связывание Ca²⁺ остатками Gla индуцирует драматическое конформационное изменение, которое выставляет гидрофобные аминокислотные остатки в «бляшку» на поверхности белка; эта «бляшка» позволяет вставить белок в фосфолипидную мембрану.

К числу воплощений, касающихся применений и, по крайней мере, частично заполненных контейнеров согласно изобретению, относятся воплощения, в которых рассматриваемая белковая композиция содержит фактор VII (FVII) или его активированную форму (FVIIa). В важных воплощениях полипептид фактора VII, применяемый в соответствии с изобретением, представляет собой фактор VII человека, однако в других воплощениях фактор VII может быть фактором VII, например, крупного рогатого скота, свиньи, собаки, лошади, мыши и лосося. Рассматриваемый полипептид фактора VII можно получать из плазмы или рекомбинантным способом. Для применения для лечения человека используемый полипептид фактора VII предпочтительно представляет собой рекомбинантно полученный FVII человека (rhFVII) (смотри, например, патент США 4784950).

Следует понимать, что белки, содержащие Gla-домен, упоминаемые в контексте данного изобретения, включают в себя не только белки, имеющие (нативную) аминокислотную последовательность дикого типа (то есть, имеющие аминокислотную последовательность белка, содержащего Gla-домен, как она встречается естественным образом у человека или у других видов животных), но также включают в себя, например, варианты последовательностей таких белков, в которых один или более аминокислотных остатков замещены (заменены), утрачены или вставлены по сравнению с последовательностью дикого типа, но которые сохраняют Gla-домен из 9-12 остатков Gla.

В контексте данного изобретения термины «фактор VII», «полипептид фактора VII» и «полипептид, родственный фактору VII», которые применяют относительно человека, охватывает человеческий фактор VII дикого типа (то есть, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в патенте США № 4784950), а также варианты фактора VII человека, которые в активированной форме проявляют, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа. Термин «фактор VII» предназначен для широкого охвата полипептидов фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также тех полипептидов фактора VII, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием их соответствующих биоактивных форм, которые можно обозначать как фактор VIIa. Обычно фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с образованием фактора VIIa.

Полипептиды, родственные фактору VII, представляющие интерес в контексте данного изобретения, также охватывают полипептиды, включая варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa значительно модифицирована или снижена по сравнению с активностью фактора VIIa дикого типа. Упомянутые полипептиды, не ограничиваясь, включают в себя фактор VII или фактор VIIa, в аминокислотные последовательности которых внесены специальные изменения, которые модифицируют или разрушают биоактивность полипептида. К этой категории относятся модифицированные формы полипептидов FVII, в которых активный центр блокирован, как например, продукт, иногда называемый “ASIS” [фактор семь (человека) с блокированным активным центром], в котором FVII человека модифицирован посредством реакции с ингибитором сериновых протеаз в виде D-Phe-Phe-Arg-хлорметилкетона (смотри, например, WO 02/087605).

Биологическая активность фактора VII (в виде фактора VIIa) в свертывании крови обусловлена его способностью (i) связывать тканевый фактор (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора X с образованием активированных фактора IX или фактора X (фактор IXa или Xa, соответственно). Для целей изобретения биологическую активность фактора VIIa человека можно количественно определять оценкой способности препарата активировать свертывание крови, используя плазму, лишенную фактора VII, и тромбопластин, как описано, например, в патенте США № 5997864. В упомянутом исследовании биологическую активность выражают как снижение во времени свертывания относительно контрольного образца и превращают в «единицы фактора VII» по сравнению со стандартом смешанной сыворотки человека, содержащим 1 ед./мл активности фактора VII. Альтернативно, биологическую активность фактора VIIa можно количественно определять (i) оценкой способности фактора VIIa образовывать фактор Xa в системе, содержащей TF, включенный в липидную мембрану, и фактор X (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) оценкой гидролиза X в водной системе; (iii) оценкой его физического связывания с TF, используя прибор, основанный на поверхностном плазмоновом резонансе (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997) и (iv) оценкой гидролиза синтетического субстрата.

Варианты фактора VII, имеющие, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность относительно фактора VIIa дикого типа, охватывают варианты, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 25%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 50%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 75% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 90% удельной активности фактора VIIa, который продуцируется в таком же клеточном типе, когда тестируют в одном или более исследованиях свертывания, исследовании протеолиза или исследованиях связывания TF, которые описаны выше. Варианты фактора VII, проявляющие значительно сниженную биологическую активность относительно фактора VIIa дикого типа, представляют собой варианты, которые проявляют приблизительно менее 25%, предпочтительно приблизительно менее 10%, более предпочтительно приблизительно менее 5% и наиболее предпочтительно приблизительно менее 1% удельной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в том же самом клеточном типе, когда тестируют в одном или более исследованиях свертывания, исследовании протеолиза или исследованиях связывания TF, которые описаны выше. Варианты фактора VII, проявляющие значительно модифицированную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, не ограничиваясь, включают в себя варианты фактора VII, которые проявляют TF-независимую протеолитическую активность в отношении фактора X, и варианты, которые связывают TF, но не расщепляют фактор X.

Варианты фактора VII, или проявляющие, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность, чем фактор VII дикого типа, или, альтернативно, проявляющие значительно модифицированную или сниженную биоактивность относительно фактора VII дикого типа, не ограничиваясь, включают в себя полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа вставкой, делецией или замещением одной или более аминокислот.

Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII (FVII), проявляющие в активированной форме (FVIIa), по существу, такую же биологическую активность, как фактор VII дикого типа, включают в себя S52A-FVII, S60A-FVII, (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); варианты FVII, проявляющие повышенную протеолитическую стабильность, которая описана в патенте США 5580560; фактор VII, который протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VII (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); варианты FVII, описанные в PCT/DK02/00189; и варианты фактора VII, проявляющие повышенную протеолитическую стабильность, которая описана в WO 02/38162 (Scripps Research Institute); варианты FVII, содержащие модифицированный Gla-домен и проявляющие повышенную способность связывать мембрану, которые рассмотрены в WO 99/20767 (University of Minnesota); и варианты FVII, которые обсуждены в WO 01/58935 (Maxygen Aps).

Не ограничивающие примеры вариантов FVII, характеризующиеся в активированной форме (FVIIa) повышенной биологической активностью по сравнению с FVIIa дикого типа, включают в себя варианты FVII, которые рассмотрены в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635, в заявке на патент Дании РА 200201423, в заявке на патент Дании РА 200101627; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); и варианты FVII с повышенной активностью, которые описаны в JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

Не ограничивающие примеры вариантов фактора FVII, характеризующиеся в активированной форме (FVIIa) значительно сниженной или модифицированной биологической активностью относительно фактора VIIa дикого типа, включают в себя R152E-FVII (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVII (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVII (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) и фактор VII, не содержащий Gla-домен (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993).

Примеры соответствующих полипептидов фактора FVII человека или полипептидов, родственных фактору FVII, не ограничиваясь, включают в себя следующие, где (i) однобуквенное обозначение аминокислотного остатка непосредственно перед номером последовательности-положения указывает на аминокислотный остаток, присутствующий в таком положении в последовательности дикого типа, и однобуквенное обозначение аминокислотного остатка непосредственно после номера последовательности-положения указывает на аминокислотный остаток замещения; (ii) многочисленные аминокислотные замещения (замены) в том же самом полипептиде указаны посредством косой черты (“/”), разделяющей индивидуальные замещения; и (iii) “FVII” в следующем параграфе относится к человеческому фактору VII дикого типа.

Фактор VII дикого типа,

и FVII, имеющий замещения, присоединения или делеции в аминокислотной последовательности от 233Thr до 240Asn, а также FVII, имеющий замещения, присоединения или делеции в аминокислотной последовательности от 304Arg до 329Cys.

Вообще, соответствующие варианты последовательности FVII человека в контексте данного изобретения представляют собой варианты, в которых вплоть до 20, хотя предпочтительно не более 15 и более предпочтительно не более 10 (например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1) аминокислотных остатков замещены, делетированы или введены по сравнению с аминокислотной последовательностью человеческого фактора FVII дикого типа, как описано в патенте США № 4784950).

Контейнер, используемый в контексте изобретения, может быть любого типа, который совместим с требованиями изобретения относительно природы материала внутренней стенки и который удобен для применения в связи с введением определенных доз композиции Gla-доменного белка, содержащегося в ней, субъекту или пациенту при необходимости такого введения. Подходящие типы контейнера, особенно если рассматриваемый белок вводят посредством инъекции жидкости, включают в себя ампулы, пузырьки, картриджи и тому подобные, имеющие закрывающую перегородку или изолирующие средства, включающие в себя самозакрывающуюся эластомерную перегородку или мембрану, которую можно пенетрировать иглой шприца. Контейнер типа картриджа может соответственно дополнительно содержать перемещаемые поршневые средства (например, плунжер или тому подобное, обычно сделанные из эластомерного материала), посредством которого жидкость, присутствующую в нем, можно удалять из контейнера или затягивать в контейнер. Контейнер типа картриджа особенно подходит для применения вместе с инъекционными устройствами типа шприц-карандаша, например, подходящие типы таких устройств включают в себя шприц-карандаши типов FlexPen™, NovoLet™ и NovoPen™ (все от Novo Nordisk A/S, Denmark).

Другие применяемые типы контейнеров включают в себя гибкие пакеты, мешки, баллон-упаковки, баллоны и тому подобные, которые содержат гибкий материал внутренней стенки (который упомянут в контексте изобретения), например полипропилен или полиэтилен, и из которого жидкость, присутствующую в нем, можно удалять, применяя давление. Такие гибкие контейнеры соответственно могут быть снабжены герметичной камерой в виде соответствующей сборки (устройства) типа шприц-"луер", сборки с нарезкой или другой сборки известного типа для прикрепления иглы шприца, и, например, сборка с прикрепленной иглой может соответственно содержать разрываемую мембрану или перегородку, такую как эластомерная мембрана или перегородка, которая до применения функционирует как изоляция, чтобы сохранить целостность контейнера с жидким содержимым, но которую при применении, например, можно разорвать при использовании умеренно высокого давления на контейнер или пенетрировать мембрану с помощью простирающейся внутрь части иглы шприца соответствующей конструкции, такой как игла шприца, снабженная коническим колпачком, нанизываемым колпачком или тому подобным, через который инъекционная игла, по существу, проникает внутрь (то есть, в контейнер) и вне (то есть, из контейнера), например, игла шприца часто применяемого типа вместе с инъекционным устройством карандашного типа, которое сконструировано так, чтобы использовать контейнер типа картриджа, имеющего пенетрируемую иглой перегородку или мембрану.

Те части закрывающей камеры(р) контейнера (пробка, эластомерная перегородка, поршень, устройство с прикрепленной иглой или тому подобные), которые способны находиться в длительном контакте с жидкой водной белковой композицией, содержащейся в контейнере, предпочтительно также должны соответствовать одному или более критериям, изложенным выше для частей внутренней стенки контейнера в контексте изобретения. Определенные типы материалов (например, силиконовые резины/эластомеры и тому подобное) часто удовлетворяют этим требованиям без необходимости любой дальнейшей обработки, тогда как некоторые другие материалы (например, некоторые типы резины, такой как бромбутиловая резина, обычно используемая для инъекционных мембран, перегородок, пробок, поршня и тому подобного) могут требовать надлежащей обработки поверхности, соответственно посредством силиконовой обработки поверхности, как описано выше. Специалист в данной области сможет оценить на основании данных производителя и/или простых тестов, какая степень обработки поверхности может потребоваться, чтобы соответствовать критериям, изложенным в описании, особенно относительно степени, с которой наружные необработанные закрывающие материалы сами по себе способны высвобождать нежелательные ионы металлов в раствор.

Как уже отмечалось до некоторой степени выше, белковая композиция, содержащаяся в контейнере, в контексте данного изобретения может быть жидкой водной композицией. Что касается белков рассматриваемого типа (белки, содержащие Gla-домен), рН такого водного препарата вообще находится в области приблизительно от 3 до 8, хотя обычно в области приблизительно от 4 до 7. В случае FVII или FVIIa, особенно FVII или FVIIa человека [которые в важных воплощениях водных препаратов в контексте изобретения представляют собой рекомбинантно полученные человеческие FVII (rhFVII) или FVIIa (rhFVIIa)], оказалось, что значение рН в области приблизительно от 5 до 7, такой как область приблизительно от 5,5 до 6,5 или область приблизительно от 6,0 до 6,5, является наиболее благоприятным.

Кроме обсуждаемых выше водных жидких композиций белковые композиции, по существу, в виде твердой фазы, например, лиофилизированного твердого препарата, который содержит представляющий интерес белок и который предназначают для растворения/восстановления в воде или жидких средах (носителе, наполнителе) перед применением, продолжают составлять важные воплощения в контексте изобретения. Таким образом, например, NovoSeven™ (rhFVIIa; Novo Nordisk A/S), как уже упоминалось выше, в настоящее время применяют в виде лиофилизированного (высушенного вымораживанием) препарата в ампулах, снабженных эластомерной перегородкой и содержащих rhFVIIa, NaCl, CaCl₂·2H₂O, глицилглицин, полисорбат™ 80 и маннит, и предназначенного для восстановления перед применением (то есть, перед введением пациенту) с использованием стерильной воды для инъекции (WFI). В этой связи, чтобы содействовать максимальному увеличению сохранения активности FVIIa в полученном восстановленном водном растворе FVIIa во время периода его годности к употреблению, из обсуждения выше стало понятно, что материал внутренней стенки контейнера, в котором объем воды (или другого водного наполнителя), в которой лиофилизированный белковый препарат (композицию) следует растворять (после введения требуемого объема воды или наполнителя в ампулу, содержащую лиофилизированный препарат), предпочтительно также должен быть материалом, который удовлетворяет одному или более критериям, изложенным в описании (выше) в контексте изобретения.

Следующие аспекты изобретения, таким образом, имеют отношение к

(1) применению материала (твердофазного материала) одного из типов, уже рассмотренных выше, в качестве материала внутренней стенки в контейнере (таком как ампула), который содержит (i) стеночный участок и (ii) закрывающую перегородку (например, содержащий эластомерную перегородку), не составляющую часть стеночного участка, и который содержит воду (например, стерильную воду для инъекции) или другой водный наполнитель;

и также

(2) по крайней мере частично заполненному контейнеру, имеющему в качестве материала внутренней стенки контейнера материал одного из типов, уже рассмотренных выше, контейнеру, который включает в себя (i) стеночный участок и (ii) закрывающую перегородку (например, содержащий эластомерную перегородку), не составляющую часть стеночного участка, и который содержит воду (например, стерильную воду для инъекции) или другой водный наполнитель.

Еще один аспект изобретения имеет отношение к медицинскому набору, включающему в себя (а) частично заполненный контейнер одного из рассмотренных выше типов, который содержит твердую композицию белка обсуждаемого в описании типа, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 Gla-остатками [например, rhFVII, rhFVIIa или “ASIS” (смотри выше)], где указанная композиция предназначена для растворения в воде или в водном носителе перед применением, и (b) частично заполненный контейнер одного из описанных типов, который содержит воду (например, стерильную воду для инъекции) или другой водный носитель, подходящий для растворения/восстановления указанной твердой композиции перед применением.

Относительно всех аспектов изобретения, рассматриваемых в описании, для того чтобы максимально увеличить белковую стабилизацию, достигаемую при использовании материала одного из специальных типов в качестве материала внутренней стенки в контейнере в контексте изобретения, несомненно является желательным, чтобы рассматриваемый материал покрывал, по существу, всю (то есть, по существу, 100%) область внутренней поверхности стеночной части контейнера [не считая области внутренней поверхности закрывающей части(ей) контейнера]. Меньшая степень охвата внутренней стенки контейнера, например, 80% или меньше области внутренней поверхности, однако, может быть приемлемой в зависимости от природы другого материала(ов), который находится в контакте с белковой композицией или с восстанавливающей жидкостью (водой или водным носителем), содержащейся в контейнере.

Фармацевтическая композиция и введение белков, содержащих Gla-домен

Вообще, жидкую водную композицию (водную фармацевтическую композицию) препарата Gla-доменного белка, содержащуюся в частично заполненном контейнере согласно изобретению, независимо от того, присутствует ли водная композиция в жидкой водной форме с начала или образуется при растворении/восстановлении, по существу, твердой композиции (например, лиофилизированного препарата) при добавлении воды или другого водного носителя или растворителя, преимущественно будут вводить парентерально, то есть внутривенно, подкожно или внутримышечно, или с помощью продолжительного или ударного вливания.

На более узком уровне, в случае полипептидов фактора VII и субъектов (человека), композиции для парентерального введения обычно включают в себя полипептид фактора VII в комбинации с фармацевтически подходящим водным носителем, предпочтительно растворенный в таком носителе. Можно использовать целый ряд водных носителей, таких как вода, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и тому подобные. Полипептиды фактора VII в контексте изобретения также могут быть приготовлены в виде липосомных препаратов для доставки и направления в участки повреждения. Липосомные препараты, в основном, описаны, например, в патентах США 4837028, 4501728 и 4975282. Композиции можно стерилизовать обычными хорошо известными способами стерилизации. Полученные водные растворы можно упаковывать как таковые для применения или их можно фильтровать при асептических условиях и лиофилизировать, лиофилизированный препарат комбинируют со стерильной водой или стерильным водным раствором (носителем, растворителем) перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически подходящие вспомогательные вещества, когда требуется приблизить к физиологическим условиям и/или повысить химическую и/или физическую стабильность композиции. Названные вещества включают в себя:

реагенты, корректирующие рН и/или буферные реагенты, например цитрат (натрия или калия), ацетат (аммония, натрия или кальция), гистидин (L-гистидин), малат, фосфат (натрия или калия), винная кислота, янтарная кислота, MES (2-N-морфолино-этансульфоновая кислота), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота) имидазол, TRIS[трис-(гидроксиметил)аминометан], лактат и глутамат. Область концентрации буфера выбирают, чтобы поддерживать предпочтительное значение рН раствора. Буферный реагент также может быть смесью двух или более буферных реагентов, например смесью двух таких реагентов, смесь которых способна обеспечить значение рН в определенной области. В одном воплощении буфер представляет собой смесь цитрата и, по крайней мере, одного из буферов: ацетата (аммония, натрия или кальция), гистидина (L-гистидин), малата, фосфата (натрия или калия), винной кислоты, янтарной кислоты, MES, HEPES, имидазола, триса, лактата и глутамата. Общая концентрация буферного реагента(ов) обычно соответствует области приблизительно от 1 мМ до 100 мМ, такой как приблизительно от 1 мМ до 50 мМ, часто приблизительно от 1 мМ до 25 мМ, например, приблизительно от 2 мМ до 20 мМ;

соли кальция: композиции, или в жидкой, высушенной вымораживанием, или восстановленной форме, могут необязательно содержать соль кальция. Соль кальция может присутствовать в низкой концентрации, например, такой как приблизительно от 0,1 мМ до 5 мМ; она может присутствовать в средней концентрации, например, такой как приблизительно от 5 мМ до 15 мМ; или она может присутствовать в более высокой концентрации, например, такой как приблизительно от 15 мМ до 1000 мМ. В одном аспекте соль кальция выбирают из: хлорида кальция, ацетата кальция, глюконата кальция и левулата кальция и смесей двух или более солей. Альтернативно, концентрация ионов кальция в композиции может быть ниже 0,1 мМ, а концентрацию ионов кальция можно активно снизить, например, методом ионного обмена, диафильтрации или другим подобным способом.

В другом аспекте молярное отношение несвязанных ионов кальция (Ca²⁺) к полипептиду фактора VII является ниже 0,5, например в области 0,001-0,499, такой как 0,005-0,050, или в области 0,000-0,499, такой как в области 0,000-0,050 или приблизительно 0,000. Для достижения такого низкого молярного соотношения между ионами кальция (Ca²⁺) и полипептидом фактора VII может оказаться необходимым или желательным добавить хелат кальция, чтобы связать (образовать комплекс) избыток ионов кальция. Это особенно уместно, когда соотношение между ионами кальция и полипептидом фактора VII в растворе, полученном на стадии процесса, предшествующей стадии приготовления препарата, превышает порог, указанный выше. Примеры «хелатов кальция», не ограничиваясь, включают в себя: этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и ее соли; соли ди- или трикарбоновых кислот, например соли лимонной, винной, глутаровой, яблочной, малеиновой или янтарной кислоты; нитрилотриуксусную кислоту (NTA) и DTPA; молочную кислоту и ее соли; и HIMDA, ADA и подобные соединения.

Следует отметить, что кроме имеющихся хелатирующих свойств, большинство из последних упомянутых веществ подходят как буферные реагенты (смотри выше) в контексте изобретения. В этой связи можно еще упомянуть, что введение в некоторые композиции буферных/комплексобразующих реагентов, которые связывают более прочно определенные дестабилизирующие ионы металлов (например, ионы алюминия), чем ионы кальция (в частности), может быть благоприятным в некоторых ситуациях;

реагенты, корректирующие тоничность, (модифицирующие тоничность вещества, которые вносят вклад в осмотическое давление препарата), например аминокислоты, небольшие пептиды (например, содержащие от 2 до 5 аминокислотных остатков), нейтральные соли, моно- или дисахариды, полисахариды, сахарные спирты или смеси, по крайней мере, двух таких веществ. Специальные примеры, не ограничиваясь, включают в себя хлорид натрия, хлорид калия, цитрат натрия, сахарозу, глюкозу и маннит. Концентрацию корректирующего тоничность реагента приводят близко к изотоничности в зависимости от других ингредиентов, присутствующих в препарате. Вообще, корректирующие тоничность реагенты вводят в концентрации приблизительно от 1 до 500 мМ, такой как приблизительно от 1 до 300 мМ, часто приблизительно от 10 до 200 мМ, например, приблизительно от 20 до 150 мМ в зависимости от других присутствующих ингредиентов. Можно применять нейтральные соли, например, такие как хлорид натрия или хлорид калия. Термин «нейтральная соль» означает соль, которая, по существу, является ни кислой, ни основной, то есть, оказывает незначительное влияние или не оказывает никакого влияния на рН препарата при растворении;

поверхностно-активные вещества, обычно неионные поверхностно-активные вещества, включают в себя вещества типа полисорбата или твина™ (например, полисорбат™ 20 или 80, или твин™ 80) или типа полоксамера или плуроника™ (например, полоксамер™ 188 или 407). Количество включенного поверхностно-активного вещества обычно может колебаться приблизительно от 0,005 до 1% мас./мас., обычно более предпочтительны количества приблизительно от 0,005 до 0,1% мас./мас., такие как приблизительно от 0,005 до 0,02% мас./мас. В некоторых ситуациях относительно высокие концентрации, например, вплоть до 0,5% мас./мас. являются желательными для поддержания стабильности белка. Однако уровни обычно используемого поверхностно-активного вещества ограничены клинической практикой;

антиоксиданты, например аскорбиновая кислота, цистеин, гомоцистеин, цистин, цистатионин, метионин, глутатион или пептиды, содержащие цистеин или метионин; метионин, в частности L-метионин, обычно является очень подходящим антиоксидантом. Антиоксидант обычно вводят в концентрации приблизительно от 0,1 до 2 мг/мл;

консерванты (включают в препарат, чтобы задержать рост микробов, вследствие чего становится возможным, например, «многократное применение» упаковки полипептида фактора VII), включают в себя, например, фенол, бензиловый спирт, орто-крезол, мета-крезол, пара-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид бензалкония или хлорид бензетония.

Концентрация полипептида фактора VII в препаратах может широко варьировать, обычно приблизительно от 0,01% мас./мас. до 2% мас./мас. (то есть приблизительно от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл), такая как приблизительно от 0,05% мас./мас. до 1,5% мас./мас. (то есть, приблизительно от 0,5 мг/мл до 15 мг/мл) например, приблизительно от 0,05% мас./мас. до 1% мас./мас. (то есть, приблизительно от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл), и выбирают, главным образом, на основании объемов жидкости, вязкости и так далее в соответствии с определенным выбранным способом введения. В случае фактора VIIa концентрацию часто представляют как мг/мл или как международные единицы/мл (Ед/мл). 1 мг FVIIa обычно соответствует 43000-56000 Ед или более.

Способы получения парентерально вводимых композиций станут известными или очевидными специалистам в данной области, и они описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Для лечения в связи с преднамеренными вмешательствами (например, хирургическими манипуляциями) полипептиды фактора VII обычно вводят в пределах периода приблизительно 24 часов до проведения вмешательства и в течение до 7 дней или более после вмешательства. Введение в качестве антикоагулянта можно проводить согласно целому ряду способов, которые обсуждаются в описании. Доза полипептида фактора VII обычно колеблется приблизительно от 0,05 мг/день до 500 мг/день, предпочтительно приблизительно от 1 мг/день до 200 мг/день и более предпочтительно приблизительно от 10 мг/день до 175 мг/день для субъекта 70 кг в виде ударной и поддерживающей доз в зависимости от веса субъекта и тяжести состояния.

Композиции, содержащие полипептиды фактора VII, можно вводить для профилактического и/или терапевтического лечения. При терапевтическом применении композиции вводят субъекту, уже страдающему от заболевания, как описано выше, в количестве, достаточном, чтобы лечить, смягчить или частично остановить заболевание и его осложнения. Количество, адекватное для достижения этого, определяют как «терапевтически эффективное количество». Как станет понятно специалисту в данной области, количество, эффективное для этой цели, будет зависеть от тяжести состояния или повреждения, а также от веса тела и от общего физического состояния субъекта.

Следует иметь в виду, что фармацевтические композиции полипептидов фактора VII (например, rhFVIIa) обычно применяют в связи с угрожающими жизни или возможно угрожающими жизни заболеваниями или состояниями и что при таких обстоятельствах - ввиду главных преимуществ, связанных с минимизирующими количествами посторонних веществ, и учитывая общее отсутствие иммуногенности полипептидов фактора VII человека - оказывается возможным и может рассматриваться лечащим врачом как желательное назначение значительного избытка рассматриваемого полипептида фактора VII.

При профилактическом применении композиции, содержащие полипептид фактора VII, вводят субъекту, восприимчивому к или, иначе говоря, с повышенным риском патологического состояния, чтобы повысить собственную коагулирующую способность субъекта. Дозировка, применяемая для такой цели (которую можно называть «профилактически эффективная доза»), также зависит от веса тела субъекта и общего состояния здоровья и обычно составляет приблизительно от 1,0 мг/день до 200 мг/день для субъекта весом 70 килограммов.

В случае, в особенности, введения rhFVIIa человеку, уровни доз обычно соответствуют области приблизительно 90-120 мкг/кг веса тела на дозу. Однако существует общепринятое предпочтение относительно до некоторой степени более высоких доз, например, дозы свыше 150 мкг/кг веса тела и, в некоторых случаях, дозы приблизительно 250-300 мкг/кг.

Однократное или многократное введение рассматриваемого препарата можно проводить, используя уровни доз и схемы приема лекарственного средства, выбранные лечащим врачом. Для амбулаторных пациентов, нуждающихся в ежедневных поддерживающих дозах, полипептид фактора VII можно вводить посредством продолжительного вливания, например, используя портативную насосную систему.

Местное введение полипептида фактора VII, например местные аппликации, можно осуществлять, например, распылением, перфузией, применением двойных баллонных катетеров или стента, введением в сосудистые имплантаты или стенты, в виде гидрогелей для покрытия баллонных катетеров или другими хорошо известными способами. В любом случае, рассматриваемая фармацевтическая композиция должна обеспечить количество полипептида фактора VII, которое является адекватным, чтобы эффективно лечить субъекта.

Материал, выбранный из группы, состоящей из стекла, покрытого диоксидом кремния, стекла, покрытого силиконом, используют в качестве материала внутренней стенки контейнера, который включает (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть названного стеночного участка, и который содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 остатками Gla, где указанный материал снижает склонность указанного белка подвергаться ди-, олиго- и/или полимеризации. Технический результат - улучшение стабильности водных композиций - стабильности фактора VIIa (FVIIa) в водных растворах, что важно для содержания и временного хранения жидкой композиции белка, особенно водной композиции белка. 4 н. и 34 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Применение материала, выбранного из группы, состоящей из
стекла, покрытого диоксидом кремния,
стекла, покрытого силиконом,
в качестве материала внутренней стенки контейнера, который включает (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть названного стеночного участка, и который содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 остатками Gla; где указанный материал снижает склонность указанного белка подвергаться ди-, олиго- и/или полимеризации.

2. Применение по п.1, где указанный белок представляет собой витамин К-зависимый зимогенный белок системы свертывания или его активированную форму.

3. Применение по п.2, где указанный витамин К-зависимый зимогенный белок системы свертывания выбирают из группы, состоящей из протромбина, фактора VII (FVII), фактора IX (FIX), фактора Х (FX) и белка С.

4. Применение по п.3, где указанная композиция содержит фактор VII (FVII) или активированный фактор VII (FVIIa).

5. Применение по п.4, где указанный FVII представляет собой рекомбинантный FVII человека (rhFVII).

6. Применение по п.1, где указанный белок представляет собой полипептид, родственный FVII, или его активированную форму.

7. Применение по п.1, где указанный контейнер представляет собой ампулу или картридж, содержащий перегородку, которая включает в себя пенетрируемую иглой, самозакрывающуюся эластомерную перегородку.

8. Применение по п.7, где указанный контейнер представляет собой картридж, дополнительно содержащий перемещаемые поршневые устройства, с помощью которых жидкость, присутствующую в указанном контейнере, можно удалять из указанного контейнера.

9. Применение по п.1, где указанный материал внутренней стенки контейнера представляет собой стекло типа I no Ph.Eur., покрытое диоксидом кремния (SiO₂).

10. Применение по п.9, где указанное покрытое диоксидом кремния стекло имеет поверхностный слой, по существу, из чистого SiO₂ толщиной в диапазоне от приблизительно 0,1 мкм до приблизительно 0,2 мкм.

11. Применение по п.9 или 10, где указанный слой SiO₂ представляет собой слой, нанесенный с помощью способа химического осаждения с испарением (CVD).

12. Применение по п.1, где указанная композиция представляет собой жидкую водную композицию.

13. Применение по п.12, где указанная водная композиция имеет значение рН в области от приблизительно 3 до приблизительно 8.

14. Применение по п.12, где указанная жидкая водная композиция содержит rhFVIIa и имеет значение рН в области от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5.

15. Применение по п.1, где указанная композиция представляет собой, по существу, твердую композицию, предназначенную для растворения в воде или водном носителе перед применением.

16. Применение по п.1, где указанный материал внутренней стенки покрывает, по существу, 100% области внутренней поверхности указанного стеночного участка.

17. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, который имеет в качестве материала внутренней стенки контейнера стекло, покрытое диоксидом кремния, где указанный контейнер включает (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть указанного стеночного участка, и содержит композицию белка, имеющего домен с аминоконцевой γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), с 9-12 остатками Gla, где указанный материал снижает склонность указанного белка подвергаться ди-, олиго- и/или полимеризации.

18. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанный белок представляет собой витамин К-зависимый зимогенный белок системы свертывания или его активированную форму.

19. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.18, где указанный витамин К-зависимый зимогенный белок системы свертывания выбирают из группы, состоящей из протромбина, фактора VII (FVII), фактора IX (FIX), фактора Х (FX) и белка С.

20. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.19, где указанная композиция содержит фактор VII (FVII) или активированный фактор VII (FVIIa).

21. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.20, где указанный FVII представляет собой рекомбинантный FVII человека (rhFVII).

22. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанный белок представляет собой полипептид, родственный фактору FVII, или его активированную форму.

23. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанный контейнер представляет собой ампулу или картридж, содержащий перегородку, которая включает в себя пенетрируемую иглой, самозакрывающуюся эластомерную перегородку.

24. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.23, где указанный контейнер представляет собой картридж, дополнительно содержащий перемещаемые поршневые средства, с помощью которых жидкость, присутствующую в указанном контейнере, можно удалять из указанного контейнера.

25. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанный материал внутренней стенки контейнера представляет собой стекло типа I no Ph. EUR., покрытое диоксидом кремния (SiO₂).

26. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.25, где указанное покрытое диоксидом кремния стекло имеет поверхностный слой, по существу, из чистого SiO₂ толщиной в диапазоне от приблизительно 0,1 мкм до приблизительно 0,2 мкм.

27. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.25 или 26, где указанный слой SiO₂ представляет собой слой, нанесенный способом химического осаждения с испарением (CVD).

28. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанная композиция представляет собой жидкую водную композицию.

29. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.28, где указанная водная композиция имеет значение рН в области от приблизительно 3 до приблизительно 8.

30. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.28, где указанная жидкая водная композиция содержит rhFVIIa и имеет значение рН в области от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5.

31. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанная композиция представляет собой, по существу, твердую композицию, предназначенную для растворения в воде или водном носителе перед применением.

32. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.17, где указанный материал внутренней стенки покрывает, по существу, 100% области внутренней поверхности указанного стеночного участка.

33. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, который имеет в качестве материала внутренней стенки контейнера стекло типа I по Ph.EUR., покрытое диоксидом кремния (SiO₂), где материал внутренней стенки контейнера имеет поверхностный слой, по существу, чистого SiO₂ толщиной в диапазоне от приблизительно 0,1 мкм до приблизительно 0,2 мкм, где указанный контейнер включает (i) стеночный участок и (ii) одну или более закрывающих перегородок, не составляющих часть указанного стеночного участка, и содержит воду или другой водный носитель.

34. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.33, где указанный контейнер представляет собой ампулу или картридж, содержащий перегородку, которая включает в себя пенетрируемую иглой, самозакрывающуюся эластомерную перегородку.

35. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.34, где указанный контейнер представляет собой ампулу.

36. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.33, где указанный слой SiO₂ представляет собой слой, нанесенный способом химического осаждения с испарением (CVD).

37. Контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.33, где указанный материал внутренней стенки покрывает, по существу, 100% области внутренней поверхности упомянутого стеночного участка.

38. Медицинский набор, содержащий контейнер, заполненный по крайней мере частично, по п.31 вместе с контейнером, заполненным по крайней мере частично, по любому из пп.33-37.