ПОЛИПЕПТИД ФАКТОРА КОАГУЛЯЦИИ VII ЧЕЛОВЕКА, ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2008 года по МПК C07K14/745 C12N9/64 C12N15/12 A61K38/48 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым полипептидам фактора коагуляции VIIa, имеющим коагуляционную активность, а также к полинуклеотидным конструкциям, кодирующим такие пептиды, векторам и клеткам-хозяевам, включающим и экспрессирующим полинуклеотид, фармацевтическим композициям, применению и способам лечения.

Известный уровень техники

Свертывание крови представляет собой процесс, включающий сложное взаимодействие различных компонентов (или факторов) крови, который в конечном итоге ведет к формированию сгустка фибрина. Обычно компоненты крови, которые участвуют в процессе, который обозначается как «каскад» свертывания, являются ферментативно неактивными белками (проферментами или зимогенами), которые превращаются в протеолитические ферменты под действием активатора (который сам является активированным фактором свертывания). Факторы коагуляции, которые подверглись такому превращению, обычно обозначаются как «активные факторы» и обозначаются с помощью добавления буквы «а» к названию фактора коагуляции (например, фактор VIIa).

Инициация процесса гемостаза опосредуется образованием комплекса между тканевым фактором, экспонированным на сосудистой стенке в результате повреждения, и фактором VIIa. Данный комплекс затем индуцирует превращение факторов IX и Х в их активные формы. Фактор Ха индуцирует превращение ограниченных количеств протромбина в тромбин на клетке, несущей тканевой фактор. Тромбин активирует тромбоциты и факторы V и VIII в факторы Va и VIIIa, оба являющиеся кофакторами в дальнейшем процессе, ведущем к полному выбросу тромбина. Данный процесс включает образование фактора Ха под действием фактора IXa (в комплексе с фактором VIIIa) и осуществляется на поверхности активированных тромбоцитов. Тромбин на конечном этапе превращает фибриноген в фибрин, что ведет к образованию сгустка фибрина. В последнее время обнаружено, что фактор VII и тканевой фактор являются главными инициаторами свертывания крови.

Фактор VII является гликопротеином плазмы, присутствующим в следовых количествах, который циркулирует в крови в виде одноцепочечного зимогена. Зимоген каталитически неактивен. Одноцепочечный фактор VII может быть превращен в двухцепочечный фактор VIIa под действием фактора Ха, фактора XIIa, фактора IXa, фактора VIIa или тромбина in vitro. Считается, что фактор Ха является главным физиологическим активатором фактора VII. Как и в случае некоторых других белков плазмы, вовлеченных в гемостаз, активность фактора VII зависит от витамина К, который требуется для гамма-карбоксилирования множественных остатков глутаминовой кислоты, которые кластеризуются в непосредственной близости от аминоконца белка. Данные гамма-карбоксилированные глутаминовые кислоты требуются для индуцируемого ионами металла взаимодействия фактора VII с фосфолипидами. Превращение зимогена фактора VII в активированную двухцепочечную молекулу осуществляется в результате разрыва внутренней пептидной связи Arg₁₅₂-Ile₁₅₃. В присутствии тканевого фактора, фосфолипидов и ионов кальция двухцепочечный фактор VIIa быстро активирует фактор Х или фактор IX в результате ограниченного протеолиза.

Часто является желательным стимулировать или улучшить каскад свертывания у субъекта. Фактор VIIa применяли для контролирования нарушений свертывания, которые обусловлены несколькими причинами, такими как недостаточность факторов свертывания (например, гемофилия А и В или недостаточность факторов коагуляции факторов XI или VII) или ингибиторов факторов свертывания. Фактор VIIa применяли также для контролирования избыточного кровотечения, наступающего у субъектов с нормально функционирующим каскадом свертывания крови (в отсутствие недостаточности факторов свертывания или ингибиторов любого из факторов коагуляции). Такое кровотечение может быть вызвано, например, нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. Кровотечение является также основной проблемой в связи с хирургическими вмешательствами и другими формами повреждения тканей.

Европейский патент No. 200421 (ZymoGenetics) относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор VII человека, и к рекомбинантной экспрессии фактора VII в клетках млекопитающих.

Работа Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) относится к варианту фактора VII, в котором Leu305 заменен на Ala (FVII(Ala305)).

Работа Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474) относится к вариантам фактора VIIa, в которых остатки 316-320 удалены или остатки 311-322 заменены на соответствующие остатки трипсина.

Существует потребность в вариантах фактора VIIa, обладающих коагуляторной активностью, в вариантах с высокой активностью, которые могут быть введены в относительно низких дозах, и в вариантах, которые не вызывают нежелательных побочных эффектов, таких как системная активация системы свертывания и кровотечения, соответственно, связанных с общепринятыми способами лечения.

Описание изобретения

В настоящее время обнаружено, что полипептидные варианты фактора коагуляции VIIa человека, в которых аминокислота Leu305 и, по меньшей мере, одна аминокислота, независимо выбранная из группы, состоящей из Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Va1158, Glu296 и Met298 SEQ ID NO:1, заменены отличными аминокислотами, обладают повышенной коагуляторной активностью по сравнению с диким типом фактора коагуляции VIIa человека.

Применяемый здесь термин «отличная аминокислота» обозначает одну аминокислоту, которая отличается от той аминокислоты, которая присутствует в данном положении в природном белке. Это охватывает, но не ограничивается этим, аминокислоты, которые могут кодироваться полинуклеотидом. Предпочтительно отличная аминокислота является природной L-формой и может кодироваться полинуклеотидом. Конкретным примером является L-цистеин (Cys).

Применяемый здесь термин «активность» обозначает способность полипептида фактора VII превращать свой субстрат, фактор X, в активный фактор Ха. Активность полипептида фактора VII может быть измерена с помощью «Анализа протеолиза in vitro» (смотри пример 6).

Термин «собственная активность» также включает способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Leu305 расположен на конце α-спирали, найденной в форме фактора VIIa, связанной с тканевым фактором, которая, как считается, важна для его активности. В факторе VIIa в свободном состоянии (факторе VIIa, не связанном с тканевым фактором) спираль деформирована и в результате этого, очевидно, нестабильна. Полипептидные варианты в соответствии с настоящим изобретением достигают активной конформации, которая обычно должна быть индуцирована тканевым фактором. Увеличенная активность полипептидных вариантов по сравнению с диким типом фактора VIIa может быть обусловлена стабилизацией α-спирали, переориентацией спирали или каким-то другим изменением конформации. Замена Leu305 должна индуцировать переориентацию и/или стабилизацию спирали.

Аминокислоты, включая Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 и Met298, расположены в области, которая, как считается, влияет на вставку аминоконца протеазного домена и тем самым на образование каталитически активной конформации фактора VIIa, которая зависит от солевого мостика между концевой аминогруппой Ilе153 и боковой цепью Asp343. Замены могут устранять электростатическое отталкивание, добавлять водородные связи или другим способом облегчать вставку аминоконца.

Благодаря более высокой собственной активности описанных полипептидных вариантов фактора VIIa по сравнению с природным VIIa, более низкая доза может быть адекватной для получения функционально адекватной концентрации в месте действия, и таким образом будет возможно вводить более низкую дозу субъекту со случаями кровотечений или нуждающемуся в увеличении активности нормальной системы гемостаза.

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что в результате замены аминокислоты Leu305 в сочетании с одним или более Lys в положении 157, и Lys в положении 337, и Val в положении 158, и Glu в положении 296, и Met в положении 298, и Asp в положении 334, и Ser в положении 336, фактор VIIa будет спонтанно достигать более активной конформации, которая обычно должна индуцироваться тканевым фактором. Такие полипептидные варианты фактора VIIa проявляют собственную активность, которая может быть терапевтически применимой в ситуациях, когда прокоагуляторная активность независима от тканевого фактора (образование фактора Ха на поверхности тромбоцитов), таких как при введении высоких доз, например, NovoSeven®.

В другом осуществлении дополнительная замена аминокислот в протеазном домене дополнительно облегчает образование активной конформации молекулы. Предполагается, однако, что наиболее выраженные эффекты должны быть выявлены, когда указанные выше мутации индуцируются в непосредственной близости (по последовательности или по трехмерной структуре) от данных последних семи аминокислот.

Изобретение дополнительно охватывает замену нескольких аминокислот в N-конце домена Gla (аминокислоты в положении, соответствующем 1-37 SEQ ID NO:1) фактора VIIa, что может придать белку существенно более высокое сродство к фосфолипидам мембран, таким как фосфолипиды мембран клеток, несущих тканевой фактор, или тромбоцитов, в результате чего создаются полипептидные варианты фактора VII, которые обладают усиленным прокоагуляторным действием.

Таким образом, указанные выше полипептидные варианты фактора VIIa, в дополнение к уже произведенной замене аминокислоты в положении 305 в сочетании с заменами в положениях 157, 158, 296, 298, 334, 336 или 337 и необязательными заменами аминокислот в других участках протеазного домена, могут также иметь, по меньшей мере, одну замену аминокислоты в N-концевом домене Gla, в результате чего получают белок, имеющий увеличенную активность, а также увеличенное сродство к фосфолипидам мембран по сравнению с природным фактором VII. Предпочтительно аминокислоты в положениях 10 и 32 (относительно SEQ ID NO:1) фактора VII могут быть заменены отличной аминокислотой. Примерами предпочтительных аминокислот для включения в указанные выше положения являются: аминокислоту Pro в положении 10 заменяют на Gln, Arg, His, Gln, Asn или Lys; и/или аминокислоту Lys в положении 32 заменяют на Glu, Gln или Asn.

Для замены могут быть также рассмотрены другие аминокислоты в домене Gla, исходя из различий в сродстве к фосфолипидам и из последовательностей зависимых от витамина К белков плазмы.

Термин «N-концевой домен Gla» обозначает аминокислотную последовательность 1-37 фактора VII.

Трехбуквенное обозначение «GLA» означает 4-карбоксиглутаминовую кислоту (γ-карбоксиглутамат).

Термин «протеазный домен» обозначает аминокислотную последовательность 153-406 фактора VII (тяжелую цепь фактора VIIa).

Применяемый здесь термин «полипептид фактора VII» обозначает любой белок, включающий аминокислотную последовательность 1-406 природного фактора VII человека (SEQ ID NO:1), или его варианты. Он включает, но не ограничивается этим, фактор VII человека, фактор VIIa человека и их варианты.

Применяемый здесь термин «фактор VII» предназначен для включения молекулы неактивного одноцепочечного зимогенного фактора VII, а также молекулы активного двухцепочечного фактора VII (фактора VIIa). Он включает белки, которые имеют аминокислотную последовательность 1-406 природного фактора VII или фактора VIIa человека. Он также включает белки со слегка модифицированной аминокислотной последовательностью, например, с модифицированным N-концом, включая делеции N-концевых аминокислот или добавки такой длины, чтобы данные белки по существу сохраняли активность фактора VIIa. Применяемый здесь термин «фактор VIIa» или «FVIIa» обозначает продукт, состоящий из активированной формы (фактора VIIa). «Фактор VII» или «фактор VIIa» в пределах указанного выше определения также включает природные аллельные варианты, которые могут существовать и встречаются то у одного, то у другого индивидуума. Кроме того, степень и участки гликозилирования или других посттрансляционных модификаций могут варьироваться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и природы клеточного окружения хозяина.

Применяемые здесь термины «вариант» или «варианты» предназначены для обозначения фактора VII, имеющего последовательность SEQ ID NO:1, где одна или более аминокислот родительского белка заменена другой аминокислотой, и/или где одна или более аминокислот родительского белка удалена, и/или где одна или более аминокислот вставлены в белок, и/или где одна или более аминокислот добавлены к родительскому белку. Такое добавление может иметь место либо на N-концевом участке, либо на С-концевом участке родительского белка, или на обоих концевых участках. «Вариант» или «варианты» в пределах данного определения все еще имеют активность FVII в их активированной форме. В одном осуществлении вариант на 70% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В одном осуществлении вариант на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В другом осуществлении вариант на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В дополнительном осуществлении вариант на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO:1.

В первом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

Во втором аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с двумя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В третьем аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с тремя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой двух аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В дополнительном аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с четырьмя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой трех аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с пятью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой четырех аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В дополнительном аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с шестью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой пяти аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с семью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой шести аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII с восемью заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой аминокислот К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидной конструкции, кодирующей полипептид фактора VII, включающий, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой, и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298.

Термин «конструкция» предназначен для обозначения полинуклеотидного сегмента, который может быть основан на полностью или частично существующей в природе нуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий полипептид. Конструкция может необязательно содержать другие полинуклеотидные сегменты. Сходным образом, термин «аминокислоты, которые могут кодироваться полинуклеотидными конструкциями» покрывает аминокислоты, которые могут кодироваться полинуклеотидными конструкциями, определенными выше, т.е. такие аминокислоты как Ala, Val, Leu, lle, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp и Gln.

В другом аспекте в изобретении предлагается рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотидную конструкцию, кодирующую полипептид фактора VII.

Применяемый здесь термин «вектор» обозначает объект из любой нуклеиновой кислоты, способный амплифицироваться в клетке-хозяине. Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого является независимой от репликации хромосом, например, плазмида. Альтернативно, вектор может быть таким, что после введения в клетку-хозяина он интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется совместно с хромосомой (мами), в которую он был интегрирован. Выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую он вводится. Векторы включают, но не ограничиваются этим, плазмидные векторы, векторы-фаги, вирусы или космидные векторы. Векторы обычно содержат начало репликации и, по меньшей мере, один ген для селекции, т.е. ген, кодирующий продукт, который легко определять или присутствие которого существенно для клеточного роста.

В другом аспекте в изобретении предлагается рекомбинантная клетка-хозяин, включающая полинуклеотидную конструкцию или вектор. В одном осуществлении рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку эукариот. В другом осуществлении рекомбинантная клетка-хозяин происходит от млекопитающих. В дополнительном осуществлении рекомбинантная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток СНО, клеток НЕК и клеток ВНК.

Применяемый здесь термин «клетка-хозяин» представляет любую клетку, включая гибридные клетки, в которой может экспрессироваться гетерологичная ДНК. Типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются этим, клетки насекомых, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, включая клетки человека, такие как клетки ВНК, СНО, НЕК и COS. В экспериментах настоящего изобретения клетки-хозяева, предназначенные для культивирования, предпочтительно представляют собой клетки млекопитающих, более предпочтительно признанную линию клеток млекопитающих, включая без ограничения клеточные линии СНО (например, АТСС CCL 61), COS-1 (например, АТСС CRL 1650), клеток почек детенышей хомячка (ВНК) и НЕК293 (например, АТСС CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительной клеточной линией ВНК является клеточная линия tk^-tsl3 ВНК (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), обозначаемая здесь далее как клетки ВНК 570. Клеточная линия ВНК 570 имеется в распоряжении американской коллекции типов культур, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, под номером поступления АТСС CRL 10314. Клеточная линия tk^-tsl3 ВНК имеется в распоряжении АТСС, под номером поступления CRL 1632. Другие подходящие клеточные линии включают без ограничения Rat Hep I (гепатома крысы; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатома крысы; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), клетки легких человека (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1) и клетки DUKX (Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). Пригодными также являются клетки 3Т3, клетки Namalwa, миеломы и гибриды клеток миеломы с другими клетками.

В другом аспекте в изобретении предлагается трансгенное животное, содержащее и экспрессирующее полинуклеотидную конструкцию.

В другом аспекте в изобретении предлагается трансгенное растение, содержащее и экспрессирующее полинуклеотидную конструкцию.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида фактора VII изобретения, причем способ включает культивирование клетки, включающей полинуклеотидную конструкцию, в подходящей ростовой среде в условиях, позволяющих экспрессироваться полинуклеотидной конструкции, и выделение полученного в результате полипептида из культуральной среды.

Применяемый здесь термин «подходящая ростовая среда» обозначает среду, содержащую питательные вещества и другие компоненты, требуемые для роста клеток и экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора VII изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида фактора VII, причем способ включает выделение полипептида из молока, продуцируемого трансгенным животным.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида фактора VII, причем способ включает культивирование клетки трансгенного растения, включающей полинуклеотидную конструкцию, и выделение полипептида из полученного в результате растения.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей полипептид фактора VII, имеющий, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, КЗ 37, D334, S336, V158, Е296 и М298; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте изобретение относится к применению полипептида фактора VII, имеющего, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, V158, Е296 и М298; для получения лекарственного средства. В одном осуществлении лекарственное средство применяется для лечения нарушений кровотечения или эпизодов кровотечения или для увеличения активности нормальной системы гемостаза. В одном осуществлении лекарственное средство применяется для лечения гемофилии А или В.

В контексте настоящего изобретения термин «лечение» предназначен для включения как предотвращения ожидаемого кровотечения, как в случае хирургических вмешательств, так и регуляции уже наступившего кровотечения, такого как при травме, с целью ингибирования кровотечения или сведения его к минимуму. Профилактическое введение полипептида фактора VIIa в соответствии с изобретением, таким образом, включается в термин «лечение».

Термин «эпизоды кровотечения» предназначен для включения неконтролируемого и избыточного кровотечения. Эпизоды кровотечения могут быть существенной проблемой как в связи с хирургическим вмешательством, так и при других формах повреждения ткани. Неконтролируемое и избыточное кровотечение может наступить у субъектов, имеющих нормальную систему свертывания, и у субъектов с расстройствами свертывания или в виде кровотечения. Применяемый здесь термин «расстройство в виде кровотечения» отражает любой дефект, врожденный, острый или индуцированный, клеточного или молекулярного происхождения, который проявляется в виде кровотечений. Примерами является недостаточность факторов свертывания (например, гемофилия А и В или недостаточность факторов свертывания XI или VII), ингибирование факторов свертывания, нарушение функций тромбоцитов, тромбоцитопения или болезнь фон Виллебранда.

Избыточные кровотечения также наступают у субъектов с нормальным функционированием каскада свертывания крови (в отсутствие недостаточности факторов свертывания или ингибиторов любого из факторов свертывания) и могут быть вызваны нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. В таких случаях кровотечения могут быть похожи на те кровотечения, которые вызываются гемофилией, поскольку в системе гемостаза, как и при гемофилии, отсутствуют или являются нетипичными главные «компоненты» свертывания (такие как тромбоциты или белковый фактор фон Виллебранда), что является основной причиной кровотечений. У субъектов, которые испытали обширное повреждение ткани в связи с хирургическим вмешательством или тяжелой травмой, нормальный механизм гемостаза может быть нарушен в связи с необходимостью немедленного гемостаза, и у них может развиться кровотечение, несмотря на нормальный механизм гемостаза. Достижение удовлетворительного гемостаза также является проблемой при кровотечениях, наступающих в органах, таких как мозг, область внутреннего уха и глаза, характеризующихся ограниченной возможностью для хирургического гемостаза. Такая же проблема может возникнуть в процессе взятия биопсий из различных органов (печени, легких, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также при лапароскопической хирургии. Обычно для всех данных ситуаций трудностью является обеспечение гемостаза с помощью хирургических процедур (швов, зажимов и т.д.), куда также входят случаи, когда кровотечение является диффузным (геморрагический гастрит и профузное маточное кровотечение). Острое и профузное кровотечения могут также наступать у субъектов при антикоагуляторной терапии, у которых нарушения гемостаза индуцировались получаемым лечением. Такие субъекты могут нуждаться в хирургических вмешательствах в случае, если надо быстро противодействовать антикоагуляторному эффекту. Радикальная залобковая простатэктомия представляет собой обычно проводимую процедуру у субъектов с локализованным раком простаты. Операция часто осложняется существенной и иногда массивной потерей крови. Значительная потеря крови при простатэктомии связана главным образом с осложненной анатомической ситуацией с различающимися по плотности местами васкуляризации, которые не являются легко доступными для хирургического гемостаза, что может приводить к диффузному кровотечению из большой области. Другой ситуацией, которая может вызвать проблемы в случае неудовлетворительного гемостаза, является такая, при которой субъекты с нормальным механизмом гемостаза получают антикоагуляторную терапию для предотвращения тромбоэмболического заболевания. Такая терапия может включать гепарин, другие формы протеогликанов, варфарин или другие формы антагонистов витамина К, а также аспирин и другие ингибиторы агрегации тромбоцитов.

В одном осуществлении изобретения кровотечение связано с гемофилией. В другом осуществлении кровотечение связано с гемофилией с приобретенными ингибиторами. В другом осуществлении кровотечение связано с тромбоцитопенией. В другом осуществлении кровотечение связано с болезнью фон Виллебранда. В другом осуществлении кровотечение связано с тяжелым повреждением ткани. В другом осуществлении кровотечение связано с тяжелой травмой. В другом осуществлении кровотечение связано с хирургическим вмешательством. В другом осуществлении кровотечение связано с лапароскопической хирургией. В другом осуществлении кровотечение связано с геморрагическим гастритом. В другом осуществлении кровотечение представляет собой профузное маточное кровотечение. В другом осуществлении кровотечение наступает в органах с ограниченной осуществимостью механического гемостаза. В другом осуществлении кровотечение наступает в мозге, области внутреннего уха или глазах. В другом осуществлении кровотечение связано с процессом взятия биопсийного материала. В другом осуществлении кровотечение связано с антикоагуляторной терапией.

Применяемый здесь термин «субъект» предназначен для обозначения любого животного, в частности млекопитающих, таких как человек, и может, где это подходит, применяться взаимозаменяемо с термином «пациент».

Термин «усиление нормальной системы гемостаза» обозначает усиление способности генерировать тромбин.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения расстройств кровотечения или эпизодов кровотечения у субъекта или к усилению нормальной системы гемостаза, причем способ включает введение терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, включающего, по меньшей мере, две замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) замену L305 любой другой аминокислотой и (ii) замену любой другой аминокислотой одной или более из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157, К337, D334, S336, VI58, Е296 и М298, нуждающемуся в этом субъекту.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду фактора VII изобретения для применения в качестве лекарственного средства.

В одном осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и К157 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и К337 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и D334 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и S336 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и VI58 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и Е296 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором L305 заменена любой другой аминокислотой и М298 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота в оставшихся положениях протеазного домена заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота в оставшихся положениях протеазного домена заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором самое большее 20 дополнительных аминокислот в оставшихся положениях протеазного домена заменены любыми другими аминокислотами.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 159-170 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 290-304 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора V-II представляет собой полипептид, в котором R304 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Туг, Phe, Leu и Met.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 306-312 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором М306 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Asp и Asn.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором D309 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ser и Thr.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором, по меньшей мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из 330-339 SEQ ID NO:1, заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором А274 заменена любой другой аминокислотой.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором А274 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Met, Leu, Lys и Arg.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором К157 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная К337 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная D334 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная S336 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная V158 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная Е296 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Arg, Lys и Val.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная М298 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, Gln и Asn.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная L305 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Val, Tyr и Ile.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанная L305 заменена Val.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором аминокислота заменена отличной аминокислотой, которая может кодироваться полинуклеотидными конструкциями.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанный полипептид является полипептидом фактора VII человека.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором указанный полипептид является полипептидом фактора VIIa человека.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,25. В одном осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,0. В другом осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 4,0.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,25 при тестировании в тесте определения активности фактора VIIa. В одном осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,0 при тестировании в тесте определения активности фактора VIIa. В другом осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 4,0 при тестировании в тесте определения активности фактора VIIa. Активность фактора VIIa может быть измерена с помощью способов, описанных в примере 5 или 6.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,25 при тестировании с помощью "Анализа гидролиза in vitro". В одном осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,0 при тестировании с помощью "Анализа гидролиза in vitro". В другом осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 4,0 при тестировании с помощью "Анализа гидролиза in vitro".

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой полипептид, в котором отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,25 при тестировании с помощью "Анализа протеолиза in vitro". В одном осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,0 при тестировании с помощью "Анализа протеолиза in vitro". В другом осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 4,0 при тестировании с помощью "Анализа протеолиза in vitro". В другом осуществлении отношение активности указанного полипептида фактора VII к активности природного полипептида фактора VIIa, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по меньшей мере, приблизительно 8,0 при тестировании с помощью "Анализа протеолиза in vitro".

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой FVII человека с, по меньшей мере, двумя заменами по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где указанные замены представляют собой (i) L305V и (ii) одну или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из К157Х¹, К337А, D334X², S336X³, V158X⁴, E296V и M298Q, где X¹ представляет собой Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp или Glu; X² представляет собой Gly или Glu; X³ представляет собой Gly или Glu; X⁴ представляет собой Thr или Asp.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/K337A-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/E296V-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/K337A/V158T-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/K337A/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/K337A/E296V-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/K337A/V158D-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D/E296V-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T/E296V-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/E296V/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T/E296V/K337A-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D/E296V/K337A-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII.

В другом осуществлении изобретения полипептид фактора VII представляет собой L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII.

В другом аспекте в изобретении предлагаются полипептиды фактора коагуляции VIIa человека, которые увеличивают независимую от тканевого фактора активность по сравнению с природным фактором коагуляции VIIa человека. В другом аспекте увеличенная активность не сопровождается изменениями в субстратной специфичности. В другом аспекте изобретения связывание полипептидных вариантов с тканевым фактором не должно быть ослаблено и полипептидные варианты должны иметь, по меньшей мере, активность фактора VIIa дикого типа при связывании с тканевым фактором.

Обозначения аминокислотных замен, применяемые в данном изобретении, являются следующими. Первая буква представляет собой аминокислоту, природно существующую в данном положении SEQ ID NO:1. Последующий номер представляет ее положение в SEQ ID NO:1. Вторая буква представляет собой отличную аминокислоту, заменяющую природную аминокислоту. В качестве примера в L305V/K337A-FVII лейцин в положении 305 SEQ ID NO:1 заменен валином и лизин в положении 337 SEQ ID NO:1 заменен аланином, обе мутации в одном и том же полипептидном варианте фактора VII.

В контексте настоящего изобретения трехбуквенные или однобуквенные обозначения аминокислот применялись в их общепринятом значении, как указано в таблице. Если специально не указано, упоминаемые здесь аминокислоты представляют собой L-аминокислоты. Далее, левый и правый концы аминокислотной последовательности пептида представляют собой, соответственно, N- и С-концы, если не указано иначе.

Сокращения для аминокислот:АминокислотаТрехбуквенный кодОднобуквенный кодГлицинGlyGПролинProPАланинAlaAВалинValVЛейцинLeuLИзолейцинIleIМетионинMetMЦистеинCysСФенилаланинPheFТирозинTyrYТриптофанTrpWГистидинHisHЛизинLysКАргининArgRГлутаминGlnQАспарагинAsnNГлутаминовая кислотаGluEАспарагиновая кислотаAspDСеринSerSТреонинThrТ

Получение полипептидных вариантов фактора VII

Изобретение также относится к способу получения полипептидных вариантов фактора VII человека, как упоминалось выше. Описанные здесь полипептидные варианты фактора VII могут быть получены способами рекомбинантных нуклеиновых кислот. В общем виде, клонированную нуклеотидную последовательность фактора VII дикого типа модифицируют таким образом, чтобы она кодировала желаемый белок. Данную модифицированную последовательность затем вставляют в экспрессионный вектор, которым в свою очередь трансформируют или трансфицируют клетки-хозяева. В качестве клеток-хозяев предпочтительны клетки высших эукариот, в особенности культивируемые клетки млекопитающих. Полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности фактора VII человека известны (смотри патент США 4784950, в котором описаны клонирование и экспрессия рекомбинантного фактора VII человека). Последовательность фактора VII быка описана Takeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988)).

Изменения аминокислотной последовательности могут быть осуществлены различными способами. Модификация последовательности нуклеиновой кислоты может быть произведена сайт-специфическим мутагенезом. Способы сайт-специфического мутагенеза хорошо известны в данной области техники и описаны, например, Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984) или в "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, pp.61-68. Таким образом, применяя нуклеотидную и аминокислотную последовательности фактора VII, можно вносить предпочтительное(ые) изменение(я). Сходным образом специалистам в данной области техники хорошо известны способы получения ДНК-конструкций с применением полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров (сравни PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, США).

Конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант полипептида фактора VII изобретения, может иметь геномное или кДНК происхождение в зависимости от обстоятельств, например, полученная созданием библиотеки геномной ДНК или кДНК и скринингом последовательностей ДНК для всего полипептида или его части с помощью гибридизации с применением синтетических олигонуклеотидных зондов в соответствии со стандартными способами (сравни Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант полипептида фактора VII, может быть также получена синтетически с помощью признанных стандартных способов, например, фосфоамидитным способом, описанным Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, или способом, описанным Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805. Согласно фосфоамидитному способу олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящих векторах. Последовательности ДНК, кодирующие варианты полипептида фактора VII человека, могут быть также получены с помощью полимеразной цепной реакции с применением специфичных праймеров, например, как описано в патенте США 4683202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, или Sambrook et al., смотри выше.

Более того, конструкция нуклеиновой кислоты может состоять из смеси синтетической и геномной, смеси синтетической и кДНК или смеси ДНК геномного и кДНК происхождения, которую получают лигированием фрагментов ДНК синтетического, геномного или кДНК происхождения (в зависимости от обстоятельств), соответствующих различным частям цельной конструкции нуклеиновой кислоты, согласно стандартным способам.

Конструкцией нуклеиновой кислоты предпочтительно является ДНК-конструкция. Последовательности ДНК для применения в получении вариантов полипептида фактора VII согласно настоящему изобретению обычно должны кодировать препрополипептид на амино-конце фактора VII для обеспечения правильного посттрансляционного процессинга (например, гамма-карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты) и секреции из клетки-хозяина. Препрополипептид может быть таким же, как в факторе VII или другом зависимом от витамина К белке плазмы, таком как фактор IX, фактор X, протромбин, протеин С или протеин S. Специалисты в данной области техники должны понимать, что могут быть осуществлены дополнительные модификации аминокислотной последовательности вариантов полипептида фактора VII, когда данные модификации не снижают существенно способность белка действовать в качестве коагулянта. Например, варианты полипептида фактора VII могут быть также модифицированы по сайту активационного расщепления для снижения превращения зимогенного фактора VII в активированную двухцепочечную форму, как это в целом описано в патенте США 5288629, включенном в данное описание в качестве ссылки.

Последовательности ДНК, кодирующие варианты полипептида фактора VII, обычно вставляют в рекомбинантный вектор, который может быть любым вектором, подходящим для процедур с рекомбинантной ДНК, и выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую он должен быть введен. Так, вектор может быть автономно реплицируемым вектором, т.е. вектором, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиды. Альтернативно, вектор может быть таким, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он был интегрирован.

Вектор является предпочтительно экспрессионным вектором, в котором последовательность ДНК, кодирующая варианты полипептида фактора VII человека, функционально связана с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции ДНК. Обычно экспрессионный вектор берет начало от плазмидной или вирусной ДНК или содержит элементы обеих. Термин «функционально связанный» указывает на то, что сегменты организованы таким образом, что они функционируют совместно для осуществления предназначенных для них целей, например, инициации транскрипции на промоторе и ее продолжении вдоль последовательности ДНК, кодирующей полипептид.

Экспрессионные векторы для применения для экспрессии вариантов полипептида фактора VIIa должны включать промотор, способный направлять транскрипцию клонированного гена или кДНК. Промотором может быть любая последовательность ДНК, которая проявляет транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине и может брать начало от генов, кодирующих белки, либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией ДНК, кодирующей вариант полипептида фактора VII человека, являются промотор SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), промотор МТ-1 (ген металлотионеина) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814), промотор CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) или главный поздний промотор аденовируса 2 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982).

Примером подходящего промотора для применения в клетках насекомых является полигедриновый промотор (патент США 4745051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), промотор Р10 (J.M. Vlak et al., J Gen. Virology 69, 1988, pp.765-776), промотор основного белка вируса полигедроза Autographa californica (патент ЕР 397485), промотор немедленного раннего гена 1 бакуловируса (патент США 5155037; патент США 5162222), или промотор замедленного раннего гена 39К бакуловируса (патент США 5155037; патент США 5162222).

Примеры подходящих промоторов для применения в дрожжевых клетках-хозяевах включают промоторы генов гликолиза дрожжей (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) или генов алкогольдегидрогеназы (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., eds.). Plenum Press, New York, 1982), или промоторы ТРI1 (патент США 4599311) или ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654).

Примерами подходящих промоторов для применения в клетках-хозяевах гифомицетов являются, например, промотор ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) или промотор tpiA. Примерами других пригодных промоторов являются те промоторы, которые берут происхождение от генов, кодирующих ТАКА амилазу А. oryzae, аспартатную протеиназу Rhizomucor miehei, нейтральную α-амилазу A. niger, кислотоустойчивую α-амилазу A. niger, глюкоамилазу (gluA) A. niger или A. awamori, липазу Rhizomucor miehei, щелочную протеазу A. oryzae, триозофосфатизомеразу А. oryzae или ацетамидазу A. nidulans. Предпочтительными являются промоторы ТАКА-амилазы и gluA. Подходящие промоторы упомянуты, например, в патентах ЕР 238023 и ЕР 383779.

Последовательности ДНК, кодирующие варианты полипептида фактора VII человека, при необходимости могут быть также функционально связаны с подходящим терминатором, таким как терминатор гормона роста человека (Palmiter et al., Science 222, 1983, pp.809-814) или терминаторы ТРИ (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp.419-434) или ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp.2093-2099). Экспрессионные векторы могут также содержать набор сайтов сплайсинга РНК, расположенных ниже промотора и выше сайта вставки самой последовательности фактора VII. Предпочтительные сайты сплайсинга РНК могут быть получены из аденовирусных и/или иммуноглобулиновых генов. В экспрессионных векторах также содержится сигнал полиаденилирования, расположенный ниже сайта вставки. Особенно предпочтительные сигналы полиаденилирования включают ранний или поздний сигнал полиаденилирования из SV40 (Kaufman and Sharp, также), сигнал полиаденилирования из области 5 EIb аденовируса, терминатор гена гормона роста человека (DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) или сигнал полиаденилирования гена фактора VII человека или гена фактора VII быка. Экспрессионные векторы могут также включать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую как тройную лидерную последовательность аденовируса 2, расположенную между промотором и сайтами сплайсинга РНК; и энхансерные последовательности, такие как энхансер SV40.

Для направления вариантов полипептида фактора VII человека настоящего изобретения на путь секреции из клеток хозяев в рекомбинантный вектор может быть введена последовательность сигнала секреции (известная также как лидерная последовательность, препро-последовательность или пре-последовательность). Последовательность сигнала секреции присоединяют к последовательностям ДНК, кодирующим варианты полипептида фактора VII человека в правильной рамке считывания. Последовательности сигнала секреции обычно располагают с 5'-конца от последовательности ДНК, кодирующей пептид. Последовательность сигнала секреции может быть таковой, нормально ассоциированной с белком, или может быть взята из гена, кодирующего другой секретируемый белок.

Для секреции из дрожжевых клеток последовательность сигнала секреции может кодировать любой сигнальный пептид, который обеспечивает эффективное направление экспрессированных вариантов полипептида фактора VII человека на путь секреции клеткой. Сигнальный пептид может быть природным сигнальным пептидом или его функциональной частью или может быть синтетическим пептидом. Было обнаружено, что подходящими сигнальными пептидами являются сигнальный пептид а-фактора (сравни патент США 4870008), сигнальный пептид амилазы слюны мыши (сравни О. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp.643-646), модифицированный сигнальный пептид карбоксипептидазы (сравни L.A. Vails et al., Cell 48, 1987, pp.887-897), сигнальный пептид дрожжевой BAR1 (сравни, заявка WO 87/02670), или сигнальный пептид аспарагиновой протеазы 3 дрожжей (YAP3) (сравни М. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137).

Для эффективной секреции у дрожжей последовательность, кодирующая лидерный пептид, может быть также вставлена ниже сигнальной последовательности и выше последовательности ДНК, кодирующей варианты полипептида фактора VII человека. Функция лидерного пептида заключается в обеспечении направления экспрессированного пептида из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и затем в секреторную везикулу для секреции в культуральную среду (т.е. для экспорта вариантов полипептида фактора VII человека через клеточную стенку или, по меньшей мере, через клеточную мембрану в периплазматическое пространство дрожжевой клетки). Лидерным пептидом может быть лидер альфа-фактора дрожжей (применение которого описано в патентах США 4546082, США 4870008, ЕР 16201, ЕР 123294, ЕР 123544 и ЕР 163529). Альтернативно, лидерный пептид может быть синтетическим лидерным пептидом, который, если так выразиться, является лидерным пептидом, не обнаруженным в природе. Синтетические лидерные пептиды могут быть, например, сконструированы, как описано в заявках WO 89/02463 или WO 92/11378.

Для применения у гифомицетов сигнальный пептид может быть удобно получен из гена, кодирующего амилазу или глюкоамилазу Aspergillus sp., гена, кодирующего липазу или протеазу Rhizomucor miehei или липазу Humicola lanuginosa. Сигнальный пептид предпочтительно берет начало от гена, кодирующего ТАКА амилазу A. oryzae, нейтральную α-амилазу A. niger, кислотостабильную амилазу А. niger или глюкоамилазу А. niger. Подходящие сигнальные пептиды раскрыты, например, в патентах ЕР 238023 и ЕР 215594.

Для применения в клетках насекомых сигнальный пептид удобно получать из гена насекомого (сравни заявку WO 90/05783), такой как сигнальный пептид предшественника адипокинетического гормона бабочки Manduca sexta (сравни патент США 5023328).

Процедуры, применяемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих варианты полипептида фактора VII человека, промотор и необязательно терминатор и/или сигнальную последовательность секреции, соответственно, и для их вставки в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области техники (сравни, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Способы трансфекции клеток млекопитающих и экспрессии последовательностей ДНК, введенных в клетки, описаны, например, в Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; и Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845.

Клонированные последовательности ДНК вводят в культивируемые клетки млекопитающих, например, с помощью опосредуемой фосфатом кальция трансфекции (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) или электропорации (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Для идентификации и селекции клеток, экспрессирующих экзогенную ДНК, в клетки наряду с интересующим геном или кДНК обычно вводят ген, обеспечивающий селектируемый фенотип (маркер селекции). Предпочтительные маркеры селекции включают гены, которые придают устойчивость к лекарствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Маркером селекции может быть амплифицируемый маркер селекции. Предпочтительным амплифицируемым маркером селекции является последовательность дигидрофолатредуктазы (DHFR). Маркеры селекции рассмотрены Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, включенная в данное описание в качестве ссылки). Специалист в данной области техники может легко подобрать подходящие маркеры селекции.

Маркеры селекции могут быть введены в клетку на отдельной плазмиде одновременно с интересующим геном или они могут быть введены на той же самой плазмиде. Если маркер селекции и интересующий ген находятся на одной и той же плазмиде, то они могут находиться под контролем различных промоторов или одного и того же промотора, причем структура последнего обеспечивает получение дицистронного посредника. Конструкции данного типа известны в данной области техники (например, Levinson and Simonsen, патент США 4713339). Может быть также выгодным добавление к смеси, которую вводят в клетки, дополнительной ДНК, известной как «ДНК-носитель».

После захвата клетками ДНК их выращивают на подходящей среде для роста, обычно 1-2 дня, для начала экспрессии интересующего гена. Применяемый здесь термин «подходящая среда для роста» обозначает среду, содержащую питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста клеток и экспрессии интересующих вариантов полипептида фактора VII человека. Среда обычно включает источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, необходимые сахара, витамины, соли, фосфолипиды, белок и ростовые факторы. Для получения гамма-карбоксилированных белков среда должна содержать витамин К, предпочтительно в концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл. Затем вносят лекарство для селекции роста клеток, которые стабильно экспрессируют маркер селекции. Для клеток, трансфицированных амплифицируемым маркером селекции, концентрация лекарства может быть увеличена для отбора повышенного количества копий клонированных последовательностей, что тем самым увеличивает уровень экспрессии. Клоны стабильно трансфицированных клеток затем подвергают скринингу на экспрессию интересующего варианта полипептида фактора VII человека.

Клеткой-хозяином, в которую вводят последовательности ДНК, кодирующие варианты полипептида фактора VII человека, может быть любая клетка, которая способна продуцировать посттрансляционно модифицированные варианты полипептида фактора VII человека, и включает клетки дрожжей, грибов и высших эукариот.

Примерами линий клеток млекопитающих для применения в настоящем изобретении являются линии клеток COS-1 (ATCC CRL 1650), почки детеныша хомячка (ВНК) и 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительной линией клеток ВНК является линия клеток ВНК tk^-tsl3 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, включенная в данное описание в качестве ссылки), обозначаемая здесь далее как клетки ВНК 570. Линия клеток ВНК 570 была депонирована Американской коллекцией типовых культур, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, с номером регистрации АТСС CRL 10314. Линия клеток ВНК tk^- tsl3 также доступна в АТСС под регистрационным номером CRL 1632. Кроме того, в настоящем изобретении может быть применен ряд других клеточных линий, включая клетки Rat Нер I (гепатомы крысы; АТСС CRL 1600), Rat Нер II (гепатомы крысы; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), легкого человека (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1), СНО (АТСС CCL 61) и DUKX (Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).

Примеры подходящих клеток дрожжей включают клетки Saccharomyces spp. или Schizosaccharomyces spp., в особенности штаммов Saccharomyces cerevisiae или Saccharomyces kluyveri. Способы трансформации дрожжевых клеток гетерологичными ДНК и получения из них гетерологичных полипептидов описаны, например, в патентах США 4599311, 4931373, 4870008, 5037743 и 4845075, каждый из которых включен в данное описание в качестве ссылки. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому маркером селекции, обычно по устойчивости к лекарственному средству или по способности расти в отсутствие отдельного питательного вещества, например, лейцина. Предпочтительным вектором для применения в дрожжах является вектор РОТ1, раскрытый в патенте США 4931373. Последовательностям ДНК, кодирующим варианты полипептида фактора VII человека, может предшествовать сигнальная последовательность и необязательно лидерная последовательность, например, как описано выше.

Дополнительными примерами подходящих дрожжевых клеток являются штаммы Kluyveromyces, такие как К. lactis, Hansenula, например, Н. polymorpha, или Pichia, например, Р. pastoris (сравни Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp.3459-3465; патент США 4882279).

Примерами других клеток грибов являются клетки гифомицетов, например, Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. или Trichoderma spp., в особенности штаммов A. oryzae, A. nidulans или A. niger. Применение Aspergillus spp. для экспрессии белков описано, например, в патентах ЕР 272277, ЕР 238023, ЕР 184438. Трансформация F. oxysporum может быть проведена, например, как описано Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156. Трансформация Trichoderma spp. может быть проведена, например, как описано в патенте ЕР 244234.

Когда в качестве клетки-хозяина применяют гифомицеты, их можно трансформировать ДНК-конструкцией изобретения, обычно путем интеграции ДНК-конструкции в хромосому хозяина с получением рекомбинантной клетки-хозяина. Данную интеграцию обычно рассматривают как благоприятную, поскольку последовательность ДНК с большей вероятностью будет стабильно сохраняться в клетке. Интеграция ДНК-конструкции в хромосому хозяина может быть осуществлена с помощью традиционных способов, например, путем гомологичной или гетерологичной рекомбинации.

Трансформация клеток насекомых и получение в них гетерологичных полипептидов может быть осуществлена, как описано в патентах США 4745051; 4879236; 5155037; 5162222; патенте ЕР 397485, каждый из которых включен в данное описание в качестве ссылки. Подходящей линией клеток насекомых, применяемой в качестве хозяина, может быть линия клеток Lepidoptera, такая как клетки Spodoptera frugiperda или клетки Trichoplusia ni (сравни патент США 5077214). Подходящими условиями культивирования могут быть такие, какие описаны, например, в заявках WO 89/01029 или WO 89/01028 или в любой из упомянутых выше ссылок.

Описанные выше трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева затем культивируют в подходящей питательной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию варианта полипептида фактора VII человека, после чего весь полученный пептид или его часть могут быть удалены из культуры. Среда, применяемая для культивирования клеток, может быть любой традиционной средой, пригодной для выращивания клеток-хозяев, такой как минимальные или полные среды, содержащие подходящие добавки. Подходящие среды имеются в продаже или могут быть получены согласно опубликованным прописям (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Продуцированный клетками вариант полипептида фактора VII человека может быть затем извлечен из культуральной среды традиционными способами, включая отделение клеток-хозяев от среды центрифугированием или фильтрацией, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли, например, сульфата аммония, очистку с помощью разнообразных хроматографических процедур, например, ионообменной хроматографией, хроматографией гель-фильтрацией, аффинной хроматографией или тому подобным, в зависимости от типа интересующего полипептида.

Для получения вариантов полипептида фактора VII человека изобретения может быть применена техника трансгенных животных. Предпочтительно получать белки в молочных железах самки млекопитающего-хозяина. Экспрессия в молочной железе и последующая секреция интересующего белка в молоко преодолевает многие трудности, встречающиеся при выделении белков из других источников. Молоко легко собирать, оно доступно в больших количествах и биохимически хорошо охарактеризовано. Более того, главные белки молока присутствуют в молоке в высоких концентрациях (обычно от приблизительно 1 до 15 г/л).

С коммерческой точки зрения явно предпочтительным является применение в качестве хозяина видов, дающих много молока. Хотя могут быть применены и более мелкие животные, такие как мыши и крысы (и они предпочтительны на стадии доказательства принципа), предпочтительно использовать домашних млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, свиней, коз, овец и крупный рогатый скот. Особенно предпочтительными являются овцы благодаря таким факторам, как предшествующая история трансгенеза у данного вида, выход молока, стоимость и легкая доступность оборудования для сбора овечьего молока (смотри, например, заявку WO 88/00239 для сравнения факторов, влияющих на выбор вида хозяина). Обычно желательно выбрать породу животного-хозяина, которая была выведена для молочного производства, такую как овца East Friesland, или создать молочную породу разведением трансгенной линии позднее. В любом случае следует применять животных с известным статусом с хорошим здоровьем.

Для получения экспрессии в молочной железе применяют транскрипционный промотор гена белка молока. Гены белка молока включают гены, которые кодируют казеины (смотри патент США 5304489), бета-лактоглобулин, α-лактальбумин и кислый белок сыворотки. Предпочтительным является промотор бета-лактоглобулина (BLG). В случае гена бета-лактоглобулина овцы обычно должна применяться область из, по меньшей мере, 406 проксимальных п.н. 5'-примыкающей последовательности гена, хотя предпочтительны более крупные части 5'-последовательности, до приблизительно 5 т.п.н., такие как сегмент ДНК ˜4,25 т.п.н., включающий 5'-примыкающий промотор и некодирующую часть гена бета-лактоглобулина (смотри Whitelaw et al., Biochem. J. 286:31-39 (1992)). Пригодны также сходные фрагменты промоторной ДНК от других видов.

В конструкции могут быть также включены другие области гена бета-лактоглобулина, как и геномные области подлежащего экспрессии гена. В данной области техники является общепринятым, что конструкции, не содержащие интроны, экспрессируются плохо по сравнению с таковыми, которые содержат такие последовательности ДНК (смотри Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1:3-13 (1991); заявки WO 89/01343; и WO 91/02318, каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылки). В этом отношении обычно предпочтительно, когда это возможно, применение геномных последовательностей, содержащих все или некоторые из природных интронов гена, кодирующего интересующий белок или полипептид, так что предпочтительным является дополнительное включение, по меньшей мере, некоторых интронов из, например, гена бета-лактоглобулина. Одной такой областью является сегмент ДНК, который обеспечивает интронный сплайсинг и полиаденилирование РНК с 3' некодирующей области гена бета-лактоглобулина овцы. При замещении природных 3' некодирующих последовательностей гена данный сегмент овечьего бета-лактоглобулина может и усиливать, и стабилизировать уровень экспрессии интересующего белка или полипептида. В других осуществлениях область, окружающую ATG инициации в последовательности варианта фактора VII, заменяют соответствующими последовательностями из гена специфичного для молока белка. Такая замена обеспечивает предположительное окружение для тканеспецифичной инициации для усиления экспрессии. Удобно заменять целиком пре-провариант фактора VII и 5' некодирующие последовательности таковыми из, например, гена BLG, хотя можно заменять и меньшие области.

Для экспрессии вариантов полипептида фактора VII у трансгенных животных сегмент ДНК, кодирующий вариант фактора VII, функционально связывают с дополнительными сегментами ДНК, необходимыми для его экспрессии, с получением экспрессионных единиц. Такие дополнительные сегменты включают вышеупомянутый промотор, а также последовательности, обеспечивающие терминацию транскрипции и полиаденилирование мРНК. Экспрессионные единицы должны дополнительно включать сегмент ДНК, кодирующий последовательность сигнала секреции, функционально связанную с сегментом, кодирующим модифицированный фактор VII. Последовательность сигнала секреции может быть природной последовательностью сигнала секреции фактора VII или может быть таковой другого белка, такого как белок молока (смотри, например, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986); и Meade et al., патент США 4873316, которые включены в данное описание в качестве ссылки).

Конструирование экспрессионных единиц для применения у трансгенных животных удобно производить путем вставки последовательности варианта фактора VII в плазмидный или фаговый вектор, содержащий дополнительные сегменты ДНК, хотя экспрессионная единица может быть сконструирована с помощью по существу любой последовательности лигирования. Особенно удобно взять вектор, содержащий сегмент ДНК, кодирующий белок молока, и заменить последовательность, кодирующую белок молока, таковой варианта фактора VII; с созданием тем самым гибридного гена, который включает последовательности контроля экспрессии гена белка молока. В любом случае клонирование экспрессионных единиц в плазмидах или других векторах облегчает амплификацию последовательности варианта фактора VII. Амплификацию удобно проводить в бактериальных (например, Е.coli) клетках-хозяевах, так, чтобы векторы обычно включали начало репликации и подходящий маркер селекции, функционирующий в бактериальных клетках-хозяевах. Экспрессионную единицу затем вводят в оплодотворенные яйца (включая эмбрионы на ранней стадии) выбранного вида хозяина. Введение гетерологичной ДНК может быть осуществлено одним из обычных способов, включая микроинъекцию (например, патент США No. 4873191), ретровирусную инфекцию (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)) или сайт-направленную интеграцию с применением эмбриональных стволовых (ES) клеток (обзор Bradley et al., Bio/Technology 10:534-539 (1992)). Яйца затем имплантируют в яйцеводы или матки псевдобеременных самок и дают им развиваться до родов. Потомство, несущее введенную ДНК в своих половых клетках, может передать ДНК своему потомству в соответствии с обычным Менделевским распределением, обеспечивая развитие трансгенных стад. Общие процедуры для получения трансгенных животных известны в данной области техники (смотри, например, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113-120 (1992); патенты США 4873191; 4873316; заявки WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; и GB 87/00458). Способы введения последовательностей чужеродной ДНК млекопитающим и в их половые клетки исходно были разработаны в отношении мыши (смотри, например, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985) и Hogan et al. (там же)). Данные способы были впоследствии адаптированы для применения у более крупных животных, включая виды домашнего скота (смотри, например, заявки WO 88/00239, WO 90/05188, и WO 92/11757; и Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988)). В итоге при наиболее эффективном пути, применяемом в настоящее время для создания трансгенных мышей или домашнего скота, несколько сот линейных молекул интересующей ДНК инъецируют в один из пронуклеусов оплодотворенного яйца в соответствии с утвердившимися способами. Может быть также применена инъекция ДНК в цитоплазму зиготы.

Может быть также применено получение трансгенных растений. Экспрессия может быть генерализованной или приуроченной к конкретному органу, такому как клубень (смотри Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); и патент ЕР 0255378).

Варианты полипептида фактора VII изобретения извлекают из среды культуры клеток или молока. Варианты полипептида фактора VII настоящего изобретения могут быть очищены множеством способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирующую и исключающую по размеру), электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (IEF), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию (смотри, например, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989). Предпочтительно они могут быть очищены аффинной хроматографией на колонке с антителами против фактора VII. Особенно предпочтительно применение зависимых от кальция моноклональных антител, как описано Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986) и Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988). Дополнительная очистка может быть достигнута традиционными способами химической очистки, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография. Другие способы очистки, включая осаждение цитратом бария, известны в данной области техники и могут быть применены для очистки описанных здесь новых вариантов полипептида фактора VII (смотри, например, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Для терапевтических целей предпочтительно, чтобы варианты полипептида фактора VII изобретения были по существу чистыми. Так, в предпочтительном осуществлении изобретения варианты полипептида фактора VII изобретения очищены, по меньшей мере, от приблизительно 90 до 95% гомогенности, предпочтительно до, по меньшей мере, 98% гомогенности. Чистота может быть оценена, например, гель-электрофорезом и секвенированием аминоконцевых аминокислот.

Вариант фактора VII расщепляют по его сайту активации для превращения в его двухцепочечную форму. Активация может быть проведена в соответствии с известными в данной области техники способами, такими как раскрытые Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, патент США No. 4456591; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); или Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983). Альтернативно, как описано Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp.564-565), фактор VII может быть активирован с помощью его пропускания через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) или тому подобное. Полученный в результате активированный вариант фактора VII может быть затем внесен в состав препарата и введен, как описано ниже.

Тесты

В изобретении также предлагаются подходящие тесты для отбора предпочтительных вариантов фактора VIIa согласно изобретению. Данные тесты могут быть проведены как простые предварительные тесты in vitro.

Так, в примере 5 в данном описании раскрыт простой тест (озаглавленный «анализ гидролиза in vitro») активности вариантов фактора VIIa изобретения. На этой основе особенно интересными вариантами фактора VIIa являются такие варианты, для которых отношение активности варианта к активности природного фактора VII, показанного на чертеже, равно приблизительно 1,0, например, по меньшей мере, приблизительно 1,25, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 2,0, такое как, по меньшей мере, приблизительно 3,0, или предпочтительно даже более высокое, по меньшей мере, приблизительно 4,0 при тестировании «анализом гидролиза in vitro».

Активность вариантов может быть также измерена с применением физиологического субстрата, такого как фактор Х («анализ протеолиза in vitro») (смотри пример 6), обычно при концентрации 100-1000 нМ, когда образовавшийся фактор Ха измеряют после добавления подходящего хромогенного субстрата (например, S-2765). Кроме того, тестирование активности может проводиться при физиологической температуре.

Способность вариантов фактора VIIa образовывать тромбин также может быть измерена в тесте, включающем все имеющие к этому отношение факторы и ингибиторы свертывания при физиологических концентрациях (за вычетом фактора VIII при имитации условий гемофилии А) и активированные тромбоциты (как описано на стр.543 в Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99.542-547, которая включена в данное описание в качестве ссылки).

Введение фармацевтических композиций

Варианты полипептида фактора VII согласно изобретению могут применяться для контроля нарушений в виде кровотечений, которые имеют несколько причин, таких как недостаточность факторов свертывания (например, гемофилия А и В или недостаточность факторов коагуляции XI или VII) или ингибиторов факторов свертывания, или их можно применять для контроля избыточного кровотечения, имеющего место у субъектов с нормально функционирующим каскадом свертывания крови (отсутствие недостаточности факторов свертывания или ингибиторов любого из факторов коагуляции). Кровотечение может быть вызвано недостаточностью функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. Его также можно наблюдать у субъектов, у которых под действием различных стимулов была индуцирована повышенная фибринолитическая активность.

У субъектов, которые страдают от массивного повреждения ткани в связи с хирургической операцией или обширной травмой, механизм гемостаза может быть подавлен потребностью в немедленном гемостазе, и у них могут развиваться кровотечения, несмотря на нормальный механизм гемостаза. Достижение удовлетворительного гемостаза также является проблемой, когда кровотечение происходит в таких органах, как мозг, область внутреннего уха и глаза, и оно может быть также проблемой в случае диффузных кровотечений (геморрагический гастрит и избыточное маточное кровотечение), когда сложно определить источник. Та же проблема возникает в процессе биопсии разных органов (печени, легких, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также при лапароскопической хирургии. Данные ситуации привносят сложности в обеспечение гемостаза с помощью хирургических способов (швы, зажимы и т.д.). Острые и обильные кровотечения могут также происходить у субъектов, подвергающихся антикоагулянтной терапии, у которых нарушение гемостаза было вызвано получаемой терапией. Такие субъекты могут нуждаться в хирургическом вмешательстве в случае необходимости быстрого противодействия антикоагулянтному эффекту. Другая ситуация, которая может вызывать проблемы в случае неудовлетворительного гемостаза, возникает тогда, когда субъекты с нормальным механизмом гемостаза получают антикоагулянтную терапию для предотвращения тромбоэмболического заболевания. Такая терапия может включать гепарин, другие формы протеогликанов, варфарин или другие формы антагонистов витамина К, а также аспирин и другие ингибиторы агрегации тромбоцитов.

Системная активация каскада коагуляции может вести к рассеянной внутрисосудистой коагуляции (DIC). Такие осложнения, однако, не наблюдались у субъектов, лечившихся высокими дозами рекомбинантного фактора VIIa из-за локального гемостатического процесса, подобного индуцируемому образованием комплекса между фактором VIIa и TF, экспонированным в месте повреждения стенки сосуда. Варианты полипептида фактора VII согласно изобретению, таким образом, могут быть применены в их активированной форме для контроля таких избыточных кровотечений, ассоциированных с нормальным механизмом гемостаза.

Для лечения в связи с продуманным вмешательством варианты полипептида фактора VII изобретения обычно должны вводиться в пределах приблизительно 24 часов до осуществления вмешательства и даже 7 дней или более после него. Введение в качестве коагулянта может осуществляться разными путями, как описано в данном описании.

Доза вариантов полипептида фактора VII варьирует от приблизительно 0,05 мг до 500 мг/день, предпочтительно от приблизительно 1 мг до 200 мг/день, и более предпочтительно от приблизительно 10 мг до приблизительно 175 мг/день для субъекта весом 70 кг как ударная и поддерживающая доза, в зависимости от веса субъекта и тяжести состояния.

Фармацевтические композиции исходно предназначены для парентерального введения для профилактического и/или терапевтического лечения. Предпочтительно фармацевтические композиции вводят парентерально, т.е. внутривенно, подкожно или внутримышечно, или их можно вводить непрерывной или прерывистой инфузией. Композиции для парентерального введения включают вариант фактора VII изобретения в сочетании с, предпочтительно растворенным в указанном, фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно водным носителем. Может быть применено множество водных носителей, таких как вода, забуференная вода, 0,4% раствор соли, 0,3% глицерин и тому подобное. Варианты полипептида фактора VII изобретения могут быть также составлены в липосомные препараты для доставки или направления к местам повреждения. Липосомные препараты в общем виде описаны, например, в патентах США 4837028, 4501728 и 4975282. Композиции могут быть стерилизованы с помощью общепринятых, хорошо известных способов стерилизации. Полученные водные растворы могут быть расфасованы для применения или отфильтрованы при асептических условиях и лиофилизированы, при этом лиофилизированный препарат соединяют со стерильным водным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как доводящие рН и забуферивающие агенты, агенты доведения тоничности и тому подобное, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д.

Концентрация варианта фактора VII в данных составах может широко варьировать, т.е. от менее чем приблизительно 0,5% по массе, обычно от или, по меньшей мере, 1% по массе до величины 15 или 20% по массе и может быть первоначально выбрана, исходя из объема жидкости, вязкости и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения.

Так, типичная фармацевтическая композиция для внутривенной инфузии может быть составлена с содержанием 250 мл стерильного раствора Рингера и 10 мг варианта фактора VII. Современные способы получения композиций для парентерального введения должны быть известны или очевидны для специалистов в данной области техники и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Композиции, содержащие варианты полипептида фактора VII настоящего изобретения, могут вводиться для профилактического и/или терапевтического лечения. При терапевтическом применении композиции вводят субъекту, уже страдающему от заболевания, как описано выше, в количестве, достаточном для излечения, смягчения или частичной приостановки заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для осуществления этого, обозначают как «терапевтически эффективное количество». Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что эффективное для данной цели количество будет зависеть от тяжести заболевания или травмы, а также от веса и общего состояния субъекта. Обычно, однако, эффективное количество будет варьировать от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 500 мг варианта фактора VII в день для субъекта весом 70 кг, причем чаще применяют дозы от приблизительно 1,0 мг до приблизительно 200 мг варианта фактора VII в день.

Полипептиды VIIa настоящего изобретения обычно могут применяться при тяжелых состояниях заболевания или травмы, то есть при ситуациях с угрозой жизни или потенциальной угрозой жизни. В таких случаях, принимая во внимание сведение к минимуму чужеродных веществ и полное отсутствие иммуногенности вариантов полипептида фактора VII у человека, у лечащего врача может возникнуть желание вводить существенный избыток данных композиций вариантов фактора VII.

При профилактическом применении композиции, содержащие вариант фактора VII изобретения вводят субъекту, чувствительному или иным образом подверженному риску болезненного состояния или травмы для усиления собственной коагуляторной способности субъекта. Такое количество определяется как «профилактически эффективная доза». При профилактическом применении точное количество вновь зависит от состояния здоровья и веса субъекта, однако, доза обычно варьирует от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 500 мг в день для субъекта весом 70 кг, чаще от приблизительно 1,0 мг до приблизительно 200 мг в день для субъекта весом 70 кг.

Можно производить однократное или множественное введение композиций в дозировке и по схеме, выбранной лечащим врачом. Амбулаторным пациентам, нуждающимся в ежедневном поддерживающем уровне, варианты полипептида фактора VII можно вводить продолжительной инфузией с помощью, например, портативной насосной системы.

Локальная доставка варианта фактора VII настоящего изобретения, такая как, например, местное нанесение, может быть осуществлена, например, с помощью спрея, перфузии, катетеров с двойным баллоном, стента, введенных в сосудистые трансплантаты стентов, гидрогелей, используемых для покрытия катетеров с баллоном или других хорошо апробированных способов. В любом случае фармацевтические композиции должны обеспечивать вариант фактора VII в количестве, достаточном для эффективного лечения субъекта.

Настоящее изобретение иллюстрируется далее следующими примерами, которые, однако, не предназначены для ограничения защищаемого объема. Особенности, раскрытые в приведенном выше описании и нижеследующих примерах, как по отдельности, так и в любых их сочетаниях, могут служить предметом осуществления изобретения в его различных формах.

На чертеже показана полная аминокислотная последовательность природного (дикого типа) фактора свертывания VII человека (SEQ ID NO:1).

ПРИМЕРЫ

Используется следующая терминология аминокислотных замен, применяемых в следующих примерах. Первая буква обозначает аминокислоту, естественно присутствующую в соответствующем положении SEQ ID NO:1. Следующее число обозначает положение в SEQ ID NO:1. Вторая буква обозначает другую аминокислоту, заменяющую природную аминокислоту. Примером может служить L305V/K337A-FVII, где лейцин в положении 305 SEQ ID NO:1 заменен валином, а лизин в положении 337 SEQ ID NO:1 заменен аланином, причем обе мутации имеют место в одном и том же варианте фактора VII.

Пример 1

ДНК, кодирующая L305V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII

Конструкции ДНК, кодирующие L305V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, и L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, получали сайт-направленным мутагенезом с применением суперспирализованного двухцепочечного ДНК-вектора с интересующей вставкой и двух синтетических праймеров, содержащих желаемую мутацию. Применяли следующие праймеры:

Для L305V-FVII:

5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3' (SEQ ID NO:2)

5'-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3' (SEQ ID NO:3)

Для K337A-FVII:

5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID NO:4)

5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID NO:5)

Для V158D-FVII:

5'-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID NO:6)

5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3⁷ (SEQ ID NO:7)

Для E296V/M298Q-FVII:

5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID NO:8)

5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID NO:9)

Олигонуклеотидные праймеры, каждый из которых комплементарен противоположным цепям вектора, наращивали при циклическом температурном режиме с помощью Pfu ДНК-полимеразы. После включения праймеров получали мутантную плазмиду, содержащую отдельные разрывы. После термоцикла продукт обрабатывали Dpnl, специфичной в отношении метилированной и полуметилированной ДНК, для переваривания родительской матрицы ДНК и отбора содержащей мутацию синтезированной ДНК.

Процедуры получения конструкции ДНК с помощью полимеразной цепной реакции с применением специфичных праймеров хорошо известны специалистам в данной области техники (сравни PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, США).

Пример 2

Получение L305V/K337A-FVII

Клетки ВНК трансфицировали по существу, как описано ранее (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для получения экспрессии варианта L305V/K337A-FVII. Вариант фактора VII очищали следующим образом:

Кондиционированную среду наносили на 25-мл колонку Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления 5 мМ ЭДТА, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Трис, доведения рН до 8,0 и доведения электропроводности до 10-11 мсим/см путем добавления воды.

Элюирование белка проводили ступенчато от 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, рН 8,0 до 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритон Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие L305V/K337A-FVII, объединяли и наносили на 25-мл колонку, содержащую моноклональное антитело F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Дания), конъюгированное с активированной CNBr Sepharose 4В (Pharmacia Biotech).

Колонку уравновешивали 50 мМ HEPES, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки буфером для уравновешивания и буфером для уравновешивания, содержащим 2 М NaCl, связавшийся материал элюировали буфером для уравновешивания, содержащим 10 мМ ЭДТА вместо CaCl₂. Перед употреблением или хранением добавляли избыток CaCl₂ по отношению к ЭДТА или переносили L305V/K337A-FVII в буфер, содержащий Са²⁺. За выходом на каждой стадии следили путем измерений уровня фактора VII с помощью ИФА, и очищенный белок анализировали с помощью ПАГ-ДДС-Na.

Пример 3

Получение L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII

Клетки ВНК трансфицировали по существу, как описано ранее (Thim et al. (1988) Biochemistry 21, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для получения экспрессии варианта L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII. Вариант фактора VII очищали следующим образом:

Кондиционированную среду наносили на 25-мл колонку Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления 5 мМ ЭДТА, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Трис, доведения рН до 8,0 и доведения электропроводности до 10-11 мсим/см путем добавления воды. Элюирование белка проводили ступенчато от 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, рН 8,0 до 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритон Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, объединяли и наносили на 25-мл колонку, содержащую моноклональное антитело F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Дания), конъюгированное с активированной CNBr Sepharose 4В (Pharmacia Biotech).

Колонку уравновешивали 50 мМ HEPES, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки буфером для уравновешивания и буфером для уравновешивания, содержащим 2 М NaCl, связавшийся материал элюировали буфером для уравновешивания, содержащим 10 мМ ЭДТА вместо CaCl₂. Перед употреблением или хранением добавляли избыток CaCl₂ по отношению к ЭДТА или переносили L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII в буфер, содержащий Са²⁺. За выходом на каждой стадии следили путем измерений уровня фактора VII с помощью ИФА, и очищенный белок анализировали с помощью ПАГ-ДДС-Na.

Пример 4

Получение L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII

Клетки ВНК трансфицировали по существу, как описано ранее (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для получения экспрессии варианта L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII. Вариант фактора VII очищали следующим образом:

Кондиционированную среду наносили на 25-мл колонку Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления 5 мМ ЭДТА, 0,1% Тритона Х-10 0 и 10 мМ Трис, доведения рН до 8,0 и доведения электропроводности до 10-11 мсим/см путем добавления воды. Элюирование белка проводили ступенчато от 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, рН 8,0 до 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритон Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, объединяли и наносили на 25-мл колонку, содержащую моноклональное антитело F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Дания), конъюгированное с активированной CNBr Sepharose 4В (Pharmacia Biotech).

Колонку уравновешивали 50 мМ HEPES, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки буфером для уравновешивания и буфером для уравновешивания, содержащим 2 М NaCl, связавшийся материал элюировали буфером для уравновешивания, содержащим 10 мМ ЭДТА вместо CaCl₂. Перед употреблением или хранением добавляли избыток CaCl₂ по отношению к ЭДТА или переносили L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII в буфер, содержащий Ca²⁺. За выходом на каждой стадии следили путем измерений уровня фактора VII с помощью ИФА, и очищенный белок анализировали с помощью ПАГ-ДДС-Na.

Пример 5

Определение гидролиза in vitro Нативный (дикого типа) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба обозначаемые здесь далее как «фактор VIIa») тестируют в параллельных пробах для прямого сравнения их специфической активности. Тестирование выполняют в планшете для микротитрования (MaxiSorp, Nunc, Дания). Хромогенный субстрат D-Ile-Pro-Arg-п-нитроанилид (S-2288, Chromogenix, Швеция), конечная концентрация 1 мМ, добавляют к фактору VIIa (конечная концентрация 100 нМ) в 50 мМ HEPES, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Поглощение при 405 нм измеряют непрерывно на планшетном ридере SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, США). Поглощение, развившееся в течение 20-минутной инкубации, после вычета поглощения в контрольной лунке, не содержащей фермент, используют для расчета отношения между активностями варианта и фактора VIIa дикого типа:

Отношение=(А_405нм варианта фактора VIIa)/(А_405нм фактора VIIa дикого типа).

Пример 6

Анализ протеолиза in vitro

Нативный (дикого типа) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба обозначаемые здесь далее как «фактор VIIa») тестируют в параллельных пробах для прямого сравнения их специфической активности. Тестирование выполняют в планшете для микротитрования (MaxiSorp, Nunc, Дания). Фактор VIIa (10 нМ) и фактор Х (0,8 мкМ) в 100 мкл 50 мМ HEPES, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, инкубируют в течение 15 мин. Расщепление фактора Х затем останавливают путем добавления 50 мкл 50 мМ HEPES, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Количество образованного фактора Ха измеряют путем добавления хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-п-нитроанилида (S-2765, Chromogenix, Швеция), конечная концентрация 0,5 мМ. Поглощение при 405 нм измеряют непрерывно на планшетном ридере SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, США). Поглощение, развившееся в течение 10 минут, после вычета поглощения в контрольной лунке, не содержащей FVIIa, используют для расчета отношения между протеолитическими активностями варианта и фактора VIIa дикого типа:

Отношение=(А_405нм варианта фактора VIIa)/(А_405нм фактора VIIa дикого типа).

Пример 7

Относительная активность вариантов фактора FVIIa, измеренная в тестах, описанных в примерах 5 и 6

ВариантОтношение в примере 5Отношение в примере 6L305V/K337A-FVII7,26,2L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII6,745L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII11,572FVIIa дикого типа1,01,0

Настоящее изобретение относится к области белковой и генетической инженерии и может быть использовано в медицине. Предложены варианты полипептида фактора коагуляции VII человека, которые характеризуются повышенной, по сравнению с природной формой фактора VIIa, коагулянтной активностью и при этом не нуждаются в индукции тканевым фактором для ее проявления. В структурном отношении новые варианты фактора VII представляют собой аминокислотную последовательность природного белка, содержащую замену L305 Val/Tyr/Ile, и одну или несколько замен из группы, включающей К337 Ala/Gly/Val/Ser//Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; V158 Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; E296 Arg/Lys/Val и М298 Lys/Arg/Gln/Asn. Описаны генетические конструкции и системы экспрессии для получения предложенных вариантов фактора VII с помощью технологии рекомбинантных ДНК, а также применение новых полипептидов в составе фармацевтических композиций, которые могут быть использованы в частности для лечения кровотечений и поддержания системы свертывания крови в норме. 9 н. и 22 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Полипептид фактора VII, содержащий, по крайней мере, следующие замены по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1:

(i) замену L305 Val/Tyr/Ile, и

(ii) одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из К337 Ala/Gly/Val/Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; V158 Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; E296 Arg/Lys/Val, и М298 Lys/Arg/Gln/Asn;

и обладающий активностью, соотношение которой с активностью нативного полипептида фактора VIIa с последовательностью SEQ ID NO:1 составляет, по меньшей мере, 1,25 согласно определению в протеолитическом анализе in vitro.

(i) замену L305 Val/Tyr/Ile, и

(ii) одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из К337 Ala/Gly/Val/Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; VI 58 Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; E296 Arg/Lys/Val, и М298 Lys/Arg/Gln/Asn;

и обладающего активностью, соотношение которой с активностью нативного полипептида фактора Vila с последовательностью SEQ ID NO:1 составляет, по крайней мере, 1,25 согласно определению в протеолитическом анализе in vitro; и фармацевтически приемлемый носитель.

(i) замену L305 Val/Tyr/Ile, и

(ii) одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из К337 Ala/Gly/Val/Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; V158 Ser/Thr/Asn/Gln/Asp/Glu; E296 Arg/Lys/Val, и М298 Lys/Arg/Gln/Asn;

и обладающего активностью, соотношение которой с активностью нативного полипептида фактора VIIa с последовательностью SEQ ID NO:1 составляет, по крайней мере, 1,25, согласно определению в протеолитическом анализе in vitro, для получения лекарственного средства с коагулянтным действием.