ПОЛИПЕПТИД ФАКТОРА VII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ, ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2008 года по МПК C07K14/745 C12N15/12 A61K38/48 C12N9/64 C12N15/57 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым вариантам человеческого фактора свертывания крови VIIa, обладающим коагулирующей активностью, а также к конструкциям нуклеиновых кислот, кодирующим такие варианты, к векторам и к клеткам-хозяевам, содержащим и экспрессирующим указанную нуклеиновую кислоту, к фармацевтическим композициям, к их использованию и к способам лечения.

Предпосылки создания изобретения

Свертывание крови представляет собой процесс, заключающийся в сложном взаимодействии различных компонентов крови (или факторов), которые, в конечном счете, образуют фибриновый сгусток. В общих чертах, компоненты крови, которые участвуют в указанном процессе, называемом «каскадом» реакций свертывания крови, представляют собой ферментативно неактивные белки (проферменты или зимогены), которые превращаются в протеолитические ферменты под действием активатора (который сам является активированным фактором свертывания). Факторы свертывания крови, которые подвергаются такому превращению, обычно называются «активными факторами» и обозначаются добавлением буквы «а» к названию фактора свертывания (например, фактор VIIa).

Инициация процесса гемостаза опосредуется образованием комплекса между тканевым фактором, высвобождающимся в результате повреждения стенок сосудов, и фактором VIIa. Затем, этот комплекс превращает факторы IX и Х в их активные формы. Фактор Ха превращает ограниченное количество протромбина в тромбин на клетках, несущих тканевый фактор. Тромбин активирует тромбоциты и факторы V и VIII с превращением в факторы Va и VIIIa, и оба этих кофактора в последующем процессе приводят к полной тромбиновой «вспышке». Этот процесс включает образование фактора Ха под действием фактора IXa (в комплексе с фактором VIIIa) и происходит на поверхности активированных тромбоцитов. И наконец, тромбин превращает фибриноген в фибрин, что приводит к образованию фибринового сгустка. В последние годы было обнаружено, что фактор VII и тканевый фактор являются главными инициаторами свертывания крови.

Фактор VII представляет собой гликопротеин плазмы, который циркулирует в кровотоке в следовых количествах в виде одноцепочечного зимогена. Этот зимоген является каталитически неактивным. Одноцепочечный фактор VII может быть превращен в двухцепочечный фактор VIIa под действием фактора Ха, фактора XIIa, фактора IXa, фактора VIIa или тромбина in vitro. Очевидно, что фактор Ха является главным физиологическим активатором фактора VII. Подобно некоторым другим белкам плазмы, участвующим в гемостазе, активность фактора VII зависит от витамина К, необходимого для гамма-карбоксилирования множества остатков глутаминовой кислоты, которые образуют кластер вблизи амино-конца данного белка. Эти гамма-карбоксилированные глутаминовые кислоты необходимы для индуцируемого ионами металла взаимодействия фактора VII с фосфолипидами. Превращение зимогена фактора VII в активированную двухцепочечную молекулу происходит путем расщепления внутренней пептидной связи Arg₁₅₂-Ile₁₅₃. В присутствии тканевого фактора, фосфолипидов и ионов кальция двухцепочечный фактор VIIa быстро активирует фактор Х или фактор IX путем ограниченного протеолиза.

Часто бывает необходимо стимулировать или усиливать каскад реакций свертывания крови у индивидуума. Фактор VIIa используется для лечения расстройств, характеризующихся склонностью к кровоточивости и обусловленных рядом причин, таких как дефициты факторов свертывания крови (например, гемофилия А и В или дефицит факторов свертывания XI или VII) или присутствие ингибиторов факторов свертывания крови. Фактор VIIa также используется для снижения повышенной кровоточивости, которая имеет место у индивидуумов с нормально функционирующей системой свертывания крови (где не наблюдается дефицита факторов свертывания или отсутствуют ингибиторы, воздействующие на любой из факторов свертывания). Такая кровоточивость может быть, например, обусловлена нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью Виллебранда. Кровоточивость является также главной проблемой при хирургических операциях и других формах повреждения тканей.

Европейский патент №200421 (ZymoGenetics) относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий фактор VII, и к рекомбинантной экспрессии фактора VII в клетках млекопитающего.

В работе Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) описаны варианты фактора VII, где каждый из Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 или Lys337 были заменены Ala.

В работе Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474) описаны варианты FVIIa, в которых остатки 316-320 были делетированы либо остатки 311-322 были заменены соответствующими остатками трипсина.

Однако, пока еще остается актуальной необходимость в получении вариантов фактора VIIa, которые обладают коагулирующей активностью; вариантов, которые обладают высокой активностью и могут быть введены в относительно низких дозах; и вариантов, которые не продуцируют нежелательных побочных эффектов, таких как системная активация каскада реакций свертывания крови и кровотечение соответственно, ассоциируемых с традиционной терапией.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептидам фактора свертывания крови VIIa, обладающим коагулирущей активностью.

В своем первом аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 157 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala157).

Во втором своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 337 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala337).

В своем третьем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Asp в положении 334 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala334).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Ser в положении 336 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala336).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Val в положении 158 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala158).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Glu в положении 296 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala296).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или к его варианту, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala298).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где одна аминокислота, независимо выбранная из группы, состоящей из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, при условии, что указанным вариантом не являются FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где две аминокислоты, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где три аминокислоты, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где четыре аминокислоты, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где пять аминокислот, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где шесть аминокислот, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к полипептиду фактора VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где аминокислоты, состоящие из Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к варианту фактора свертывания крови VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот; при условии, что указанным вариантом не являются FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298).

Используемый здесь термин «FVII(Ala157)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Lys в положении 157 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

Используемый здесь термин «FVII(Ala337)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Lys в положении 337 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

Используемый здесь термин «FVII(Ala334)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Asp в положении 334 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

Используемый здесь термин «FVII(Ala336)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Ser в положении 336 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

Используемый здесь термин «FVII(Ala158)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Val в положении 158 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

Используемый здесь термин «FVII(Ala296)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Glu в положении 296 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

Используемый здесь термин «FVII(Ala298)» означает вариант фактора свертывания крови VII с последовательностью SEQ ID NO:1, где Met в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен аланином. Этот термин, например, не включает варианты фактора свертывания VII, где две или несколько аминокислот в положениях SEQ ID NO:1 заменены другими аминокислотами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора VII настоящего изобретения.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант фактора VII.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, включающему конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант FVIIa.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей указанную конструкцию нуклеиновой кислоты или указанный вектор.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к трансгенному животному, содержащему и экспрессирующему указанную конструкцию нуклеиновой кислоты.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к трансгенному растению, содержащему и экспрессирующему указанную конструкцию нуклеиновой кислоты.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования полипептида фактора VII настоящего изобретения, где указанный способ предусматривает культивирование клетки, включающей конструкцию нуклеиновой кислоты в подходящей культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию указанной конструкции нуклеиновой кислоты, и выделение полученного полипептида из этой культуральной среды.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования варианта фактора VII настоящего изобретения, где указанный способ предусматривает культивирование клетки, включающий конструкцию нуклеиновой кислоты в подходящей культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию указанной конструкции нуклеиновой кислоты, и выделение полученного полипептида из этой культуральной среды.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования полипептида фактора VII, где указанный способ предусматривает выделение указанного полипептида из молока, продуцируемого указанным трансгенным животным.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования варианта фактора VII, где указанный способ предусматривает выделение указанного варианта из молока, продуцируемого указанным трансгенным животным.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования полипептида фактора VII, где указанный способ предусматривает культивирование клетки указанного трансгенного растения, содержащего указанную конструкцию нуклеиновой кислоты, и выделение указанного полипептида из полученного растения.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования варианта фактора VII, где указанный способ предусматривает культивирование клетки указанного трансгенного растения, содержащего указанную конструкцию нуклеиновой кислоты, и выделение указанного варианта из полученного растения.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 157 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 337 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Asp в положении 334 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Ser в положении 336 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Val в положении 158 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Glu в положении 296 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его вариант, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант фактора свертывания VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот; и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 157 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 337 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Asp в положении 334 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Ser в положении 336 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Val в положении 158 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Glu в положении 296 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию варианта фактора свертывания VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 157 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Lys в положении 337 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Asp в положении 334 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Ser в положении 336 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Val в положении 158 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Glu в положении 296 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества полипептида фактора VII, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или его варианта, где, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения эпизодического кровотечения или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества варианта фактора свертывания VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей вариант фактора свертывания VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, при условии, что указанным вариантом не являются FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298), и необязательно фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию варианта фактора свертывания VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, при условии, что указанным вариантом не является FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298), в целях получения лекарственного средства для лечения эпизодического кровотечения или в целях усиления нормальной системы гемостаза.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения и профилактики расстройств, характеризующихся склонностью к кровотечениям, или усиления нормальной системы гемостаза у индивидуума, где указанный способ предусматривает введение указанному индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества варианта фактора свертывания VII, где один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, при условии, что указанным вариантом не являются FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298).

В одном из вариантов осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Lys в положении 157 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Lys в положении 337 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Asp в положении 334 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Ser в положении 336 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Val в положении 158 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Glu в положении 296 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором аминокислота, соответствующая Met в положении 298 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором, по крайней мере, одна аминокислота в остальных положениях в протеазном домене заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором, по большей мере, 20 дополнительных аминокислот в остальных положениях в протеазном домене заменены другими аминокислотами.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из положений 159-170 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из положений 290-312 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором, по крайней мере, одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из положений 330-339 SEQ ID NO:1, заменена другой аминокислотой.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Lys в положении 157 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Lys в положении 337 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Asp в положении 334 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Ser в положении 336 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Gly и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Val в положении 158 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Glu в положении 296 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Arg, Lys и Val.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, в котором указанная аминокислота Met в положении 298 SEQ ID NO:1 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, Gln и Asn.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, где указанная аминокислота заменена другой аминокислотой, которая может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, который представляет собой полипептид фактора VII человека.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, который представляет собой полипептид фактора VIIa человека.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, независимо выбранный из группы, состоящей из [E296V]-FVII, [M298Q]-FVII и [S336G]-FVII.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является полипептид, независимо выбранный из группы, состоящей из [V158T/M298Q]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII, [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII и [V158D/M298K]-FVII.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является [V158D/E296V/M298Q]-FVII.

В другом варианте осуществления изобретения, полипептидом фактора VII является [V158D/E296V/M298Q/К337А]-FVII.

В другом варианте осуществления изобретения, вариантами фактора VII являются варианты, в которых один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот и, необязательно, где один или несколько дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, при условии, что указанным вариантом не являются FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298).

В одном варианте осуществления изобретения, вариантами фактора VII являются варианты, в которых один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Asp в положении 334, Ser в положении 336, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 - заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, при условии, что указанным вариантом не являются FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) или FVII(Ala298).

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Lys в положении 157 и Lys в положении 337 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков: Lys в положении 157, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 и один или несколько из остатков Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Lys в положении 157, Asp в положении 334 и Ser положении 336 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 и один или несколько остатков Asp в положении 334 и Ser положении 336 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Lys в положении 337, Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 337 и один или несколько из остатков Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met положении 298 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Lys в положении 337, Asp в положении 334 и Ser в положении 336 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 337 и один или несколько из остатков Asp в положении 334 и Ser в положении 336 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Val в положении 158, Glu в положении 296, Met в положении 298 SEQ ID NO:1, и один или несколько из остатков Asp в положении 334 и Ser в положении 336 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 SEQ ID NO:1 заменен другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 337 SEQ ID NO:1 заменен другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Val в положении 158, Glu в положении 296 и Met в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько из остатков Asp в положении 334 и Ser в положении 336 SEQ ID NO:1 заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 заменен Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp или Glu; и/или остаток Lys в положении 337 заменен Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp или Glu; и/или остаток Val в положении 158 заменен Ser, Thr, Asn, Gln, Asp или Glu; и/или остаток Glu в положении 296 заменен Arg, Lys или Val; и/или остаток Met в положении 298 заменен Arg, Lys Gln или Asn; и/или остаток Asp в положении 334 заменен Glu, и/или остаток Ser в положении 336 заменен Gly.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157, или остаток Lys в положении 337, или остаток Asp в положении 334, или остаток Ser в положении 336 представляет собой лишь аминокислотный остаток, который был заменен.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Val в положении 158, остаток Glu в положении 296 и остаток Met в положении 298 представляют собой лишь аминокислотные остатки, которые были заменены.

В другом варианте осуществления изобретения, отношение активности варианта настоящего изобретения к активности нативного полипептида фактора VII, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по крайней мере, примерно 1,25 при тестировании, описанном в разделе настоящей заявки «Гидролизный анализ in vitro». В другом варианте осуществления изобретения, указанное отношение составляет, по крайней мере, примерно 2,0; а в другом варианте, оно составляет, по крайней мере, примерно 4,0.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Gln в положении 312 протеазного домена не заменен.

В другом варианте осуществления изобретения, рекомбинантной клеткой-хозяином является клетка млекопитающего. В другом варианте настоящего изобретения, указанную клетку выбирают из группы, состоящей из клеток СНО, клеток ВНК и клеток НЕК.

В другом варианте осуществления изобретения, по большей мере, 20 дополнительных аминокислотных остатков в остальных положениях протеазного домена (в положениях 153-406) заменены. В одном варианте осуществления изобретения, по большей мере, 15 дополнительных аминокислотных остатков заменены; в другом варианте осуществления изобретения, по большей мере, 10 аминокислотных остатков заменены; а в еще одном варианте осуществления изобретения, по большей мере, 5 аминокислотных остатков заменены.

В другом варианте осуществления изобретения, один или несколько аминокислотных остатков в положениях 157, 337, 158, 296, 298, 334 или 336 представляет(ют) собой лишь замененный(е) аминокислотный(е) остаток(ки).

В другом варианте осуществления изобретения, один или оба остатка Lys в положении 157 и в положении 337 заменен(ы) нейтральным аминокислотным остатком, либо один из этих остатков заменен отрицательно заряженным аминокислотным остатком, либо один остаток Lys заменен нейтральным аминокислотным остатком, а другой остаток Lys заменен отрицательно заряженным аминокислотным остатком.

В другом варианте осуществления изобретения, один или оба остатка Asp в положении 334 и Ser в положении 336 заменен(ы) аминокислотным остатком, который способен образовывать водородные связи и/или солевой мостик, либо один или оба из указанных остатков заменен(ы) небольшим аминокислотным остатком.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 и/или остаток Lys в положении 337 представляют собой лишь такие аминокислотные остатки, которые были заменены. В одном из вариантов осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 заменен. В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 337 заменен.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Val в положении 158 и/или остаток Met в положении 298 являются лишь такими аминокислотными остатками, которые были заменены.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Asp в положении 334 и/или остаток Ser в положении 336 являются лишь такими аминокислотными остатками, которые были заменены.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 заменен аминокислотным остатком, выбранным из списка, состоящего из Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp и Gln. В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 157 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 337 заменен аминокислотным остатком, выбранным из списка, состоящего из Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp или Gln. В другом варианте осуществления изобретения, остаток Lys в положении 337 заменен Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp или Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Val в положении 158 заменен аминокислотным остатком, выбранным из списка, состоящего из Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp и Gln. В другом варианте осуществления изобретения, остаток Val в положении 158 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Glu в положении 296 заменен аминокислотным остатком, выбранным из списка, состоящего из Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp или Gln. В другом варианте осуществления изобретения, указанный остаток заменен Arg, Lys или Val.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Met в положении 298 заменен аминокислотным остатком, выбранным из списка, состоящего из Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Glu, Asp или Gln. В другом варианте осуществления изобретения, указанный остаток заменен Lys, Arg, Gln или Asn.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Asp в положении 334 заменен Gly и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, остаток Ser в положении 336 заменен Gly и Glu.

В другом варианте осуществления изобретения, отношение активности варианта настоящего изобретения к активности нативного полипептида фактора VII, представленного в SEQ ID NO:1, составляет, по крайней мере, примерно 1,25 при тестировании, описанном в разделе «Гидролизный анализ in vitro» (пример 11). В другом варианте осуществления изобретения, указанное отношение составляет, по крайней мере, примерно 2,0; а в еще одном варианте, оно составляет, по крайней мере, примерно 4,0.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к вариантам FVIIa, которые, по сравнению с нативным FVIIa, обладают повышенной активностью, не зависящей от тканевого фактора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, указанная повышенная активность не сопровождается изменениями специфичности к субстрату. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, связывание указанных вариантов с тканевым фактором не нарушено (по сравнению с FVIIa дикого типа); в другом варианте осуществления изобретения, указанные варианты, при их связывании с тканевым фактором, обладают, по крайней мере, активностью фактора VIIa дикого типа.

В другом варианте осуществления изобретения, в указанных вариантах фактора VII, помимо уже имеющихся замен аминокислот в положениях 157, 158, 296, 298, 334, 336 или 337 и необязательных замен аминокислот в протеазном домене, также имеются некоторые замены аминокислот в N-концевом Gla-домене (остатки 1-37). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, один или несколько аминокислотных остатков фактора VII в положениях 10 и 32 (относящихся к SEQ ID NO:1) заменен(ы) другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, аминокислотный остаток Pro в положении 10 заменен Gln, Arg, His, Gln, Asn или Lys; и/или аминокислотный остаток Lys в положении 32 заменен Glu, Gln или Asn.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлена полная аминокислотная последовательность нативного человеческого фактора свертывания крови VII (SEQ ID NO:1).

В настоящем описании, аминокислоты представлены аббревиатурами, указанными в таблице 1 и утвержденными Комиссией IUPAC-IUB по Биохимической номенклатуре (CBN). Аминокислота, а также ее изомеры, представленные нижеуказанными названиями или аббревиатурами, имеет свою природную L-форму, если это не оговорено особо. Кроме того, левый и правый концы аминокислотной последовательности пептида, являются, соответственно, N- и С-концами, если это не оговорено особо.

Аббревиатуры для аминокислотТаблица 1АминокислотаТрехбуквенный кодОднобуквенный кодГлицинGlyGПролинProРАланинAlaАВалинValVЛейцинLeuLИзолейцинIleIМетионинMetМЦистеинCysСФенилаланинPheFТирозинTyrYТриптофанTrpWГистидинHisНЛизинLysКАргининArgRГлутаминGlnQАспарагинAsnNГлутаминовая кислотаGluЕАспарагиновая кислотаAspDСеринSerSТреонинThrТ

Было установлено, что варианты FVIIa, в которых, по крайней мере, один из аминокислотных остатков Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 или Lys337 (и необязательно один или несколько дополнительных остатков) заменен другим аминокислотным остатком, обладают коагулирующей активностью.

Эти остатки, очевидно, расположены в области, которая влияет на инсерцию аминоконца протеазного домена и, тем самым, на образование каталитически активной конформации фактора VIIa, которая зависит от солевого мостика, расположенного между концевой аминогруппой Ile153 и боковой цепью Asp343. Эти замены могут подавлять электростатическое отталкивание, добавлять водородные связи или каким-либо иным способом облегчать инсерцию аминоконца.

Благодаря более высокой собственной активности описываемого варианта фактора VIIa, по сравнению с нативным FVIIa, ожидается, что его более низкая доза будет адекватной для получения функционально адекватной концентрации в активном центре, а поэтому эту более низкую дозу можно вводить индивидууму, страдающему эпизодическими кровотечениями или нуждающемуся в усилении нормальной системы гемостаза.

Как вкратце обсуждалось выше, авторы настоящего изобретения предполагают, что путем замены одного или нескольких из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Val в положении 158, Glu в положении 296, Met в положении 298, Asp в положении 334 и Ser в положении 336, фактор VIIa будет спонтанно приобретать более активную конформацию, которая в нормальных условиях должна индуцироваться тканевым фактором. Такие варианты фактора VIIa обладают присущей им активностью, которая может быть терапевтически использована в ситуациях, где прокоагулирующая активность не зависит от тканевого фактора (генерирования фактора Ха на поверхности тромбоцита) так, как, например, происходит при введении высоких доз NovoSeven®.

Помимо эффекта, получаемого в результате замены одного или нескольких из остатков: Lys в положении 157, Lys в положении 337, Val в положении 158, Glu в положении 296, Met в положении 298, Asp в положении 334 и Ser в положении 336, замена дополнительных аминокислотных остатков в протеазном домене может дополнительно способствовать образованию активной конформации этой молекулы. Однако, очевидно, что наиболее выраженные эффекты будут наблюдаться в том случае, когда вышеупомянутые мутации введены в непосредственной близости (в последовательности или в трехмерном пространстве) от этих семи остатков.

Замена нескольких аминокислотных остатков в N-концевом Gla-домене (остатки 1-37) фактора VII может приводить к получению белка, имеющего значительно более высокую аффинность к мембранным фосфолипидам, таким как мембранные фосфолипиды клеток, несущих тканевый фактор, или тромбоцитов. Так, например, вышеупомянутые варианты фактора VII, помимо уже имеющихся замен аминокислот в положениях 157, 158, 296, 298, 334, 336 или 337 и необязательных замен аминокислотных остатков в некоторых положениях протеазного домена, также имеют некоторые замены аминокислотных остатков в N-концевом Gla-домене, которые приводят к получению белка, имеющего повышенную активность, а также повышенную аффинность к мембранным фосфолипидам по сравнению с нативным фактором VII. Предпочтительно, аминокислотные остатки в положениях 10 и 32 (относящиеся к SEQ ID NO:1) фактора VII могут быть заменены другим аминокислотным остатком, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот. Примерами предпочтительных замен аминокислотных остатков, вводимых в вышеупомянутые положения, являются: замена аминокислотного остатка Pro в положении 10 аминокислотными остатками Gln, Arg, His, Gln, Asn или Lys; и/или замена аминокислотного остатка Lys в положении 32 аминокислотными остатками Glu, Gln или Asn.

Могут также рассматриваться и другие замены в Gla-домене, основанные на различных аффинностях к фосфолипидам и последовательностях витамин К-зависимых белков плазмы.

В контексте настоящего изобретения, используемые трехбуквенные сокращения аминокислот имеют свое традиционное значение. Если это не оговорено особо, то вышеупомянутыми аминокислотами являются L-аминокислоты.

Термин «N-концевой GLA-домен» означает аминокислотную последовательность 1-37 FVII.

Термин «протеазный домен» означает аминокислотную последовательность 153-406 FVII (тяжелой цепи FVIIa).

Трехбуквенное обозначение «GLA» означает 4-карбоксиглутаминовую кислоту (γ-карбоксиглутамат).

Термин «нейтральный аминокислотный остаток» (при рН 6-8) означает аминокислоты, выбранные из списка, состоящего из Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln.

Термин «небольшая аминокислота» означает аминокислоты, выбранные из Gly, Glu и Ala.

Термин «отрицательно заряженный аминокислотный остаток» (при рН 6-8) означает аминокислоты, выбранные из Asp и Glu.

Используемый здесь термин «полипептид фактора VII» означает любой белок, содержащий аминокислотную последовательность 1-406 нативного человеческого фактора VII (SEQ ID NO:1) или его варианты. Этот термин также включает, но не ограничивается ими, человеческий фактор VII, человеческий фактор VIIa и их варианты.

Используемый здесь термин «фактор VII» означает неактивную одноцепочечную молекулу зимогена фактора VII, а также активированную двухцепочечную молекулу фактора VII (фактора VIIa). Этот термин включает белки, имеющие аминокислотную последовательность 1-406 нативного человеческого фактора VII или фактора VIIa. Этот термин также включает белки, имеющие слегка модифицированную аминокислотную последовательность, например, модифицированный N-конец, имеющий делеции или добавления N-концевых аминокислот, при условии, что эти белки, в основном, сохраняют активность фактора VIIa. Используемый здесь термин «фактор VIIa» или «FVIIa» означает продукт, состоящий из активированной формы (фактора VIIa). В вышеуказанном определении «фактор VII» или «фактор VIIa» также означают природные аллельные варианты, которые могут присутствовать у индивидуума и передаваться от одного индивидуума к другому. Кроме того, степень и локализация гликозилирования или других пострансляционных модификаций могут варьироваться в зависимости от выбранных клеток-хозяев и окружающей среды клетки-хозяина.

Используемые здесь термины «вариант» или «варианты» означают фактор VII, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, где одна или несколько аминокислот родительского белка заменены другой аминокислотой, и/или одна или несколько аминокислот родительского белка делетированы, и/или одна или несколько аминокислот инсертированы в этот белок, и/или одна или несколько аминокислот добавлены к этому родительскому белку. Такое добавление может быть осуществлено либо у N-конца, либо у С-конца родительского белка, либо на обоих концах. В этом определении, «вариант» или «варианты» обладают активностью FVII в его активированной двухцепочечной молекулярной форме. В одном из вариантов осуществления изобретения, указанный вариант на 65% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В еще одном варианте осуществления изобретения, указанный вариант на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения, указанный вариант на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения, указанный вариант на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO:1.

Используемый здесь термин «конструкция нуклеиновой кислоты» означает любую молекулу нуклеиновой кислоты, происходящую от кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК, полусинтетической ДНК, РНК или из смешанного источника. Термин «конструкция» означает сегмент нуклеиновой кислоты, который может быть одно- или двухцепочечным и который может быть получен на основе полной или неполной природной нуклеотидной последовательности, кодирующей нужный полипептид. Такая конструкция может, но необязательно, содержать другие сегменты нуклеиновой кислоты. Аналогичным образом, термин «аминокислотный остаток, который может кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот» охватывает аминокислотные остатки, которые могут кодироваться конструкциями нуклеиновых кислот, определенными выше, то есть такие аминокислоты, как Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp и Gln.

Используемый здесь термин «другая аминокислота» означает аминокислоту, отличающуюся от природной аминокислоты, присутствующей в данном положении. Этот термин включает, но не ограничивается ими, аминокислоты, которые могут кодироваться конструкцией нуклеиновой кислоты. Указанная другая аминокислота предпочтительно имеет природную L-форму и может кодироваться конструкцией нуклеиновой кислоты. Конкретным примером является L-цистеин (Cys).

В контексте настоящего изобретения, термин «лечение» означает как предупреждение возможного кровотечения, например, при хирургической операции, так и регуляцию уже имеющегося кровотечения, например, при травмах, в целях подавления или минимизации этого кровотечения. Термин «лечение» также означает профилактическое введение варианта фактора VIIa настоящего изобретения.

Используемый здесь термин «активность» означает способность полипептида фактора VII или его варианта превращать свой субстрат, а именно фактор Х, в активный фактор Ха. Активность полипептида фактора VII может быть измерена, как описано в разделе «Протеолитический анализ in vitro». Термин «собственная активность» также включает способность генерировать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Термин «усиление нормальной системы гемостаза» означает увеличение способности генерировать тромбин.

Используемый здесь термин «расстройство, характеризующееся склонностью к кровотечениям» означает любой врожденный, приобретенный или индуцированный дефицит, клеточной или молекулярной природы, который проявляется кровотечениями. Примерами являются дефицит фактора свертывания крови (например, гемофилия А и В или дефицит факторов свертывания XI или VII), ингибирование факторов свертывания крови, нарушение функции тромбоцитов, тромбоцитопения или болезнь фон Виллебранда.

Термин «эпизодическое кровотечение» означает нерегулируемое и избыточное кровотечение, которое является главной проблемой при хирургических операциях и других формах повреждения тканей. Нерегулируемая и повышенная кровоточивость может наблюдаться у индивидуумов, имеющих нормальную систему свертывания крови, и у индивидуумов с расстройствами, характеризующимися нарушением свертывания крови и склонностью к кровотечениям. Дефицит факторов свертывания крови (гемофилия А и В, дефицит факторов свертывания XI или VII) или присутствие ингибиторов факторов свертывания крови могут быть причиной расстройств, выражающихся в повышенной кровоточивости. Повышенная кровоточивость также наблюдается у индивидуумов с нормальным функционированием системы свертывания крови (при отсутствии дефицита факторов свертывания или ингибиторов любых факторов свертывания крови) и может быть вызвана нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. В этих случаях, кровотечения могут быть подобны кровотечениям, вызываемым гемофилией, поскольку в системе гемостаза, как и при гемофилии, отсутствуют или присутствуют, в основном, аномальные «соединения» свертывания (такие как тромбоциты или белок фактора фон Виллебранда), которые являются главной причиной кровотечений. У индивидуумов, у которых наблюдаются обширные поражения тканей, вызванные хирургической операцией или тяжелыми травмами, нормальный механизм гемостаза может подавляться требованием немедленного гемостаза, а поэтому у них могут возникать кровотечения, несмотря на нормальный механизм гемостаза. Достижение достаточного гемостаза также проблематично в случае, когда кровотечение происходит в таких органах, как головной мозг, область внутреннего уха и глаза, где возможности для хирургического гемостаза являются ограниченными. Те же самые проблемы могут возникать при взятии биопсии из различных органов (печени, легкого, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также лапароскопии. Во всех этих ситуациях, достаточно трудно обеспечить гемостаз хирургическими методами (наложением швов, зажимов и т.п.), а также его трудно достичь в случае диффузного кровотечения (геморрагического гастрита и профузного кровотечения матки). Острое и профузное кровотечения могут также возникать у индивидуумов при антикоагулятной терапии, у которых нарушение гемостаза было индуцировано данной терапией. Таким индивидуумам необходимо хирургическое вмешательство в случае, когда антикоагулирующее действие должно быть быстро устранено. Радикальная залобковая простатоэктомия представляет собой стандартную процедуру, проводимую у пациентов с локализованным раком предстательной железы. Эта операция часто осложняется значительной, а иногда и массивной потерей крови. Значительная потеря крови при простатоэктомии связана, главным образом, с осложненной анатомической ситуацией, с васкуляризованными участками с различной степенью плотности, которые являются труднодоступными для хирургического гемостаза, что может приводить к диффузному кровотечению на обширных участках. Другие ситуации, которые могут создавать проблемы в случае недостаточного гемостаза, возникают у индивидуумов с нормальным механизмом гемостаза в случае, когда они подвергаются антикоагулянтной терапии для предупреждения тромбоэмболического заболевания. Такая терапия может предусматривать введение гепарина, других форм протеогликанов, варфарина или других форм антагонистов витамина К, а также аспирина и других ингибиторов агрегации тромбоцитов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, указанное кровотечение ассоциируется с гемофилией. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с гемофилией, вызванной присутствием ингибиторов. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с тромбоцитопенией. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с болезнью фон Виллебранда. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с серьезным повреждением ткани. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с тяжелыми травмами. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с хирургической операцией. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с лапароскопией. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с геморрагическим гастритом. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечением является профузное кровотечение матки. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение происходит в органах с ограниченной возможностью для механического гемостаза. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение происходит в головном мозге, в области внутреннего уха или в глазах. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется со взятием образцов для биопсии. В другом варианте осуществления изобретения, кровотечение ассоциируется с антикоагулянтной терапией.

Используемый здесь термин «индивидуум» означает любое животное, а в частности млекопитающее, такое как человек, и этот термин, при необходимости, может быть заменен термином "пациент".

Используемый здесь термин "подходящая культуральная среда" означает среду, содержащую питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста клеток и экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант фактора VII настоящего изобретения.

Получение вариантов фактора VII

Описанные здесь варианты фактора VII могут быть получены методами рекомбинантных нуклеиновых кислот. В общих чертах, клонированную последовательность нуклеиновой кислоты фактора VII дикого типа модифицируют так, чтобы она кодировала нужный белок. Затем эту модифицированную последовательность встраивают в экспрессирующий вектор, которым, в свою очередь, трансформируют или трансфецируют клетки-хозяева. Предпочтительными клетками-хозяевами являются высшие эукариотические клетки, а в частности, культивированные клетки млекопитающих. Полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности человеческого фактора VII являются известными (см. патент США №4784950, в котором описано клонирование и экспрессия рекомбинантного человеческого фактора VII). Последовательность коровьего фактора VII описана в работе Takeya et al. J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988).

Модификации аминокислотной последовательности могут быть осуществлены различными методами. Модификация последовательности нуклеиновой кислоты может быть осуществлена посредством сайт-специфического мутагенеза. Техника сайт-специфического мутагенеза хорошо известна специалистам и описана, например, Zoller & Smith (DNA 3:479-488, 1984) или в работе "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, pp.61-88. Таким образом, с использованием нуклеотидных и аминокислотных последовательностей фактора VII могут быть введены нужные модификации. Аналогичным образом, процедуры получения ДНК-конструкции посредством полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров хорошо известны специалистам (см. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).

Конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант фактора VII настоящего изобретения, может быть соответствующим образом получена из геномной ДНК или кДНК, например, путем приготовления библиотеки геномных ДНК или кДНК, и скрининга на ДНК-последовательности, кодирующие весь полипептид или его часть, посредством гибридизации с использованием синтетических олигонуклеотидных зондов в соответствии со стандартной техникой (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Указанная конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант фактора VII, может быть также получена синтетически стандартными методами, например фосфорамидитным методом, описанным Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, или методом, описанным Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805. В соответствии с фосфорамидитным методом, олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящие векторы.

Кроме того, указанная конструкция нуклеиновой кислоты может быть получена из смеси синтетической и геномной ДНК, смеси синтетической ДНК и кДНК или смеси геномной ДНК и кДНК путем лигирования фрагментов синтетической ДНК, геномной ДНК или кДНК (если необходимо), фрагментов, соответствующих различным частям целой конструкции нуклеиновой кислоты, в соответствии со стандартной техникой.

Указанной конструкцией нуклеиновой кислоты, предпочтительно, является ДНК-конструкция.

ДНК-последовательности, используемые в продуцировании вариантов фактора VII настоящего изобретения, обычно кодируют пре-про-полипептид на аминоконце фактора VII для получения соответствующего посттрансляционного процессинга (например, гамма-карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты) и секреции из клетки-хозяина. Указанный пре-про-полипептид может происходить от фактора VII или другого витамин К-зависимого белка плазмы, такого как фактор IX, фактор Х, протромбин, белок С или белок S. При этом следует отметить, что в аминокислотной последовательности вариантов фактора VII могут быть сделаны дополнительные модификации, при условии, что эти модификации не будут оказывать значительного воздействия на коагулирующую способность данного белка. Так, например, варианты фактора VII могут быть также модифицированы в сайте активации расщепления в целях ингибирования превращения зимогена фактора VII в его активную двухцепочечную форму, как в общих чертах описано в патенте США №5288629.

Экспрессирующие векторы, используемые для экспрессии вариантов фактора VIIa, содержат промотор, способный регулировать транскрипцию клонированного гена или кДНК. Предпочтительными промоторами, используемыми в культивированных клетках млекопитающих, являются вирусные промоторы и клеточные промоторы. Вирусными промоторами являются промотор SV40 (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) и промотор CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985). Особенно предпочтительным вирусным промотором является главный поздний промотор аденовируса 2 (Kaufman & Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982). Клеточными промоторами являются промотор мышиного гена каппа (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) и промотор мышиного V_н (Loh et al., Cell, 33:85-93, 1983). Особенно предпочтительным клеточным промотором является мышиный промотор металлотионеина-I (Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983). Экспрессирующие векторы могут также содержать серию сайтов РНК-сплайсинга, расположенных ниже этого промотора и выше сайта инсерции для самой последовательности фактора VII. Предпочтительные сайты РНК-сплайсинга могут быть получены из аденовируса и/или генов иммуноглобулина. В экспрессирующих векторах также присутствует сигнал полиаденилирования, расположенный ниже сайта инсерции. Особенно предпочтительными сигналами полиаденилирования являются сигнал раннего или позднего полиаденилирования SV40 (Kaufman & Sharp, там же), сигнал полиаденилирования из области Elb аденовируса 5, терминатор гена человеческого гормона роста (DeNoto et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) или сигнал полиаденилирования гена человеческого фактора VII или гена коровьего фактора VII. Экспрессирующие векторы могут также содержать некодирующую лидерную вирусную последовательность, такую как трехкомпонентную лидерную последовательность аденовируса 2, расположенную между промотором и сайтами РНК-сплайсинга, и энхансерные последовательности, такие как энхансер SV40.

Клонированные ДНК-последовательности вводят в культивированные клетки млекопитающих, например, путем опосредованной фосфатом кальция трансфекции (Wigler et al., Cell. 14:725-732, 1978; Corsaro & Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616; 1981; Graham & Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) или электропорации (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Для идентификации и отбора клеток, экспрессирующих экзогенную ДНК, ген, который сообщает селективный фенотип (селективный маркер), обычно вводят в клетки вместе с нужным геном или нужной кДНК. Предпочтительными селективными маркерами являются гены, сообщающие резистентность к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Указанный селективный маркер может представлять собой амплифицируемый селективный маркер. Предпочтительным амплифицируемым селективным маркером является последовательность дигидрофолатредуктазы (DHFR). Обзорное описание селективных маркеров приводится в работе Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). Подходящие селективные маркеры могут быть легко выбраны самим специалистом.

Селективные маркеры могут быть введены в клетку одновременно с нужным геном на отдельных плазмидах, либо они могут быть введены на одной и той же плазмиде. Если селективный маркер и нужный ген присутствуют на одной и той же плазмиде, то они могут находиться под контролем разных промоторов или одного и того же промотора, причем в последнем случае продуцируется бицистронная информационная РНК. Конструкции такого типа известны специалистам (см., например, Levinson & Simonsen, патент США №4713339). При этом в смесь, вводимую в клетки, может также оказаться предпочтительным добавить дополнительную ДНК, известную как "ДНК-носитель".

После поглощения клетками ДНК их культивируют в соответствующей культуральной среде, обычно в течение 1-2 дней, для инициации экспрессии нужного гена. Средой, используемой для культивирования клеток, может быть любая стандартная среда, подходящая для культивирования клеток-хозяев, такая как минимальная или комплексная среда, содержащая соответствующие добавки. Подходящие среды могут быть закуплены у коммерческих поставщиков, либо они могут быть получены в соответствии с уже известными методами (например, среды, указанные в каталогах Американской коллекции типовых культур). Эти среды получают методами, известными специалистам (см., например, описания бактерий и дрожжей; Bennett, J.W. & LaSure L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Культуральные среды обычно включают источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, незаменимые сахара, витамины, соли, фосфолипиды, белки и факторы роста. Для продуцирования гамма-карбоксилированных вариантов фактора VII, эта среда может содержать витамин К, предпочтительно, в концентрации примерно от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. Затем осуществляют отбор клеток, которые стабильно экспрессируют селективный маркер, на их рост в присутствии лекарственного средства. Для клеток, которые были трансфецированы амплифицируемым селективным маркером, концентрация лекарственного средства может быть увеличена для отбора на повышенное число копий клонированных последовательностей и, тем самым, на повышенные уровни экспрессии. Затем, клоны стабильно трансфецированных клеток скринируют на экспрессию нужного варианта фактора VII.

Предпочтительными клеточными линиями млекопитающих являются клеточная линия СНО (АТСС CCL 61), клеточная линия COS-1 (ATCC CRL 1650), клеточная линия почек детеныша хомячка (ВНК) и клеточная линия 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительной клеточной линией ВНК является клеточная линия tk^-ts13 BHK (Waechter & Baserga, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 79:1106-1110, 1982), далее называемая клетками ВНК 570. Клеточная линия ВНК 570 имеется в Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, под регистрационным номером АТСС CRL 10314. Клеточная линия tk^-ts13 ВНК также имеется в АТСС под регистрационным номером АТСС CRL 1632. Кроме того, может быть использован ряд других клеточных линий, включая крысиные клетки Нер I (крысиная гепатома; АТСС CRL 1600), крысиные клетки Нер II (крысиная гепатома; АТСС CRL 1548), клетки ТСМК (АТСС CCL 139), клетки легких человека (АТСС НВ 8065), клетки NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1) и клетки DUKX (Urlaub & Chasin, Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 77:4216-4220, 1980).

Технология получения трансгенных животных может быть использована для продуцирования вариантов фактора VII. Эти белки предпочтительно продуцировать в молочной железе самки-хоязина. Экспрессия в молочной железе и последующая секреция нужного белка в молоко позволяет решить многие проблемы, связанные с выделением белка из других источников. Молоко легко собирать, оно доступно в больших количествах и его биохимические свойства хорошо охарактеризованы. Кроме того, многие молочные белки присутствуют в молоке в высоких концентрациях (обычно примерно от 1 до 15 г/л).

С коммерческой точки зрения, очевидно, что предпочтительно использовать те виды животных, которые продуцируют большое количество молока. Хотя могут быть использованы и мелкие животные, такие как мыши и крысы (которые являются предпочтительными для подтверждения основного этапа научного исследования), однако предпочтительно использовать молочных животных, включая, но не ограничиваясь ими, свиней, коз, овец и крупный рогатый скот.Особенно предпочтительными являются овцы, благодаря тому, что уже имеется опыт получения трансгенных животных этого вида, а также благодаря таким факторам, как надои молока, невысокая стоимость и доступность оборудования для сбора овечьего молока (для сравнения факторов, влияющих на выбор вида хозяина,см., например, WO 88/00239). В основном, желательно выбирать такую породу животного-хозяина, которую обычно выращивают в молочных хозяйствах, например, такую как овца восточно-фрисландской породы, или внедрять новую породу молочного скота путем его скрещивания с трансгенной линией на поздней стадии. В любом случае, должны быть использованы животные, которые, как известно, имеют хорошее состояние здоровья.

Для достижения экспрессии в молочной железе используется транскрипционный промотор от гена молочного белка. Генами молочного белка являются гены, кодирующие казеин (см. патент США 5304489), бета-лактоглобулин, α-лактоальбумин и кислый белок молочной сыворотки. Предпочтительным является промотор бета-лактоглобулина (BLG). В случае овечьего гена бета-лактоглобулина, обычно используется область, состоящая, по крайней мере, из проксимальных 406 п.н. 5'-фланкирующей последовательности данного гена, хотя предпочтительными являются более крупные фрагменты 5'-фланкирующей последовательности, примерно до приблизительно 5 т.п.н., такие как ДНК-сегмент размером ˜4,25 т.п.н., охватывающий 5'-фланкирующий промотор и некодирующую область гена бета-лактоглобулина (см., Whitelaw et al., Biochem. J. 286:31-39 (1992)). Подходящими также являются аналогичные фрагменты промоторной ДНК от других видов.

В конструкции могут быть также введены другие области гена бета-лактоглобулина, а возможно, и геномные области экспрессируемого гена. Вообще говоря, специалисты считают, что конструкции, не содержащие интронов, плохо экспрессируются, например, по сравнению с теми же конструкциями, которые содержат такие ДНК-последовательности (см. работы Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1:3-13 (1991); WO 89/01343 и WO 91/02318, каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки). С этой точки зрения, обычно предпочтительно, если это возможно, использовать геномные последовательности, содержащие все или некоторые нативные интроны гена, кодирующего нужный белок или полипептид, так является предпочтительным использование, по крайней мере, нескольких интронов, например, от гена бета-лактоглобулина. Одной такой областью является ДНК-сегмент, который обеспечивает сплайсинг интронов и полиаденилирование РНК, из 3'-некодирующей области овечьего гена бета-лактоглобулина. При замене природных 3'-некодирующих последовательностей гена, этот овечий сегмент бета-лактоглобулина может усиливать и стабилизировать уровни экспрессии нужного белка или полипептида. В других вариантах осуществления изобретения, область, окружающую инициирующий кодон ATG последовательности варианта фактора VII, заменяют соответствующими последовательностями гена для специфического молочного белка. Такая замена обеспечивает предполагаемое окружение, способствующее тканеспецифической инициации и, тем самым, усилению экспрессии. В основном, проводят замену пре-про-последовательности и 5'-некодирующих последовательностей целого варианта фактора VII, например, последовательностями гена BLG, хотя могут быть заменены и меньшие области.

Для экспрессии вариантов фактора VII у трансгенных животных ДНК-сегмент, кодирующий вариант фактора VII, функционально присоединяют к дополнительным и необходимым для его экспрессии ДНК-сегментам в целях продуцирования экспрессионных единиц. Такие дополнительные сегменты включают вышеупомянутый промотор, а также последовательности, обеспечивающие терминацию транскрипции и полиаденилирование мРНК. Эти экспрессионные единицы, кроме того, включают ДНК-сегмент, кодирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально присоединенную к сегменту, кодирующему модифицированный фактор VII. Эта секреторная сигнальная последовательность может представлять собой нативную секреторную сигнальную последовательность фактора VII, либо она может представлять собой последовательность другого белка, такого как молочный белок (см., например, работу von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986); и Meade et al., патент США №4873316, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Конструирование экспрессионных единиц для их использования в трансгенных животных, обычно, осуществляют путем встраивания последовательности варианта фактора VII в плазмидный или фаговый вектор, содержащий дополнительные ДНК-сегменты, хотя указанная экспрессионная единица может быть сконструирована, в основном, путем любой последовательности лигирований. Особенно подходящим является вектор, содержащий ДНК-сегмент, кодирующий молочный белок и используемый для замены кодирующей последовательности молочного белка последовательностью полипептида варианта фактора VII; в результате чего получают гибридный ген, включающий регулирующие экспрессию последовательности гена молочного белка. В любом случае, клонирование экспрессионных единиц в плазмидах или в других векторах облегчает амплификацию последовательностей варианта фактора VII. Амплификацию обычно осуществляют в бактериальных клетках-хозяевах (например, E.coli), в результате чего эти векторы обычно содержат сайт инициации репликации и селективный маркер, который является функциональным в бактериальных клетках-хозяевах. Указанные экспрессионные единицы затем вводят в оплодотворенные яйцеклетки (включая эмбрион на ранней стадии) выбранных видов хозяев. Введение гетерологичной ДНК может быть осуществлено любым из нескольких способов, включая микроинъекцию (см., например, патент США №4873191), инфицирование ретровирусом (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)), или сайт-направленную интеграцию с использованием эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (Bradley et al., Bio/Technology 10:534-539 (1992)). Затем эти яйцеклетки имплантируют в яйцеводы или матку псевдобеременных самок для их развития до определенного срока. Потомство, несущее ДНК, введенную в их зародышевую линию, может передавать ДНК последующему потомству в соответствии с нормальным наследованием по закону Менделя, что позволяет создавать стада трансгенных животных. Общие процедуры получения трансгенных животных известны специалистам (см. например, работы Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall et al., Biol.Reprod. 32:645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9:835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844-847 (1991); Wall et al., J.Cell. Biochem. 49:113-120 (1992); патент США №4873191; патент США №4873316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757 и GB 87/00458). Методы введения чужеродных ДНК-последовательностей млекопитающими в их зародышевые клетки впервые были применены на мышах (см., например, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77:7380-7384 (1980); Gordon & Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter & Brinster, Cell 41:343-345 (1985); Brinster et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82:4438-4442 (1985) и Hogan et al. (там же)). Эти методы были затем адаптированы для их применения к более крупным животным, включая виды крупного рогатого скота (см. например, WO 88/00239, WO 90/05188 и WO 92/11757; и Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988)). В итоге, в наиболее эффективном способе, используемом в настоящее время для создания трансгенных мышей или крупного рогатого скота, несколько сотен линейных молекул нужной ДНК инъецируют в один из пронуклеусов оплодотворенной яйцеклетки в соответствии со стандартной технологией. Может быть также осуществлена инъекция ДНК в цитоплазму зиготы.

Может быть также осуществлено продуцирование трансгенных растений. Экспрессия может быть генерализованной или направленной в конкретный орган, такой как клубень (см. Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); и ЕР 0255378).

Варианты фактора VII настоящего изобретения выделяют из культуральной клеточной среды или молока. Варианты фактора VII настоящего изобретения могут быть очищены различными методами, известными специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирующую и вытеснительную хроматографию), электрофоретическую технику (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), дифференциальное растворение (например, преципитация сульфатом аммония) или экстракция (см. например, Protein Purification, J.C. Janson & Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989). Предпочтительно, они могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии на колонке с антителом против фактора VII. Особенно предпочтительно использовать кальцийзависимые моноклональные антитела, как описано Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108 (1986) & Thim et al., Biochemistry, 27:7785-7793 (1988). Дополнительная очистка может быть осуществлена стандартным методом химической очистки, таким как высокоэффективная жидкостная хроматография. Другие методы очистки, включая преципитацию цитратом бария, известны специалистам и могут быть применены для очистки новых описанных здесь вариантов фактора VII (см., например, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Для терапевтических целей предпочтительно, чтобы варианты фактора VII настоящего изобретения были, в основном, чистыми. Так, например, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, варианты фактора VII настоящего изобретения очищены, по крайней мере, примерно до 90-95%-ной гомогенности, а предпочтительно, по крайней мере, примерно до 98%-ной гомогенности. Чистота может быть оценена посредством гель-электрофореза и секвенирования аминоконцевых аминокислот.

Вариант фактора VII гидролизуют в его активном центре для превращения в двухцепочечную форму. Активация может быть осуществлена в соответствии с процедурами, известными специалистам, как, например, описано Osterud et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, патент США №4456591; Hedner & Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); или Kisiel & Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983). Альтернативно, как описано Bjoem et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp.564-565), Фактор VII может быть активирован путем его пропускания через ионообменную хроматографическую колонку, такую как MonoQ® (Pharmacia fine Chemicals) или т.п. Полученный активированный вариант фактора VII может быть затем введен в композицию и использован, как описано ниже.

Анализы

Настоящее изобретение также относится к подходящим анализам для отбора предпочтительных вариантов фактора VIIa настоящего изобретения. Эти анализы могут быть осуществлены в виде простого предварительного теста in vitro.

Так, например, в представленном здесь примере 11 описан простой тест (под названием "Гидролизный анализ in vitro" на активность вариантов фактора VIIa настоящего изобретения. На основании этого теста вариантами фактора VIIa, которые представляют особый интерес, являются такие варианты, у которых отношение активности данного варианта к активности нативного фактора VII, показанного на фиг.1, составляет более 1,0, например, по крайней мере, примерно 1,25, предпочтительно, по крайней мере, примерно 2,0, например, по крайней мере, примерно 3,0, а еще более предпочтительно, по крайней мере, примерно 4,0, как было протестировано в разделе "Гидролизный анализ in vitro", приведенном ниже.

Активность указанных вариантов может быть также измерена с использованием физиологического субстрата, такого как фактор Х ("Протеолитический анализ in vitro, см. пример 12), обычно, при концентрации 100-1000 нМ, где, после добавления подходящего хромогенного субстрата (например, S-2765), измеряют уровень генерированного фактора Ха. Кроме того, анализ на активность может быть осуществлен при физиологической температуре.

Способность вариантов FVIIa генерировать тромбин может быть также оценена в анализе, предусматривающем использование всех соответствующих факторов и ингибиторов свертывания крови при физиологических концентрациях (за исключением фактора VIII при имитации условий гемофилии А) и активированных тромбоцитов (как описано на стр.543 работы Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Способы введения и фармацевтические композиции

Варианты фактора VII настоящего изобретения могут быть использованы для регуляции расстройств, которые характеризуются склонностью к кровотечениям и которые вызываются несколькими причинами, такими как дефицит факторов свертывания крови (например, гемофилия А и В или дефицит факторов свертывания XI или VII) или присутствие ингибиторов факторов свертывания крови, либо они могут быть использованы для лечения повышенной кровоточивости, наблюдающейся у индивидуумов с нормальным функционированием системы свертывания крови (при отсутствии дефицита факторов свертывания или ингибиторов любого из факторов свертывания крови). Кровотечения могут быть вызваны нарушением функции тромбоцитов, тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда. Они могут также наблюдаться у пациентов, у которых повышенная фибринолитическая активность индуцирована различными стимуляторами.

У индивидуумов, у которых наблюдаются обширные поражения тканей, вызванные хирургической операцией или тяжелыми травмами, механизм гемостаза может подавляться требованием немедленного гемостаза, и у них могут возникать кровотечения, несмотря на нормальный механизм гемостаза. Достижение достаточного гемостаза является также проблематичным в случае, когда кровотечение происходит в таких органах, как головной мозг, область внутреннего уха и глаза, и, кроме того, определенные трудности могут возникать в случаях диффузных кровотечений (геморрагический гастрит и профузное кровотечение матки), когда трудно идентифицировать источник кровотечения. Аналогичные проблемы могут также возникать при взятии биопсии из различных органов (печени, легкого, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также при лапароскопии. Во всех этих ситуациях достаточно трудно обеспечить гемостаз хирургическими методами (наложение швов, зажимов и т.п.). Острые и профузные кровотечения могут также наблюдаться при антикоагулятной терапии у индивидуумов, у которых нарушение гемостаза было индуцировано данной терапией. Такие индивидуумы могут нуждаться в хирургическом вмешательстве в том случае, когда антикоагулирующее действие должно быть быстро устранено. Другой ситуацией, которая может быть связана с проблемами в случае недостаточного гемостаза, является ситуация, в которой индивидуумам с нормальным механизмом гемостаза назначают антикоагулянтную терапию для предупреждения тромбоэмболического заболевания. Такая терапия может предусматривать введение гепарина, других форм протеогликанов, варфарина или других форм антагонистов витамина К, а также аспирина и других ингибиторов агрегации тромбоцитов.

Системная активация каскада реакций свертывания крови может приводить к диссеминированному внутрисосудистому свертыванию крови (ДВС). Однако такие осложнения не наблюдаются у индивидуумов, которые были подвергнуты лечению высокими дозами рекомбинантного FVIIa, вследствие наличия у них локализованного гемостатического процесса такого типа, который индуцируется образованием комплекса между FVIIa и TF, на пораженном участке сосудистой стенки. Таким образом, варианты фактора VII настоящего изобретения могут быть также использованы в их активированной форме для устранения избыточного кровотечения, ассоциированного с нормальным механизмом гемостаза.

Для лечения состояний, связанных с вынужденным хирургическим вмешательством, варианты фактора VII настоящего изобретения, в основном, могут быть введены примерно за 24 часа до осуществления этой операции, и по крайней мере, через 7 дней или более после этой операции. Введение указанных вариантов в качестве коагулянта может быть осуществлено любым описанным здесь способом.

Доза вариантов фактора VII составляет в пределах примерно от 0,05 мг до 500 мг/день, предпочтительно, примерно от 1 мг до 200 мг/день, а более предпочтительно, примерно от 10 мг до 175 мг/день на 70 кг веса индивидуума в качестве ударных и поддерживающих доз в зависимости от веса массы индивидуума и тяжести его состояния.

Фармацевтические композиции предназначены, главным образом, для парентерального введения в целях профилактического и/или терапевтического лечения. Эти фармацевтические композиции, предпочтительно, вводят парентерально, то есть внутривенно, подкожно или внутримышечно, либо они могут быть введены путем непрерывного или периодического вливания. Композиции для парентерального введения содержат вариант фактора VII настоящего изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, в котором этот вариант предпочтительно растворен, а более предпочтительно, в комбинации с водным носителем. Может быть использован ряд водных носителей, таких как вода, забуференная вода, 0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин и т.п. Варианты фактора VII настоящего изобретения могут быть также включены в липосомные препараты для доставки или нацеливания на пораженные участки. В общих чертах, липосомные препараты, описаны, например, в патентах США №№4837028, 4501728 и 4975282. Эти композиции могут быть стерилизованы стандартными и хорошо известными методами стерилизации. Полученные водные растворы могут быть упакованы для последующего использования либо их отфильтровывают в асептических условиях и лиофилизуют, а перед введением этот лиофилизованный препарат объединяют со стерильным водным раствором. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для поддержания физиологических условий, такие как рН-корректирующие и забуферивающие агенты, агенты для придания тоничности и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.п.

Концентрация варианта фактора VII в этих композициях может сильно варьироваться, то есть, примерно от менее, чем 0,5% мас., а обычно, по крайней мере, примерно 1% мас. и до максимум 15-20% мас., и такая концентрация может быть выбрана, главным образом, исходя из объема жидкости, вязкости и т.п., и в соответствии с конкретно выбранным способом введения.

Таким образом, типичная фармацевтическая композиция для внутривенного вливания должна содержать до 250 мл стерильного раствора Рингера и 10 мг варианта фактора VII. Существующие методы получения парентерально вводимых композиций известны или очевидны для каждого специалиста и более подробно описаны, например, в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Композиции, содержащие варианты фактора VII настоящего изобретения, могут быть введены в целях профилактического и/или терапевтического лечения. При терапевтическом применении композиции вводят индивидууму с уже диагностированным заболеванием, как описано выше, в количестве, достаточном для лечения, ослабления или частичной приостановки развития заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как "терапевтически эффективное количество". Для каждого специалиста очевидно, что такое эффективное количество зависит от тяжести заболевания или поражения, а также от веса и общего состояния индивидуума. Однако, в основном, такое эффективное количество может составлять в пределах примерно от 0,05 мг до 500 мг варианта фактора VII в день для индивидуума весом в 70 кг, а в основном, могут быть использованы дозы, составляющие примерно от 1,0 мг до 200 мг варианта фактора VII в день.

При этом необходимо иметь в виду, что материалы настоящего изобретения могут быть использованы, в целом, для лечения серьезных заболеваний или повреждений, то есть в тех случаях, когда имеется угроза или потенциальная угроза для жизни. В таких случаях для минимизации попадания чужеродных веществ и ввиду полного отсутствия иммуногенности вариантов человеческого фактора VII у человека возможно и желательно, чтобы лечащий врач назначил введение в значительной степени избыточного количества композиций указанного варианта фактора VII.

Для профилактического применения композиции, содержащие вариант фактора VII настоящего изобретения, вводят индивидууму, обладающему чувствительностью к данному патологическому состоянию или поражению, либо с повышенным риском возникновения такого состояния или поражения в целях усиления у этого индивидуума собственной способности его организма к свертыванию крови. Такое количество называют "профилактически эффективной дозой". Для профилактического применения точная доза также зависит от состояния здоровья и веса индивидуума, и эта доза, в основном, составляет в пределах примерно от 0,05 мг до 500 мг в день для индивидуума весом в 70 килограммов, а в основном, она составляет примерно от 1,0 мг до 200 мг в день для индивидуума весом в 70 килограммов.

Разовые и многократные введения указанных композиций могут быть осуществлены с использованием доз и схем лечения, выбранных лечащим врачом. Для амбулаторных больных, для которых требуется поддержание определенных суточных уровней, варианты фактора VII могут быть введены путем непрерывного вливания с использованием портативной системы насосов.

Местная доставка варианта фактора VII настоящего изобретения, такая как, например, наружное нанесение, может быть осуществлена, например, с использованием спрея, перфузии, катетеров с двумя баллонами, стента или стентов, вводимых в сосудистый имплантат, гидрогелей, применяемых для покрытия баллонных катетеров, или других хорошо разработанных методов. В любом случае, указанные фармацевтические композиции должны обеспечивать доставку определенного количества варианта фактора VII, достаточного для эффективного лечения данного индивидуума.

Настоящее изобретение подробно проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые, однако, не должны рассматриваться как ограничение объема защиты. Признаки изобретения, раскрываемые в нижеследующем описании и в нижеследующих примерах, как отдельно, так и в любой комбинации друг с другом, могут рассматриваться как материал для реализации настоящего изобретения в его различных формах.

Примеры

Терминология для аминокислотных замен, используемых в нижеследующих примерах, определена ниже. Первая буква означает природную аминокислоту, обычно присутствующую в соответствующем положении в SEQ ID NO:1. Следующее за ней число означает положение в SEQ ID NO:1. Вторая буква означает другую аминокислоту, замещающую (заменяющую) указанную природную аминокислоту. В качестве примера может служить М298Q, где метионин в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен глутамином. Другим примером является V158Т/М298Q, где валин в положении 158 SEQ ID NO:1 заменен треонином, а метионин в положении 298 SEQ ID NO:1 заменен глутамином в том же полипептиде фактора VII.

Пример 1

ДНК, кодирующая [V158Т/М298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII и [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, [V158D/M298K]-FVII, [V158D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [S336G]-FVII, [K337A]-FVII, [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII

ДНК-конструкции, кодирующие [V158Т/М298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII и [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, [V158D/M298K]-FVII, [V158D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII, [S336G]-FVII и [K337A]-FVII, были получены путем сайт-направленного мутагенеза с использованием суперспирализованного двухцепочечного ДНК-вектора, имеющего нужную вставку, и два синтетических праймера, содержащих нужную мутацию. При этом были использованы следующие пары праймеров:

Олигонуклеотидные праймеры, каждый из которых комплементарен противоположным цепям вектора, удлинялись в процессе температурных циклов с помощью ДНК-полимеразы Pfu. После введения праймеров генерировали мутированную плазмиду, содержащую ступенчатые одноцепочечные разрывы ("ник-разрывы"). После проведения температурных циклов полученный продукт обрабатывали ферментом DpnI, являющимся специфичным по отношению к метилированной и полуметилированной ДНК, в целях гидролиза исходной ДНК-матрицы и отбора на содержащую мутацию синтезированную ДНК.

Процедуры получения ДНК-конструкций посредством полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров хорошо известны специалистам (см. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).

Пример 2

Получение [V158T/M298Q]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [V158Т/М298Q]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [V158Т/М298Q]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [V158Т/М298Q]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по уровню фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 3

Получение [K157A]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [K157A]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [K157A]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [K157A]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 4

Получение [V158D/M298Q]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [V158D/M298Q]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [V158D/M298Q]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [V158D/М298Q]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 5

Получение [V158D/M298К]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [V158D/M298К]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [V158D/M298К]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [V158D/М298К]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 6

Получение [V158D/E296V/M298Q]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [V158D/E296V/M298Q]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [V158D/E296V/M298Q]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [V158D/E296V/M298Q]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 7

Получение [M298Q]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [M298Q]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [M298Q]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [M298Q]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 8

Получение [S336G]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [S336G]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [S336G]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [S336G]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 9

Получение [K337A]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [K337A]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [K337A]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [K337A]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 10

Получение [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII

Клетки ВНК трансфецировали, в основном, как описано ранее (Thim et al., (1988) Biochemistry, 27, 7785-7793; Persson & Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) для достижения экспрессии варианта [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII. Этот вариант фактора VII очищали следующим образом.

Кондиционированную среду загружали в 25-миллилитровую колонку с сефарозой Q Fast Flow (Pharmacia Biotech) после добавления в нее 5 мМ EDTA, 0,1% Тритона Х-100 и 10 мМ Триса с последующим доведением рН до 8,0 и проводимости до 10-11 мСм/см путем добавления воды. Затем белок подвергали ступенчатому элюированию в градиенте от 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0, до 10 мМ Триса, 50 мМ NaCl, 25 мМ CaCl₂, 0,1% Тритона Х-100, рН 8,0. Фракции, содержащие [V158D/E296V/M298Q/ K337A]-FVII, собирали и наносили на 25 мл-колонку, содержащую моноклональное антитело F1А2 (Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark), связанное с CNBr-активированной сефарозой 4 В (Pharmacia Biotech). Колонку уравновешивали 50 мМ Hepes, рН 7,5, содержащим 10 мМ CaCl₂, 100 мМ NaCl и 0,02% Тритона Х-100. После промывки уравновешивающим буфером и уравновешивающим буфером, содержащим 2 М NaCl, связанный материал элюировали уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ EDTA вместо CaCl₂. Перед использованием или хранением добавляли CaCl₂ в количестве, превышающем количество EDTA, либо [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII переносили в Ca²⁺-содержащий буфер. Выход на каждой стадии оценивали по количеству фактора VII с помощью ELISA, и очищенный белок анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 11

Гидролизный анализ in vitro

Нативный (дикого типа) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба далее именуемые "фактором VIIa") параллельно анализировали для прямого сравнения их удельных активностей. Указанный анализ осуществляли в микротитрационном планшете (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Хромогенный субстрат D-Ile-Pro-Arg-п-нитроанилид (S-2288, Chromogenix, Sweden) в конечной концентрации 1 мМ добавляли к фактору VIIa (конечная концентрация 100 нМ) в 50 мМ Hepes, pH 7,4, содержащем 0,1М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки. Оптическую плотность при 405 нм непрерывно измеряли на планшет-ридере SpectraMax^TM 340 (Molecular Devices, USA). Оптическую плотность, определенную в процессе 20-минутного инкубирования после вычитания оптической плотности в "слепых" лунках, не содержащих фермента, использовали для вычисления отношения активностей варианта фактора VIIa и фактора VIIa дикого типа:

Отношение=(А_{405 нм} варианта фактора VIIa)/(А_{405 нм} фактора VIIa дикого типа).

Пример 12

Протеолитический анализ in vitro

Нативный (дикого типа) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба далее именуемые "фактором VIIa") параллельно анализировали для прямого сравнения их удельных активностей. Указанный анализ осуществляли в микротитрационном планшете (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Фактор VIIa (10 нм) и фактор Х (0,8 мкМ) в 100 мкл 50 мМ Hepes, pH 7,4, содержащем 0,1М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки, инкубировали в течение 15 минут. Затем протеолиз фактора Х прекращали добавлением 50 мкм 50 мМ Hepes, pH 7,4, содержащего 0,1М NaCl, 20 мМ EDTA и 1 мг/мл альбумина бычьей сыворотки. Количество генерированного фактора Ха измеряли путем добавления хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-п-нитроанилида (S-2765, Chromogenix, Sweden) в конечной концентрации 0,5 мМ. Оптическую плотность при 405 нм непрерывно измеряли на планшет-ридере SpectraMax^TM 340 (Molecular Devices, USA). Оптическую плотность, определенную в течение 10 минут, после вычитания оптической плотности в "слепых" лунках, не содержащих FVIIa, использовали для вычисления отношения протеолитических активностей варианта фактора VIIa и фактора VIIa дикого типа:

Отношение=(А_{405 нм} варианта фактора VIIa)/(А_{405 нм} фактора VIIa дикого типа).

Пример 13

Относительные активности вариантов FVIIa, измеренные в анализах, описанных в примерах 11 и 12

ВариантОтношение в примере 11Отношение в примере 12К157А0,9Не определялиV158T/M298Q-FVIIa3,810V158D/M298Q-FVIIa2,02,7V158D/M298К-FVIIa0,3Не определялиV158D/E296V/M298Q-FVIIa7,828M298Q-FVIIa3,45,5V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa11,047S336G-FVIIa0,6Не определялиK337A-FVIIa3,94,4Дикого типа-FVIIa1,01,0

Изобретение относится к области белковой и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Предложены новые варианты фактора VII свертывания крови с повышенной протеолитической активностью, которая является результатом замены аминокислотного остатка, занимающего в природной последовательности положение, соответствующее Met 298 фактора VII человека, остатком глутамина. Варианты фактора VII по изобретению могут включать дополнительные замены в некоторых других положениях протеазного домена и представлять многосайтовые мутантные формы, в частности [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa и [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVIIa. Новые варианты фактора VII получены с помощью метода рекомбинантных ДНК, для реализации которого предложены кодирующие нуклеотидные последовательности, векторные конструкции и трансформированные клетки. Изобретение раскрывает возможность использования новых мутантных форм фактора VII для получения лекарственных препаратов с коагулянтной активностью. 7 н. и 13 з.п.ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Полипептид фактора VII свертывания крови, обладающего повышенной по сравнению с нативным фактором VIIa протеолитической активностью, который по крайней мере содержит замену аминокислоты, соответствующей Met в положении 298 последовательности SEQ ID NO:1, на аминокислоту Gin.2. Полипептид фактора VII по п.1, где заменена по крайней мере еще одна аминокислота в положении протеазного домена, отличном от положения 298.3. Полипептид фактора VII по п.2, где заменено по крайней мере 20 дополнительных аминокислот.4. Полипептид фактора VII по п.2, где заменена по крайней мере одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из положений 159-170 последовательности SEQ ID NO:1.5. Полипептид фактора VII по п.2, где заменена по крайней мере одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из положений 290-312 последовательности SEQ ID NO:1.6. Полипептид фактора VII по п.2, где заменена по крайней мере одна аминокислота, соответствующая аминокислоте в положении, выбранном из положений 330-339 последовательности SEQ ID NO:1.7. Полипептид фактора VII по п.1, где аминокислота, соответствующая Val в положении 158 последовательности SEQ ID NO:1, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.8. Полипептид фактора VII по п.1, где аминокислота, соответствующая Glu в положении 296 последовательности SEQ ID NO:1, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Arg, Lys и Val.9. Полипептид фактора VII по п.1, где аминокислота, соответствующая Lys в положении 337 последовательности SEQ ID NO:1, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp и Glu.10. Полипептид фактора VII по п.1, где аминокислота, соответствующая Lys в положении 157 последовательности SEQ ID NO:1, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp и Glu.11. Полипептид фактора VII по п.1, где аминокислота, соответствующая Asp в положении 334 последовательности SEQ ID NO:1, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Gly и Glu.12. Полипептид фактора VII по п.1, где аминокислота, соответствующая Ser в положении 336 последовательности SEQ ID NO:1, заменена на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Gly и Glu.13. Полипептид фактора VII по п.1, который представляет собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/M298Q]-FVIIa, [M298Q]-FVIIa и [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa и [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVIIa.14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид фактора VII, обладающего повышенной по сравнению с нативным фактором VIIa протеолитической активностью, которая характеризуется нуклеотидной последовательностью, определяющей аминокислотную последовательность полипептида фактора VII по п.1.15. Рекомбинантная клетка млекопитающего, предназначенная для продукции полипептида фактора VII, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту по п.14.16. Рекомбинантная клетка млекопитающего по п.15, где клетка выбрана из группы, состоящей из клеток СНО, клеток ВНК или клеток НЕК.17. Способ получения полипептида фактора VII, который предусматривает культивирование клетки по любому из пп.15 и 16 в подходящей культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию указанной нуклеиновой кислоты, и

выделение полученного полипептида из культуральной среды.