СПОСОБ ОЦЕНКИ СУММАРНОЙ СЕКРЕТНОЙ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ РАЗЛИЧНЫХ КОМПАРТМЕНТОВ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Российский патент 2012 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии, и может использоваться для оценки суммарной секреторной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов различных компартментов в условиях длительного культивирования в клиниках, занимающихся иммунокоррекцией и иммуномодуляцией, а также оценкой иммунного статуса пациентов из групп риска.

Известен способ, опубликованный в 1992 году Долгушиным И.И., Зурочкой А.В., Эбертом Л.Я., Долгушиной В.Ф., Марачевым С.И., Чукичевым А.В. и Власовым А.В. в методических рекомендациях для аспирантов, научных работников, слушателей курса клинической иммунологии и студентов «Изучение кооперации нейтрофилов с клетками иммунной системы в норме и патологии», г. Челябинск, 1992 г.

Сущность данного способа заключается в оценке секреторной активности нейтрофилов по изменению функций моноцитов доноров под влиянием супернатантов как доноров, так и больных. Для этого супернатанты нейтрофилов больных и доноров добавляли к адгезированным на покровном стекле моноцитам донора. Клетки инкубировали в течение 1 часа и изучали НСТ-тест, фагоцитарную и лизосомальную активность моноцитов. В качестве контроля определяли функции моноцитов доноров, инкубируемых в среде 199. Хемотаксис моноцитов донора оценивали в данном методе по отношению к супернатанту донора, который использовался в качестве хемоатрактанта.

Недостаток данного способа заключается в том, что он позволяет оценить исключительно секреторную активность нейтрофилов по выработке нейтрофилокинов в условиях кратковременного культивирования.

Известен способ оценки активности провоспалительного цитокина, описанный в патенте РФ №234400 «Способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов», по кл. А61К 39/02, G01N 33/48, C12N 5/00, з. 26.11.07, oп. 10.05. 2009 и выбранный в качестве прототипа.

Известный способ заключается в следующем.

Для определения уровня протективности мелиоидозных антигенов их используют в качестве индукторов цитокинов на культуре перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей BALB/c. Получают перитонеальные макрофаги из брюшной полости мышей, подсчитывают клетки в камере Горяева, доводят концентрацию до 5 × 10 в пятой степени кл./мл, вносят в лунки 96-луночной планшеты по 200 мкл (10 в пятой степени клеток на лунку). Добавляют к ним для усиления секреции мелиоидозные антигены (индукторы цитокинов), предварительно стерилизованные фильтрацией через фильтры Millipore 0,22 мм по 100 мкл на лунку с ПМ до конечной концентрации 10 мкг/мл. В контроле в лунки с ПМ добавляют по 100 мкл 0,15 М раствора хлорида натрия (физ. раствор). Планшеты инкубируют при 37°С в присутствии 5% СO₂ 24 часа. После инкубации супернатанты (цитокины) собирают, центрифугируют при 1000 об/мин 7 мин, стерилизуют через фильтры и исследуют цитотоксическую активность многофункционального провоспалительного цитокина - ФНО-α, присутствующего в супернатантах, на клеточной линии мышиных фибробластов L-929 или замораживают при -20°С для хранения с последующим исследованием биологической активности. Для определения биологической активности ФНО-α используют в качестве клеток фибробласты L-929, которые культивируют в пластиковых чашках в полной питательной среде RPMI-1640 с 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС) или эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L - глютамина, 1 mM пирувата натрия и 10 мкг/мл гентамицина сульфата. Пересев клеток производят 1 раз в неделю путем открепления от подложки с помощью раствора трипсин-версена (1:3). Для постановки пробы на цитотоксичность клетки L-929 открепляют от пластика подложки раствором трипсин-версена, отмывают 1 раз полной питательной средой 7 мин при 800 об/мин, доводят до концентрации 2 × 10 в шестой степени кл/мл и распределяют по 100 мкл (2 × 10 в пятой степени клеток) в лунки 96-луночной планшеты для культивирования. После 24 часов инкубации при 37°С и 5% CO₂ к прилипшим к пластику клеткам-мишеням добавляют в трех повторностях по 100 мкл монокинов, предварительно раститрованных в отдельной планшете в полной питательной среде, в контрольные лунки с клетками L-929 вносят питательную среду. На этом этапе для усиления действия ФНО-α в культуры добавляют актиномицин D в объеме 10 мкл до конечной концентрации 1 мкг/мл. Цитотоксическое действие ФНО-α оценивают через 24 часа инкубации при просмотре планшетов под инвертированным микроскопом. Мертвые клетки выглядят более темными, имеют неровные контуры, зернистость, дефекты в клеточной стенке. Активность ФНО-α выражают числом единиц активности, обратным разведению монокинов, обеспечивающему 50% гибель клеток в лунке (ЦТЕ50). Степень активности ФНО-α в опыте (монокины, индуцированные мелиоидозными антигенами) сравнивают с таковой в контроле (монокины, индуцированные физиологическим раствором). Уровень протективности испытуемых мелиоидозных антигенов находится в прямой пропорциональной зависимости от степени выраженности цитотоксической активности ФНО-α в опыте по сравнению с контролем.

Недостаток известного способа заключается в том, что возможности его применения ограничены, т.к. он используется только для определения уровня протективности мелиоидозных антигенов.

При этом известный способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов позволяет определить лишь цитотоксическое действие ФНО, но ведь перитонеальные макрофаги во время культивирования выделяют целый спектр как провоспалительных, так противовоспалительных и других видов цитокинов. Поэтому необходима оценка активности не одного монокина, а комплексная оценка целого спектра цитокинов. Кроме того, известный способ использует культивирование в течение суток, что ограничивает накопление в супернатанте выделенных тканевыми макрофагами монокинов.

Задачей заявляемого способа является расширение возможности применения метода, описанного выше, для оценки суммарной секреторной активности тканевых макрофагов различных компартментов в условиях длительного культивирования.

Поставленная задача решается тем, что в способе оценки суммарной секреторной активности макрофагов различных компартментов в условиях длительного культивирования, заключающемся в том, что выделяют необходимые макрофаги грызунов, в том числе перитонеальные, культивируют их путем инкубации, усиливают секрецию цитокинов, после инкубации собирают цитокины, центрифугируют полученный материал для осаждения макрофагов и выделения цитокинов из надосадочной жидкости, затем культивируют выделенные цитокины в присутствии клеток с добавлением питательной среды, 10% сыворотки КРС и антибиотиков, в т.ч. гентамицина, открепляют от подложки с помощью трипсина исследуемые клетки, отмывают их 1 раз питательной средой, доводят их до концентрации 2×10 в шестой степени кл/мл и оценивают их активность, в частности жизнеспособность, сравнивая функции клеток, активированных цитокинами, и активность клеток без них, согласно изобретению в качестве макрофагов используют дополнительно альвеолярные макрофаги, полученные путем бронхоальвеолярного лаважа; клетки Купфера; селезеночные макрофаги; макрофаги соединительной ткани или макрофаги очага воспаления, для усиления секреции цитокинов первую инкубацию проводят в течение 7 суток в стерильном эксикаторе в присутствии 5% CO₂, берут в качестве клеток моноциты периферической крови, взятой у грызунов, которые разделяют на две равные порции, в обе из них добавляют в качестве питательной среды 85% среды 199, 5% экстракта коровьего эмбриона, 1 мг/мл гентамицина и пенициллин, а во вторую добавляют дополнительно цитокины, выделенные тканевыми макрофагами во время длительного культивирования, при этом первая порция служит контрольной, культивируют обе порции в стерильном эксикаторе в течение 2-х суток в присутствии 5% СO₂, затем открепляют с помощью раствора трипсина моноциты крови от пластиковой поверхности чашки Петри, центрифугируют каждую из порций в течение 10 минут при 1500 об/мин для осаждения моноцитов крови в каждой порции, культивируемых с цитокинами тканевых макрофагов и без цитокинов, и оценивают жизнеспособность моноцитов из обеих пробирок, а также оценивают дополнительно другие их характеристики, такие как: адгезия на чистой обезжиренной стеклянной поверхности, способность к распластыванию, фагоцитоз частиц латекса и St. aureus, пероксидазная, лизосомальная, киллинговая активность, содержание энергетического субстрата (гликогена и липидов), спонтанный и индуцированный НСТ-тест и т.д., затем сравнивают исследуемые показатели у моноцитов из обеих пробирок и определяют, какие цитокины (провоспалительные или противовоспалительные) были выделены и как они повлияли на морфофункциональное состояние и цитохимическую активность моноцитов периферической крови.

Использование дополнительно макрофагов других тканей при усилении секреции цитокинов за счет длительного инкубирования в совокупности с использованием в качестве клеток моноцитов крови, взятых у грызунов, и оценкой их дополнительных характеристик позволяет более досконально оценить секреторную активность и расширяет возможность применения заявляемого способа.

Технический результат - возможность оценки суммарной секреторной активности макрофагов различного происхождения в условиях длительного культивирования.

Необходимо также отметить следующее.

Несмотря на то что данный метод оценки секреторной активности тканевых макрофагов различных компартментов в условиях длительного культивирования является косвенным методом, он имеет ряд существенных преимуществ.

В клинической практике нет доступных методов анализа секреторной функции тканевых макрофагов различных компартментов в норме и патологии. Именно поэтому техническая результативность предлагаемого изобретения заключается также в его доступности: метод не требует специального и дорогостоящего оборудования, не требует дорогих реактивов, метод очень прост в применении и может выполняться персоналом, не специализирующимся на данном методе исследования. Таким образом, методика проста и доступна, в связи с чем может найти широкое применение в клинике и эксперименте.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него наличием таких существенных признаков, как использование в качестве макрофагов дополнительно альвеолярных макрофагов, полученных путем бронхоальвеолярного лаважа; клеток Купфера; селезеночных макрофагов; макрофагов соединительной ткани или макрофагов очага воспаления, проведение для усиления секреции цитокинов первую инкубацию в течение 7 суток в стерильном эксикаторе в присутствии 5% СO₂, использование в качестве клеток моноцитов периферической крови, взятой у грызунов, которые разделяют на две равные порции, добавление в обе из них в качестве питательной среды 85% среды 199, 5% экстракта коровьего эмбриона, 1 мг/мл гентамицина и пенициллина, добавление во вторую дополнительно цитокинов, выделенных тканевыми макрофагами во время длительного культивирования, использование при этом первой порции в качестве контрольной, культивирование обеих порций в стерильном эксикаторе в течение 2-х суток в присутствии 5% СO₂ с последующим откреплением с помощью раствора трипсина моноцитов крови от пластиковой поверхности чашки Петри, центрифугирование каждой из порций в течение 10 минут при 1500 об/мин для осаждения моноцитов крови в каждой порции, культивируемых с цитокинами тканевых макрофагов и без цитокинов и оценка жизнеспособности моноцитов из обеих пробирок, а также оценка дополнительно других их характеристик, таких как: адгезия на чистой обезжиренной стеклянной поверхности, способность к распластыванию, фагоцитоз частиц латекса и St. aureus, пероксидазная, лизосомальная, киллинговая активность, содержание энергетического субстрата (гликогена и липидов), спонтанный и индуцированный НСТ-тест и т.д., последующее сравнение исследуемых показателей у моноцитов из обеих пробирок и определение того, какие цитокины (провоспалительные или противовоспалительные) были выделены и как они повлияли на морфофункциональное состояние и цитохимическую активность моноцитов периферической крови, обеспечивающих в совокупности достижение заданного результата.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ оценки суммарной секреторной активности макрофагов различных компартментов в условиях длительного культивирования может использоваться для оценки суммарной секреторной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов различных компартментов в условиях длительного культивирования в клиниках, занимающихся иммунокоррекцией и иммуномодуляцией, а также оценкой иммунного статуса пациентов из групп риска, а потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ заключается в следующем.

Выделяют необходимые макрофаги грызунов, в том числе перитонеальные; альвеолярные макрофаги, полученные путем бронхоальвеолярного лаважа; клетки Купфера; селезеночные макрофаги; макрофаги соединительной ткани или макрофаги очага воспаления и культивируют их путем инкубации. При этом усиливают секрецию цитокинов, для чего первую инкубацию проводят в течение 7 суток в стерильном эксикаторе в присутствии 5% СO₂. После инкубации центрифугируют полученный материал для осаждения макрофагов и выделения цитокинов из надосадочной жидкости. Затем культивируют выделенные цитокины в присутствии клеток с добавлением питательной среды, сыворотки КРС и антибиотиков. При этом берут в качестве клеток моноциты периферической крови, взятой у грызунов, которые разделяют на две равные порции, в обе из них добавляют в качестве питательной среды 85% среды 199, 5% экстракта коровьего эмбриона, 1 мг/мл гентамицина и пенициллина. Во вторую порцию добавляют дополнительно цитокины, выделенные тканевыми макрофагами во время длительного культивирования, при этом первая порция служит контрольной, культивируют обе порции в стерильном эксикаторе в течение 2-х суток в присутствии 5% СO₂. Далее открепляют с помощью раствора трипсина моноциты крови от пластиковой поверхности чашки Петри и центрифугируют каждую из порций в течение 10 минут при 1500 об/мин для осаждения моноцитов крови в каждой порции, культивируемых с цитокинами тканевых макрофагов и без цитокинов. Оценивают жизнеспособность моноцитов из обеих пробирок, а также оценивают дополнительно другие их характеристики, такие как: адгезия на чистой обезжиренной стеклянной поверхности, способность к распластыванию, фагоцитоз частиц латекса и St. aureus, пероксидазная, лизосомальная, киллинговая активность, содержание энергетического субстрата (гликогена и липидов), спонтанный и индуцированный НСТ-тест и т.д. Затем сравнивают исследуемые показатели у моноцитов из обеих пробирок и определяют, какие цитокины (провоспалительные или противовоспалительные) были выделены и как они повлияли на морфофункциональное состояние и цитохимическую активность моноцитов периферической крови.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

В качестве исследуемого материала выделяют необходимые для исследования тканевые макрофаги нужного компартмента (перитонеальные макрофаги из брюшной полости крыс; альвеолярные макрофаги путем бронхоальвеолярного лаважа; клетки Купфера; селезеночные макрофаги; макрофаги соединительной ткани или макрофаги очага воспаления) с использованием общепринятых методик.

Помещают исследуемые клетки в стерильную одноразовую чашку Петри d=4cм, добавляют антибиотики (гентамицин 1 мг/мл и пенициллин 1 мг/мл), 85% среды 199, 10% сыворотки КРС и 5% экстракта коровьего эмбриона. Ставят чашку Петри в стерильный эксикатор с 5% содержанием СО₂ на 7 суток в термостат при 37 С°. Затем вынимают из термостата чашку Петри, содержащую тканевые макрофаги и цитокины, выделенные данными клетками, и переносят содержимое чашки в стерильную пробирку.

Проводят центрифугирование содержимого пробирки в течение 10 минут с целью осаждения клеток. Надосадочная жидкость (супернатант) содержит только цитокины, выделенные макрофагами во время длительного культивирования.

Выделяют моноциты периферической крови на градиенте плотности с использованием общепринятой методики. Выделенные моноциты помещают в две стерильные чашки Петри в равных количествах.

В одну из чашек добавляют 85% среды 199, 10% сыворотки КРС, 5% экстракта коровьего эмбриона и антибиотики (гентамицин 1 мг/мл и пенициллин 1 мг/мл), а во вторую чашку, помимо всего перечисленного, добавляют еще и цитокины, выделенные тканевыми макрофагами во время культивирования. Таким образом, в качестве контрольного образца используют моноциты, культивируемые без добавления супернатанта тканевых макрофагов.

Переносят чашки Петри в стерильный эксикатор с 5% содержанием СO₂ на 2 суток в термостат при 37 С°. Через 2 суток достают из термостата обе чашки Петри и сливают содержимое каждой чашки в соответствующие пробирки. За двое суток моноциты крови адгезировались на стерильной пластиковой поверхности чашки Петри, поэтому с целью получения максимального количества клеток добавляют в каждую чашку по 2 мл трипсина и помещают на 10 мин в термостат при 37°С. Через 10 мин сливают содержимое каждой чашки в соответствующие им пробирки и центрифугируют их при 1500 об/мин в течение 10 мин с целью осаждения моноцитов периферической крови.

В итоге получают следующее: в одной пробирке содержатся моноциты крови, культивируемые с цитокинами тканевых макрофагов, а во второй - моноциты, культивируемые без цитокинов.

Затем оценивают жизнеспособность клеток обеих пробирок, а также их адгезию на чистой обезжиренной стеклянной поверхности, способность к распластыванию, фагоцитоз частиц латекса и St. aureus, пероксидазную, лизосомальную, киллинговую активность, содержание энергетического субстрата (гликогена и липидов), спонтанный и индуцированный НСТ-тест и т.д.

Сравнивают исследуемые показатели у моноцитов из обеих пробирок. Исходя из того как моноциты периферической крови реагируют (изменяют свои функции) на секреторные продукты тканевых макрофагов, то есть повышаются или снижаются исследуемые показатели у моноцитов, культивируемых с цитокинами макрофагов по сравнению с контрольными величинами, можно судить о том, преимущественно какие цитокины (провоспалительные или противовоспалительные) были выделены тканевыми макрофагами и как данные цитокины повлияли на морфофункциональное состояние и цитохимическую активность моноцитов периферической крови.

В сравнении с прототипом предлагаемое изобретение по изучению суммарной секреторной активности тканевых макрофагов различных компартментов и исследованию способности моноцитов периферической крови отвечать на секреторные продукты тканевых макрофагов позволяет расширить представление о функциональной активности тканевых макрофагов и моноцитов, что дает возможность нового подхода к оценке свойств данных клеток в клинической практике и эксперименте и обеспечивает более широкие возможности применения заявляемого способа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии. Предложен способ оценки суммарной секреторной активности макрофагов различных компартментов в условиях длительного культивирования. Изобретение может использоваться для оценки суммарной секреторной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов различных компартментов в условиях длительного культивирования в клиниках, занимающихся иммунокоррекцией и иммуномодуляцией, а также оценкой иммунного статуса пациентов из групп риска.

Способ оценки суммарной секреторной активности макрофагов различных компартментов в условиях длительного культивирования, заключающийся в том, что выделяют необходимые макрофаги грызунов, в том числе перитонеальные, культивируют их путем инкубации, усиливают секрецию цитокинов, после инкубации собирают цитокины, центрифугируют полученный материал для осаждения макрофагов и выделения цитокинов из надосадочной жидкости, затем культивируют выделенные цитокины в присутствии клеток с добавлением питательной среды, 10% сыворотки КРС, и антибиотиков, в т.ч. гентамицина, открепляют от подложки с помощью трипсина исследуемые клетки, отмывают их 1 раз питательной средой, доводят их до концентрации 2×10 в шестой степени кл/мл и оценивают их активность, в частности жизнеспособность, сравнивая функции клеток, активированных цитокинами, и активность клеток без них, отличающийся тем, что в качестве макрофагов используют дополнительно альвеолярные макрофаги, полученные путем бронхоальвеолярного лаважа; клетки Купфера; селезеночные макрофаги; макрофаги соединительной ткани или макрофаги очага воспаления, для усиления секреции цитокинов первую инкубацию проводят в течение 7 суток в стерильном эксикаторе в присутствии 5% СО₂, берут в качестве клеток моноциты периферической крови, взятой у грызунов, которые разделяют на две равные порции, в обе из них добавляют в качестве питательной среды 85% среды 199, 5% экстракта коровьего эмбриона, 1 мг/мл гентамицина и 1 мг/мл пенициллина, а во вторую добавляют дополнительно цитокины, выделенные тканевыми макрофагами во время длительного культивирования, при этом первая порция служит контрольной, культивируют обе порции в стерильном эксикаторе в течение 2-х суток в присутствии 5% СО₂, затем открепляют с помощью раствора трипсина моноциты крови от пластиковой поверхности чашки Петри, центрифугируют каждую из порций в течение 10 мин при 1500 об/мин для осаждения моноцитов крови в каждой порции, культивируемых с цитокинами тканевых макрофагов и без цитокинов и оценивают жизнеспособность моноцитов из обеих пробирок, а также оценивают дополнительно другие их характеристики, такие как: адгезия на чистой обезжиренной стеклянной поверхности, способность к распластыванию, фагоцитоз частиц латекса и St. aureus, пероксидазная, лизосомальная, киллинговая активность, содержание энергетического субстрата (гликогена и липидов), спонтанный и индуцированный НСТ-тест, а затем сравнивают исследуемые показатели, отражающие состояние моноцитов из обеих пробирок и на основании этого делают заключение о суммарной активности различных компартментов по выработке цитокинов в условиях длительного культивирования.