СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ Российский патент 2012 года по МПК C12P23/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способу микробиологического производства каротиноидов. Более детально настоящее изобретение относится к основанному на микробной ферментации способу производства каротиноидов, таких как, например, астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, β-криптоксантин, ликопен, β-каротин, фоеникоксантин, адониксантин, эхиненон, астероиденон и 3-гидроксиэхиненон.

Уровень техники

Каротиноиды - это натуральные пигменты, применимые в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических ингредиентов и т.д. Каротиноиды включают в себя астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, β-криптоксантин, ликопен, β-каротин, фоеникоксантин, адониксантин, эхиненон, астероиденон и 3-гидроксиэхиненон. Среди перечисленного астаксантин применим в качестве улучшителя цвета тела искусственно выращенной рыбы, включая лосося, форель, красного морского леща, и/или применим в качестве кормовой добавки, такой как, например, улучшитель цвета желтка яиц домашней птицы. Астаксантин также ценится в промышленности в качестве безопасной и натуральной пищевой добавки или сырья для здоровой пищи. Как в случае астаксантина, адониксантин и фоеникоксантин также могут применяться в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических ингредиентов и тому подобного, после того как будет налажено их промышленное производство. Помимо этого, β-каротин применяется в качестве кормовой добавки, пищевой добавки, фармацевтических ингредиентов и тому подобного, кантаксантин применяется в качестве кормовой добавки, пищевой добавки, косметического ингредиента и тому подобного и зеаксантин применяется в качестве пищевой добавки, кормовой добавки и тому подобного. Кроме того, ликопен, эхиненон, β-криптоксантин, 3-гидроксиэхиненон, астероиденон и прочие вещества также могут применяться в качестве кормовых добавок, питательных веществ и тому подобного. Для производства этих каротиноидов известны химический синтез, экстракция из натуральных продуктов, производство с использованием микроорганизмов и другие технологии.

В качестве химического синтеза астаксантина известны превращение β-каротина (Непатентный документ 1: Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985) и синтез из C15 соли фосфония (Непатентный документ 2:Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981). Астаксантин, произведенный с помощью этих технологий химического синтеза, доступен с коммерческой точки зрения в качестве кормовой добавки. Астаксантин может также быть экстрагирован из рыбы (например, красного морского леща, лосося) и ракообразных (например, креветок, крабов, криля), так как астаксантин обнаружен в этих организмах.

Имеются сообщения о производстве астаксантина с помощью микроорганизмов культивированиием в зеленых водорослях Haematococcus pluvialis (Патентный документ 1: JP 2007-97584 A), ферментацией в красных дрожжах Phaffia rhodozyma (Патентный документ 2: JP H11-69969 A) и ферментацией в бактериях, принадлежащих к роду Paracoccus (в дальнейшем в этом документе называемым "Paracoccus sp. "). Примеры продуцирующих астаксантин бактерий, принадлежащих к роду Paracoccus, включают в себя штаммы E-396 и A-581-1 (Патентный документ 3: JP H7-79796 A и Непатентный документ 3: International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282). Другие продуцирующие астаксантин бактерии, принадлежащие к роду Paracoccus, включают в себя Paracoccus marcusii штамма MH1 (Патентный документ 4: JP 2001-512030 A), Paracoccus haeundaensis, штамм BC74171 (Непатентный документ 4: International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702), Paracoccus sp. штамма N-81106 (Патентный документ 5: JP 2007-244205 A), Paracoccus zeaxanthinifaciens (Непатентный документ 5: International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238) и Paracoccus sp. штамма PC-1 (Патентный документ 6: WO 2005/118812) и т.д.

Тем не менее, в вышеперечисленных технологиях производства каротиноидов существуют определенные проблемы. Например, химический синтез может оказывать неблагоприятное влияние на потребителей с точки зрения безопасности. Аналогично для экстракции из натуральных продуктов требуются высокие производственные затраты. Кроме того, производство в зеленых водорослях и дрожжах не только дает низкую продуктивность, но также существуют трудности с экстракцией каротиноидов из-за их жестких клеточных стенок.

В отличие от этого бактерия, принадлежащая к роду Paracoccus эффективна, например, она имеет высокую скорость роста, возможно достижение высокой продуктивности и легкой экстракции каротиноидов, и было представлено несколько сообщений о способах их культивирования. В патенте Японии 2007-143492 A (Патентный документ 7) раскрывается способ, в котором в процессе культивирования добавляется соль железа, наряду с тем, что в патенте Японии 2008-167665 A (Патентный документ 8) раскрывается способ, в котором лимитирована концентрация источника углерода. Тем не менее, эти способы непрактичны для коммерческих или промышленных целей вследствие использования в качестве материала для среды большого количества дорогого дрожжевого экстракта.

Документы смежных областей

Патентные документы

[Патентный документ 1] JP 2007-97584 A

[Патентный документ 2] JP H11-69969 A

[Патентный документ 3] JP H7-79796 A

[Патентный документ 4] JP 2001-512030 A

[Патентный документ 5] JP 2007-244205 A

[Патентный документ 6] WO 2005/118812 A

[Патентный документ 7] JP 2007-143492 A

[Патентный документ 8] JP 2008-167665 A

Непатентные документы

[Непатентный документ 1] Pure Appl. Chem., 57,741, 1985

[Непатентный документ 2] Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981

[Непатентный документ 3] International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282

[Непатентный документ 4] International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702

[Непатентный документ 5] International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238

Подробное описание изобретения

Проблемы, на решение которых направлено изобретение

Настоящее изобретение было осуществлено при этих обстоятельствах и преследует цель обеспечить способ микробиологического производства каротиноидов с высоким выходом и низкими затратами.

Средства для решения проблем

В результате различных попыток, осуществленных для решения проблем, изложенных выше, авторы настоящего изобретения обнаружили, что существует возможность улучшения продуктивности каротиноидов в культивировании производящих каротиноиды бактерий, когда среда, широко используемая для культивирования бактерий, сверх того дополнена аминокислотой или ее солью (например, глутаматом натрия). Это открытие привело к реализации настоящего изобретения.

А именно настоящее изобретение относится к способу производства каротиноидов, который включает культивирование каротиноид-продуцирующих бактерий в аминокислотно-дополненной среде и извлечение каротиноидов из полученного в результате культивирования продукта, в котором аминокислотой является, по меньшей мере, одна, выбранная из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глутамина, аспарагина, аланина, глицина, серина, треонина, аргинина, тирозина, пролина, фенилаланина и лейцина и их солей.

В упомянутом ранее способе предпочтительной аминокислотой является глутаминовая кислота или соль глутамата.

Концентрация дополнительной аминокислоты может быть, например, от 1 до 200 ммоль/л. В используемом в настоящем документе значении термин "концентрация дополнительной аминокислоты" предназначен для обозначения концентрации аминокислоты, достигнутой в среде, в которой аминокислота является дополнительной (то есть, концентрации дополняющей аминокислоты (аминокислот) в среде).

Каротиноидом может быть, например, по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из астаксантина, кантаксантина, зеаксантина, β-криптоксантина, ликопена, β-каротина, фоеникоксантина, адониксантина, эхиненона, астероиденона и 3-гидроксиэхиненона.

В упомянутом ранее способе предпочтительной бактерией для использования является бактерия, принадлежащая к роду Paracoccus. Такая бактерия может быть имеющей гомологию 95% или более в последовательности оснований ДНК, соответствующей 16S рибосомальной РНК по отношению к последовательности оснований представленной SEQ ID NO:1. В частности, штамм E-396 (FERM BP- 4283) или A-581-1 (FERM BP-4671) или их мутант предпочтительны для использования.

Эффект изобретения

Настоящее изобретение дает возможность более эффективного производства каротиноидов в высоких концентрациях. Настоящее изобретение также дает возможность микробиологического производства каротиноидов с низкой стоимостью.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет более подробно описано далее. Объем притязаний настоящего изобретения не лимитируется нижеследующим описанием, и оно может быть осуществлено в соответствующих модификациях, отличных от нижеследующих иллюстративных воплощений, без отклонения от характерных черт настоящего изобретения.

Все цитированные в данном документе публикации, например документы родственных отраслей знаний, выложенные патентные публикации, публикации патентов и другие связанные с патентами публикации, включены в настоящий документ в своем полном объеме путем ссылок. Описание Патентной заявки Японии №2008-268106, по которой настоящая заявка заявляет притязания на приоритет, включена в настоящий документ.

Настоящее изобретение относится к способу производства каротиноидов путем культивирования каротиноид-продуцирующих бактерий. Этот способ характеризуется тем, что среда дополнена специфической аминокислотой(ами). Способ по настоящему изобретению позволяет более эффективно и низкозатратно производить каротиноиды в высоких концентрациях.

Несмотря на то, что бактерии, используемые в настоящем изобретении, ни в коем случае не лимитированы, при условии, что они являются каротиноид-продуцирующими бактериями, более предпочтительными для использования являются бактерии, принадлежащие к роду Paracoccus. Среди бактерий, принадлежащих к роду Paracoccus, более предпочтительными для использования являются Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii, Paracoccus haeundaensis и Paracoccus zeaxanthinifaciens, в особенности Paracoccus carotinifaciens. Особенно характерные штаммы бактерий, принадлежащие к роду Paracoccus, включая Paracoccus carotinifaciens штамма E-396 и Paracoccus sp. штамма A-581-1 (FERM BP-4671), также предпочтительны для использования в настоящем изобретении.

Другими каротиноид-продуцирующими бактериями, предпочтительными для использования, являются бактерии, имеющие высокую гомологию последовательности оснований ДНК, соответствующей 16S рибосомальной РНК, по отношению к последовательности оснований штамма E-396, представленной SEQ ID NO:1. В используемом в данном документе значении фраза «имеющие высокую гомологию» предназначена, например, для обозначения того, что имеется гомология предпочтительно 95% или более, более предпочтительно 96% или более, еще более предпочтительно 97% или более, особенно предпочтительно 98% или более, наиболее предпочтительно 99% или более, между последовательностью оснований, представленной SEQ ID NO:1 и соответствующей последовательностью оснований сравниваемой бактерии.

Последовательность оснований ДНК, соответствующая 16S рибосомальной РНК, относится к последовательности оснований, имеющих T (тимин) вместо U (урацила) в последовательности оснований 16S рибосомальной РНК.

Классификация микробов на основании их гомологии в последовательности оснований 16S рибосомальной РНК стала основной тенденцией в последние годы. Традиционная классификация микробов основана на микробиологических свойствах микроорганизмов, таких как, например, подвижность, ауксотрофия, способность усвоения сахара и так далее и может приводить к неправильной классификации микроорганизмов в некоторых случаях, когда спонтанная мутация привела к фенотипическим изменениям и тому подобных. В отличие от этого последовательность оснований 16S рибосомальной РНК наследуется высоко стабильно, и, следовательно, классификация на основании их гомологии этой последовательности гарантирует заметно улучшенную достоверность результатов классификации в сравнении с традиционной классификацией.

Последовательность оснований 16S рибосомальной РНК в Paracoccus carotinifaciens штамма E-396 имеет гомологию 99,7%, 99,7%, 99,6%, 99,4%, 95,7%, 95,4% последовательности оснований 16S рибосомальной РНК в других производящих каротиноид бактериях, например, Paracoccus marcusii штамма DSM 11574, Paracoccus sp. штамма A-81106, Paracoccus haeundaensis штамма ВС 74171, Paracoccus sp. штамма A-581-1, Paracoccus zeaxanthinifaciens штамма ATCC 21588 и Paracoccus sp. штамма PC-1, соответственно, что показывает то, что они являются таксономически очень близко родственными штаммами. Таким образом, эти штаммы, как оказывается, составляют группу каротиноид-продуцирующих бактерий. По этой причине эти штаммы более предпочтительны для использования в настоящем изобретении и дают возможность эффективного производства каротиноидов.

В настоящем изобретении также возможно использование мутантных штаммов с повышенной производительностью каротиноидов. Примеры усовершенствованных мутантных штаммов включают в себя имеющие высокую способность продуцировать астаксантин (Патент Японии 2001-95500 А), селективно продуцирующие кантаксантин на высоких уровнях (Патент Японии 2003-304875 А), селективно продуцирующие зеаксантин и β-криптоксантин на высоких уровнях (Патент Японии 2005-87097 А) и селективно продуцирующие ликопен (Патент Японии 2005-87100 А).

Такие мутантные штаммы с повышенной продуктивностью каротиноидов могут быть получены путем мутагенеза и скрининга. Любая технология может быть использована для мутагенеза при условии, что она приводит к мутации(ям). Например, возможно использование химических технологий, в которых применяется мутаген, такой как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (НТГ) или этилметансульфонат (ЭМС), физические технологии такие как, например, ультрафиолетовая радиация или рентгеновская радиация, биологические технологии с применением рекомбинации гена или транспозонов и так далее. Несмотря на то, что бактерии, которые могут подвергаться мутации, не лимитированы, но все же они предпочтительно являются каротиноид-продуцирующими бактериями. Альтернативно такие мутантные штаммы могут быть генерированы в результате спонтанной мутации.

Любая технология может быть использована для скрининга мутантных штаммов, включая селекцию требуемого мутантного штамма на основании цвета колоний на агаровой среде, а также и селекцию требуемого мутантного штамма с помощью пигментного анализа на каротиноиды с использованием спектральной поглощательной способности, высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии и тому подобного на мутантных штаммах, культивированных в пробирках, сосудах, ферментационных емкостях и т.д.

Такие стадии мутагенеза и скрининга могут быть проведены один раз или, альтернативно, могут быть повторены два раза или более, например, так мутантный штамм, полученный с помощью мутагенеза и скрининга, подвергается дальнейшему мутагенезу и скринингу для получения мутантного штамма с повышенной продуктивностью.

Штамм E-396, включенный в список в качестве примера каротиноид-продуцирующей бактерии, использованной в настоящем изобретении, был помещен на международном уровне в International Patent Organism Depositary (Международный депозитарий патентованных организмов), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Национальный Институт прогрессивной промышленной науки и технологии), как это показано далее.

International Deposition Authority (Международный депозитарный орган): International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (former National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), Chuoh 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566

Идентификационный №.: E-396

Депозитный №: FERM BP-4283

Дата первоначального депонирования: 27 апреля, 1993

Так же штамм A-581-1, включенный в список в качестве другого примера каротиноид-продуцирующей бактерии, использованной в настоящем изобретении, был помещен на международном уровне в вышеупомянутый депозитарий, как это показано далее.

Идентификационный №: A-581-1

Депозитный №: BP-4671

Дата первоначального депонирования: 20 мая, 1994

В настоящем изобретении при культивировании в среде, дополненной специальной аминокислотой(ами), вышеуказанные каротиноид-продуцирующие бактерии могут продуцировать большие количества каротиноидов в более высоких концентрациях, чем в среде, не дополненной аминокислотой(ами).

Каротиноиды, произведенные с помощью способа настоящего изобретения, не лимитированы никоим образом. Примеры включают в себя астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, β-криптоксантин, ликопен, β-каротин, фоеникоксантин, адониксантин, эхиненон, астероиденон и 3-гидроксиэхиненон. Предпочтительными являются астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, β-криптоксантин, более предпочтительны астаксантин, зеаксантин или β-криптоксантин. Эти каротиноиды в настоящем изобретении могут быть произведены как по отдельности, так и в сочетании.

Способ культивирования вышеупомянутых бактерий в настоящем изобретении будет описан далее.

Для культуры в настоящем изобретении может быть использована любая среда для производства каротиноидов, без ограничений при условии, что это дополненная аминокислотой среда, содержащая в себе специфическую(ие) аминокислоту(ы), и она делает возможным рост и выработку каротиноидов каротинод-продуцирующими бактериями. Предпочтительно использование среды, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические соли и витамины по выбору и так далее. Конкретно, в настоящем изобретении аминокислота(ы) может быть добавлена к любой среде (например, стандартной среде для производства каротиноидов), в которой каротиноид-продуцирующие бактерии могут расти и продуцировать каротиноиды.

Примеры источников углерода включают в себя сахара, такие как, например, глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, трегалоза, манноза, маннитол и мальтоза; органические кислоты, такие как, например, уксусная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота, пропионовая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота; спирты, такие как, например, этанол, пропанол, бутанол, пентанол, гексанол, изобутанол и глицерин; а также жиры и масла, такие как, например, соевое масло, масло из рисовых отрубей, оливковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и льняное масло. Среди этого предпочтительно использование глюкозы и сахарозы. Могут быть использованы один или более источников углерода. Количество, которое должно быть добавлено к среде перед культивированием (первоначальная среда), будет варьироваться в зависимости от типа углеродного источника и может быть установлено соответствующим образом. Обычно это составляет от 1 до 100 г, предпочтительно от 2 до 50 г на литр среды. Кроме того, такие источники углерода могут быть добавлены не только к первоначальной среде, но также предпочтительно могут восполняться периодически или непрерывно в течение культивирования.

Примеры неорганических источников азота включают в себя соли аммония (например, нитрат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония), соли нитрата (например, нитрат калия), аммиак и мочевину, которые могут быть использованы вместе или в сочетании. Количество, которое может быть добавлено, будет варьироваться в зависимости от типа источников азота и может быть установлено соответствующим образом. Обычно от 0,1 до 20 г, предпочтительно от 0,2 до 10 г на литр среды.

Примеры органических источников азота включают в себя жидкий кукурузный экстракт (включая отфильтрованный жидкий кукурузный экстракт), Фармамедиа, соевую муку, соевый порошок, арахисовую муку, фильтрат барды и сушеные дрожжи, которые могут быть использованы как вместе, так и в сочетании. Концентрация, которая может быть добавлена, будет варьироваться в зависимости от типа источников азота и может быть установлена соответствующим образом. Обычно она составляет от 0 до 80 г/л, предпочтительно от 0 до 30 г/л.

Такие неорганические и органические источники азота обычно добавляются к первоначальной среде и также предпочтительно могут восполняться периодически или непрерывно в течение культивирования.

Примеры неорганических солей включают в себя соли фосфата (например, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, гидрофосфат натрия), соли магния (например, сульфат магния, хлорид магния), соли железа (например, сульфат железа, хлорид железа), соли кальция (например, хлорид кальция, карбонат кальция), соли натрия (например, карбонат натрия, хлорид натрия), соли марганца (например, сульфат марганца), соли кобальта (например, хлорид кобальта), соли меди (например, сульфат меди), соли цинка (например, сульфат цинка), соли молибдена (например, молибдат натрия), соли никеля (например, сульфат никеля), соли селения (например, селенат натрия), борную кислоту и йодид калия, которые могут быть использованы как по отдельности, так и в сочетании. Количество, которое может быть добавлено, будет варьироваться в зависимости от типа неорганической соли и может быть установлено соответствующим образом. Обычно оно составляет от 0,0001 до 15 г на литр среды. Предпочтительная концентрация составляет от 0,02 до 15 г/л для солей фосфата, солей магния, солей натрия и солей железа и от 0,1 до 15 мг/л для солей марганца, солей кобальта, солей меди, солей цинка, солей никеля, солей селена, борной кислоты, йодида калия и прочих. Такие неорганические соли обычно добавляются к первоначальной среде и также могут восполняться периодически или непрерывно в течение культивирования.

Примеры витаминов, которые могут быть использованы, включают в себя цианокобаламин, рибофлавин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, тиамин, аскорбиновую кислоту, фолиевую кислоту, ниацин, п-аминобензойную кислоту, биотин, инозит, холин и тому подобные. Соотношение, которое может быть добавлено, будет варьировать в зависимости от типа витамина и может быть установлено соответствующим образом. Обычно оно составляет от 0,001 до 1000 мг, предпочтительно от 0,01 до 100 мг на литр среды. Такие витамины обычно добавляются к первоначальной среде и также могут восполняться периодически или непрерывно в течение культивирования.

Настоящее изобретение характеризуется тем, что каротиноид-продуцирующие бактерии культивируются в дополненной аминокислотой среде для производства каротиноида, дополненного аминокислотой(ами). При культивировании в такой аминокислотно-дополненной среде для производства каротиноидов каротиноид-продуцирующие бактерии могут продуцировать большие количества каротиноидов в более высокой концентрации, чем в среде, не дополненной аминокислотой(ами).

Аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, являются чистыми продуктами (одинарными продуктами), очищенными в определенной степени, то есть выделенными продуктами, а не аминокислотами, включенными в состав встречающихся в природе смесей комплексных соединений (например, казаминовая кислота, дрожжевой экстракт, пептон). Встречающиеся в природе смеси могут содержать не только эффективные аминокислоты, но также нежелательные или ингибирующие компоненты и, кроме того, могут иметь разный состав композиции от партии к партии. Более того, встречающиеся в природе смеси такие как, например, казаминовая кислота, дрожжевой экстракт и пептон, дорогостоящие и, таким образом, менее пригодны для промышленного использования.

Очищенные аминокислоты предпочтительно имеют степень чистоты 90% или более, более предпочтительно 95% или боолее, еще более предпочтительно 98% или более, особенно предпочтительно 99% или более. Необходимо отметить, что аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, могут, кроме того, содержать другие неаминокислотные компоненты в степени, не ингибирующей рост каротиноид-продуцирующих бактерий, или в степени, не ингибирующей продукцию каротиноидов каротиноид-продуцирующими бактериями. Несмотря на то, что аминокислоты, используемые для этой цели, предпочтительно чистые аминокислоты, свободные от других компонентов, включающих примеси, неочищенные аминокислоты (например, аминокислоты со степенью чистоты менее 90%) также могут быть использованы при условии, что они не ингибируют продуцирование каротиноидов.

В качестве аминокислот, добавляемых к среде для производства каротиноидов, предпочтительны в использовании глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глутамин, аспарагин, аланин, глицин, серин, треонин, аргинин, тирозин, пролин, фенилаланин и лейцин и их соли. Эти аминокислоты предпочтительны в L-форме, но также могут быть в смеси L- и D-форм. Более предпочтительны глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глутамин, аспарагин и их соли, и еще более предпочтительны глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота и их соли. Из них глутаминовая кислота и ее соли предпочтительны из-за их высокого эффекта на продуцирование каротиноидов. L-глутамат натрия или его гидрат недорогие и, таким образом, особенно предпочтительны для использования.

Примеры солей с кислотами включают в себя соли неорганических кислот, такие как, например, соль гидрохлорида, соль гидробромида, соль сульфата и соль фосфата, а также соли органических кислот, такие как, например, соли муравьиной, уксусной или молочной кислоты. Подобным образом примеры солей с основаниями включают в себя соли щелочных металлов (например, соль натрия, соль калия), соли щелочно-земельных металлов (например, соль кальция, соль магния), соли органических оснований (например, соли триметиламина, триэтиламина или пиридина) и соль аммония.

Аминокислоты, добавляемые в среду для производства каротиноидов, являются, по меньшей мере, одной или более из вышеприведенных аминокислот. Несмотря на то, что может быть использована единственная аминокислота, также возможно использование двух или более аминокислот.

Среди незаменимых аминокислот цистеин, лизин, изолейцин и метионин обладают ингибирующим эффектом на продуцирование каротиноидов. Следовательно, в настоящем изобретении предпочтительно добавление к среде аминокислот за исключением этих аминокислот.

Несмотря на то, что такие аминокислоты обычно добавляются к первоначальной среде, они могут добавляться периодически или непрерывно в течение культивирования. Альтернативно аминокислоты могут быть добавлены к первоначальной среде и могут в дальнейшем добавляться непрерывно или периодически в течение культивирования.

В способе настоящего изобретения нет нижнего предела для концентрации дополнительной аминокислоты (то есть, концентрации дополнительных аминокислот в среде), но предпочтительна концентрация 1 ммоль/л или больше, более предпочтительно 3 ммоль/л или больше, еще более предпочтительно 5 ммоль/л или больше, особенно предпочтительно 10 ммоль /л и наиболее предпочтительно 15 ммоль/л или больше. Подобным образом, нет верхнего предела для концентрации дополнительной аминокислоты, но предпочтительна 200 ммоль/л или меньше, более предпочтительна 150 ммоль/л или меньше, еще более предпочтительна 100 ммоль/л или меньше, еще более предпочтительна 80 ммоль/л или меньше, особенно предпочтительна 60 ммоль/л или меньше и наиболее предпочтительна 50 ммоль/л или меньше. Таким образом, в настоящем изобретении концентрация дополнительной аминокислоты составляет примерно от 1 до 200 ммоль/л.

В настоящем изобретении может предпочтительно использоваться пеногаситель для подавления образования пузырьков в растворе культуры. Такой пеногаситель может быть любого типа без ограничений при условии, что он оказывает эффект подавления образования пузырьков или разрушает образовавшиеся пузырьки и обладает низким ингибирующим эффектом на продуцирующие бактерии. Примеры включают в себя пеногасители на спиртовой основе, пеногасители на основе простых полиэфиров, пеногасители на основе сложных эфиров, пеногасители на основе жирных кислот, пеногасители на основе кремния, пеногасители на основе сульфоната и прочие. Количество, которое может быть добавлено, будет варьировать в зависимости от типа пеногасителя и может быть установлено соответствующим образом. Обычно оно составляет от 0,01 до 10 г на литр среды.

Такие пеногасители обычно добавляются к первоначальной среде перед стерилизацией и могут в дальнейшем добавляться непрерывно или периодически в течение культивирования. При добавлении в течение культивирования такой пеногаситель может автоматически добавляться при детектировании пузырьков сенсором, или может добавляться через определенные интервалы с использованием программируемого таймера, или, для примера, может добавляться в ответ на скорость роста, например, в смеси с источником углерода, источником азота или регулятором pH для насыщения. Пеногаситель, добавляемый к первоначальной среде, и пеногаситель, добавляемый к культивируемому раствору во время культивирования, могут быть как одного, так и разных типов в зависимости от предназначаемого эффекта.

В настоящем изобретении аминокислотно-дополненная среда, которая дополнена аминокислотой(ами), имеет pH доведенный до значений от 2 до 12, предпочтительно от 6 до 9, более предпочтительно от 6,5 до 8,0. Также желательно поддерживать pH в вышеуказанных пределах во время культивирования. Примеры регуляторов pH включают в себя водный раствор гидрохлорида натрия, водный раствор гидрохлорида калия, водный раствор карбоната натрия, водный раствор аммиака, газообразный аммиак, водный раствор серной кислоты и их смесь.

В настоящем изобретении аминокислотно-дополненная среда стерилизуется перед использованием для бактериального культивирования. Стерилизация может быть выполнена в соответствии с тем, как это совершается специалистами в данной области. Например, среда в подходящем сосуде может быть стерилизована с помощью нагревания в автоклаве. Альтернативно среда может быть стерилизована с помощью фильтрации через стерильный фильтр.

В настоящем изобретении каротиноид-продуцирующие бактерии инокулируются в аминокислотно-дополненную среду, приготовленную соответственно, и культивируются при установленных условиях. Инокуляция может быть выполнена следующим образом: штаммы выращиваются соответствующим образом с помощью посева культуры в пробирки, колбы и ферментационные емкости и результирующие культивированные продукты каждый по отдельности добавляются в аминокислотно-дополненную среду для продуцирования каротиноидов. Любая среда без ограничений как с, так и без специальных аминокислот может быть использована для посева культур при условии, что она обеспечивает рост каротиноид-продуцирующих бактерий.

Культивирование выполняется в соответствующем культуральном сосуде. Такой культуральный сосуд может быть выбран соответствующим образом в зависимости от объема культуры и примерами таких сосудов являются пробирки, колбы, ферментационные емкости и прочие.

Температура культивирования установлена от 15 до 80°C, предпочтительно от 20 до 35°C, более предпочтительно от 25 до 32°C и культивирование выполняется при аэробных условиях обычно от 1 до 20 дней, предпочтительно от 2 до 12 дней, более предпочтительно от 3 до 9 дней. Культивирование при аэробных условиях включает в себя, например, встряхивание культуры или аэрирующее взбалтывание культуры, во время которых концентрация растворенного кислорода предпочтительно регулируется в определенных пределах. Контроль концентрации растворенного кислорода может быть выполнен, например, варьированием числа взбалтывающих вращений, объемом аэрирования, внутренним давлением и т.д. Концентрация растворенного кислорода регулируется предпочтительно на уровне от 0,3 до 10 ч./млн, более предпочтительно от 0,5 до 7 ч./млн и еще более предпочтительно от 1 до 5 ч./млн.

В настоящем изобретении количество каротиноидов в культивируемом продукте, полученных посредством культивирования каротиноид-продуцирущих бактериальных клеток, или количество каротиноидов, собранных из культивируемого продукта после определенных процедур очистки, может быть измерено с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Каротиноид-продуцирующие бактериальные клетки могут культивироваться, как описано выше, и каротиноиды могут быть собраны из результирующего культивированного продукта.

Такой культивированный продукт может быть в виде, например, раствора культуры, супернатанта культуры, концентрированного раствора микробных клеток, влажных микробных клеток, высушенных микробных клеток, лизата микробных клеток и так далее. Супернатант культуры может быть приготовлен из раствора культуры посредством центрифугирования или фильтрации для удаления микробных клеток из раствора культуры. Концентрированный раствор микробных клеток может быть получен из раствора культуры при концентрировании центрифугированием или фильтрацией через мембрану. Влажные микробные клетки могут быть получены из раствора культуры при концентрировании центрифугированием или фильтрацией. Высушенные микробные клетки могут быть получены из влажных микробных клеток или из концентрированного раствора микробных клеток при высушивании стандартными методами. Каротиноид-содержащие высушенные микробные клетки, полученные таким образом, могут быть напрямую использованы в качестве кормовых добавок.

В настоящем изобретении может быть без ограничений использована любая технология для того, чтобы собрать каротиноиды из ранее культивированного продукта при условии, что это дает возможность стабильного и эффективного сбора каротиноидов. Такая технология может быть выбрана соответствующим образом из технологий экстракции и очистки, известных специалистам в данной области.

Перед экстракцией каротиноидов из культивированного продукта, культивированный продукт может быть подвергнут одной или большему количеству процедур, выбранных из числа химических процедур с щелочными реагентами, поверхностно-активными веществами и тому подобными, биохимических процедур с лизирующими ферментами, липолитическими ферментами, протеолитическими ферментами и тому подобными или физических процедур таких как, например, обработка ультразвуком или гомогенизация.

Например, когда каротиноиды экстрагируются из культивированного продукта, может быть без ограничений использован любой растворитель для экстракции и промывки, включая низшие спирты (например, метанол, этанол, изопропанол), ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, дихлорметан, хлороформ, диметилформамид, диметилсульфоксид и пр.

Для минимизации окисления каротиноидов во время этапа выделения культивированный продукт может обрабатываться в атмосфере инертного газа такого как, например, азот. Кроме того, антиоксидант, используемый в фармацевтических препаратах или пищевых продуктах, может также быть добавлен к экстрагирующему растворителю. Альтернативно эти процедуры могут быть использованы в сочетании.

Дополнительно для минимизации светоиндуцированной деградации каротиноидов культивированный продукт может очищаться в условиях защиты от света.

Экстракт, полученный таким образом, может быть использован напрямую в качестве фракции каротиноидов или может быть в дальнейшем очищен перед использованием.

Любая без ограничений технология может быть использована для отделения бактериальных клеток или других компонентов из экстракта после этапа экстракции. Примеры включают в себя фильтрацию через мембрану, центрифугирование, декантацию и т.д.

Технологии, обычно используемые в целях получения каротиноидных осадков из экстракта, включают в себя концентрацию при нагревании и/или пониженном давлении, а также кристаллизацию. Альтернативно каротиноидные пигменты могут быть отделены без концентрирования, осаждением при низкой температуре или осаждением с кислотными и/или щелочными агентами или с различными солями.

Для промышленных целей желательна кристаллизация.

Полученные каротиноидные осадки, по желанию, могут быть ресуспендированы и перемешаны в малом объеме растворителя (например, в низшем спирте) в целях промывки.

Процедуры промывки не ограничены никоим образом и предпочтительные с практической точки зрения процедуры включают в себя те, в которых осадки собираются посредством фильтрации после ресуспендирования и перемешивания, или те, в которых раствор над осадком удаляется.

Культивированный продукт, экстракт или очищенный продукт, полученный как описано выше, может быть использован в качестве каротиноидной фракции как отдельно, так и в смеси в любых соотношениях.

Примеры

Настоящее изобретение будет в дальнейшем описано более подробно посредством нижеследующих иллюстративных примеров. Объем притязаний настоящего изобретения не ограничивается нижеследующими примерами.

В примерах был проведен количественный анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как изложено ниже.

Две колонки Wakosil-II 5 (⌀4,6×250 мм) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) были соединены одна к другой для использования в качестве одной колонки. Элюция выполнялась потоком смеси растворов н-гексан-тетрагидрофуран-метанол (40:20:1), который являлся подвижной фазой при скорости потока 1,0 мл/мин при постоянной температуре на уровне комнатной температуры. Измерения выполнялись, как изложено ниже. Каждый из образцов был растворен в тетрагидрофуране и далее был разбавлен 100-кратно подвижной фазой. Каждое разбавление было внесено в объеме 20 мкл. Элюат из колонки был детектирован при длине волны 470 нм. В качестве контроля для количественного анализа был использован астаксантин (SIGMA, № по каталогу A9335). Концентрация астаксантина в растворе контроля была определена с использованием следующего уравнения после измерения абсорбции (A) контрольного раствора при 477 нм и площади пика астаксантина в процентах (B) во время анализа ВЭЖХ при вышеуказанных условиях.

Концентрация астаксантина (мг/л) = A/2150×В×100

Пример 1

Среда следующего состава (сахароза 30 г/л, жидкий кукурузный экстракт 30 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 0,3 г/л, pH 7,2) была распределена на 8 мл объемов в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм, стерилизовалась в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в пробирках для посева культуры.

Затем среда следующего состава (глюкоза 30 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 5 г/л, сульфат аммония 1,5 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 0,6 г/л, пеногаситель на основе сложного эфира 0,2 г/л) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм (всего 21 пробирка).

Среды в этих пробирках были дополнены двадцатью аминокислотами, то есть глицином, аланином, валином, лейцином, изолейцином, серином, треонином, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой, аспарагином, глутамином, лизином, аргинином, цистеином, метионином, фенилаланином, тирозином, триптофаном, гистидином и пролином, соответственно, в концентрации 1,0 г/л. Одна из пробирок в качестве контроля не была дополнена ни одной аминокислотой. В довершение ко всему pH среды в пробирках был доведен до 7,1 водным раствором гидроксида натрия или водным раствором серной кислоты и после этого среда была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 20 минут.

Paracoccus carotinifaciens, штамм E-396 (FERM BP-4283) был инокулирован в среду в пробирке для посева культуры и после этого культивировали при встряхивании при 28°C в течение 2 дней при 300 оборотах в минуту. 0,1 мл из результирующего культивированного раствора было инокулировано в 21 пробирку со средой, соответственно, и культивировалось при встряхивании при 28°C в течение 4 дней при 300 оборотах в минуту.

Концентрация каротиноидов в каждом культивированном растворе была измерена с помощью ВЭЖХ, и рост микробных клеток был определен с помощью OD610 (абсорбция при 610). Как это показано в Таблице 1, было обнаружено, что глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глутамин, аспарагин, аланин, глицин, серин, треонин, аргинин, тирозин, пролин, фенилаланин и лейцин оказывали стимулирующий эффект на выработку каротиноидных пигментов. Было обнаружено, что цистеин, лизин, изолейцин и метионин, напротив, проявляли явный ингибирующий эффект на продуцирование каротиноидов (Таблица 1).

Таблица 1 Дополнительный компонент OD610 Астаксантин,
мг/л Общее количество каротиноидов,
мг/л Глицин 18 6,2 19,0 Аланин 13 6,2 20,3 Валин 10 3,0 9,2 Лейцин 11 4,7 10,1 Изолейцин 6 1,3 4,5 Серин 13 6,0 16,4 Треонин 8 5,2 12,5 Аспарагиновая кислота 18 9,4 27,0 Глутаминовая кислота 17 10,7 28,2 Аспарагин 14 8,1 24,2 Глутамин 17 8,3 25,8 Лизин 11 1,1 4,9 Аргинин 13 5,1 11,7 Цистеин 4 0,7 3,2 Метионин 7 1,4 5,0 Фенилаланин 10 4,9 10,6 Тирозин 12 5,0 11,3 Триптофан 10 3,0 7,0 Гистидин 8 3,3 8,1 Пролин 13 5,0 10,9 Без аминокислоты 9 2,6 5,9

Пример 2

Среда следующего состава (глюкоза 20 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 5 г/л, дигидрофосфат калия 0,54 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата калия 2,78 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 3,0 г/л, пеногаситель на спиртовой основе 0,2 г/л, pH 7,5) была распределена на объемы по 100 мл в 500 мл в закрытые ватными пробками колбы Эрленмейера и стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в колбах для посева культуры в 8 колб.

Затем среда следующего состава (глюкоза 40 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 30 г/л, сульфат аммония 0,5 г/л, дигидрофосфат калия 2,25 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 5,7 г/л, дигидрат хлорида кальция 0,1 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,5 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 5 г/л, пеногаситель на спиртовой основе 0,5 г/л) была разделена на объемы по 2,0 л в 5 л ферментационные емкости (всего 8 емкостей). В эти емкости был добавлен моногидрат L-глутамата натрия в количествах 0, 1, 5, 15, 30, 50, 100 и 200 ммоль/л, соответственно, после чего была проведена стерилизация в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.

Петля для посева с Paracoccus carotinifaciens, штамм E-396 (FERM BP-4283), был инокулирован в среду в ферментационной емкости для посева культуры и после этого культивировали с вращательным встряхиванием при 29°C в течение 2 дней при 100 оборотах в минуту. 80 мл результирующего культивированного раствора было инокулировано в индивидуальные ферментационные емкости и после этого культивировался аеробно при 29°C при одном аэрирующем объеме на объем культуры в минуту в течение 100 часов. Для поддержки в культуре pH 7,2, pH постоянно регулировался 15% водным раствором аммиака. Глюкоза добавлялась в количестве 30 г в день в первый и второй дни для предотвращения истощения. В добавление минимальное количество взбалтывающих вращений было установлено на уровне 200 оборотов в минуту, и количество взбалтывающих вращений варьировалось так, чтобы концентрация растворенного кислорода в культивируемом растворе поддерживалась на уровне от 2 до 4 ч./млн. Образование пузырей детектировалось датчиком пузырей и подавлялось автоматическим добавлением пеногасителя на спиртовой основе.

По окончании культивирования в каждом культивированном растворе была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты показаны в Таблице 2. Было обнаружено, что все образцы, содержавшие глутаминовую кислоту в концентрации от 1 до 200 ммоль/л, проявляли более высоко продуцированную концентрацию каротиноидов по сравнению с образцами без глутаминовой кислоты.

Таблица 2 Концентрация глутаминовой кислоты, ммоль/л 0 1 5 15 30 50 100 200   Продуцированная концентрация каротиноидов, мг/л β-каротин 3,5 4,3 6,2 5,8 5,9 4,9 5,5 4,6 Эхиненон 1,3 1,6 1,9 2,1 2,2 2,3 2,0 1,7 3-гидроксиэхиненон 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 Кантаксантин 1,8 2,0 3,7 3,0 3,1 2,0 2,8 2,4 Фоеникоксантин 4,4 5,1 7,8 7,2 7,4 6,4 7,0 5,9 β-криптоксантин 0,04 0,05 0,07 0,07 0,08 0,07 0,06 0,05 Астаксантин 12,9 18,3 27,3 30,8 30,3 30,9 28,6 23,5 Астероиденон 0,4 0,4 0,4 0,6 0,6 0,9 0,6 0,5 Адониксантин 5,9 7,8 7,8 9,6 9,3 10,8 9,2 7,6 Зеаксантин 0,12 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,18 0,15 Общее содержание каротиноидов 30,6 39,9 55,7 59,7 59,4 58,9 56,2 46,7

Пример 3

Paracoccus carotinifaciens, штамм E-396 был подвергнут мутациям с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина для отбора колоний темно-красного цвета. Отобранные штаммы были проанализированы на содержание каротиноидов в растворе их культуры для выбора мутантного штамма Y-1071 с повышенной астаксантиновой продуктивностью.

Среда следующего состава (сахароза 30 г/л, Фармамедиа 30 г/л, дигидрофосфат калия 0,8 г/л, гидрофосфат калия 4,2 г/л, дигидрат хлорида кальция 1 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 12 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 1 г/л, pH 7,2) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм и была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в пробирках для посева культуры.

Затем среда следующего состава (сахароза 30 г/л, Фармамедиа 20 г/л, сульфат аммония 1,5 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 0,1 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 4,5 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 5 г/л, биотин 1 мг/л, пеногаситель на кремниевой основе 1 г/л) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм (всего 2 пробирки). Одна из пробирок была дополнена моногидратом L-глутамата до 30 ммоль/л, тогда как другая пробирка в качестве контроля не была дополнена ни одной аминокислотой. В довершение ко всему pH среды в пробирках был доведен до 7,1 раствором гидроксида натрия и после этого был стерилизован в автоклаве при 121°C в течение 20 минут.

Paracoccus sp., штамм Y-1071, отобранный ранее, был инокулирован в среду в пробирке для посева культуры и после этого культивировали при встряхивании при 28°C в течение 2 дней при 300 оборотах в минуту. 0,1 мл от объема результирующего культивированного раствора было после этого инокулировано в две пробирки со средой и культивировалось при встряхивании при 28°C в течение 4 дней при 300 оборотах в минуту.

В каждом культивированном растворе была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в Таблице 3.

В мутантном штамме Y-1071 Paracoccus sp. в образце, содержавшем глутаминовую кислоту, была обнаружена более высоко продуцированная концентрация каротиноидов по сравнению с образцом без глутаминовой кислоты.

Таблица 3 Концентрация глутаминовой кислоты 0 ммоль/л 30 ммоль/л β-каротин мг/л 6,9 13,1 Эхиненон мг/л 3,4 6,5 3-гидроксиэхиненон мг/л 0,4 0,7 Кантаксантин мг/л 5,5 10,0 Фоеникоксантин мг/л 13,6 24,8 β-криптоксантин мг/л 0,04 0,10 Астаксантин мг/л 46,4 94,8 Астероиденон мг/л 0,9 1,5 Адониксантин мг/л 11,3 18,4 Зеаксантин мг/л 0,17 0,28 Общее содержание каротиноидов мг/л 88,7 170,2

Пример 4.

Среда следующего состава (глюкоза 20 г/л, сухие дрожжи 5 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 0,1 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 3 г/л, pH 7,2) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм и была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в пробирках для посева культуры.

Затем среда следующего состава (глюкоза 40 г/л, сульфат аммония 1,5 г/л, дигидрофосфат калия 0,54 г/л, гидрофосфат калия 2,78 г/л, дигидрат хлорида кальция 1 г/л, хлорид натрия 3 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 5 г/л, 7-водный гидрат сульфата цинка 2 мг/л, 6-водный гидрат хлорида кобальта 2 мг/л, 5-водный гидрат сульфата меди 1 мг/л, 5-водный гидрат сульфата марганца 4 мг/л, дигидрат молибдата натрия 2 мг/л, 6-водный гидрат сульфата никеля 1 мг/л, селенат натрия 0,5 мг/л, борная кислота 5 мг/л, йодид калия 1 мг/л, цианокобаламин 1 мг/л, рибофлавин 10 мг/л, пантотенат кальция 15 мг/л, соль гидрохлорида пиридоксина 20 мг/л, соль гидрохлорида тиамина 30 мг/л, аскорбиновая кислота 30 мг/л, фолиевая кислота 1 мг/л, ниацин 15 мг/л, п-аминобензойная кислота 10 мг/л, биотин 0,1 мг/л, миоинозитол 50 мг/л, холин 10 мг/л, пеногаситель на основе полимера простого эфира 0,2 г/л) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм (всего 4 пробирки).

Для использования в этой среде глюкоза, неорганические соли, содержащие металлы соединения и витамины были приготовлены по отдельности. Глюкоза, неорганические соли и содержащие металлы соединения были стерилизованы нагреванием при 121°C в течение 15 минут, тогда как витамины были стерилизованы путем фильтрации. После этого эти 4 раствора были смешаны вместе.

Затем одна из пробирок была дополнена стерилизованным нагреванием моногидратом L-глутамата натрия до 6 г/л (32 ммоль/л), вторая пробирка была дополнена стерилизованным нагреванием водным экстрактом дрожжей до концентрации 6 г/л, третья пробирка была дополнена тем же стерилизованным нагреванием водным экстрактом дрожжей до концентрации 12 г/л и последняя пробирка не была дополнена ничем. В заключение, среда в пробирках была в стерильных условиях дополнена 12% водным раствором аммиака для достижения pH 7,2.

Мутантный штамм Y-1071 Paracoccus sp., выбранный в Примере 3, был инокулирован в среду в пробирках для посева культуры и после этого культивировался при встряхивании при 30°C в течение 2 дней при 300 оборотах в минуту. 0,1 мл результирующего раствора культуры было инокулировано в 4 пробирки со средой и культивировали при встряхивании при 30°C в течение 3 дней при 300 оборотах в минуту.

В каждом растворе культуры была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Как показано в Таблице 4, было обнаружено, что в образце, содержавшем глутаминовую кислоту, наблюдалась более высоко продуцированная концентрация каротиноидов по сравнению с образцом без глутаминовой кислоты. Было обнаружено, что ни один из образцов, содержавших экстракт дрожжей, не имел значительно улучшающего эффекта, соизмеримого с эффектом в образцах, содержавших глутаминовую кислоту.

Таблица 4   Продуцированная концентрация каротиноидов, мг/л Контроль Глутаминовая кислота
6 г/л Дрожжевой экстракт
6 г/л Дрожжевой экстракт
12 г/л β-каротин 1,1 2,0 1,5 1,4 Эхиненон 0,5 0,9 0,7 0,5 3-гидроксиэхиненон 0,1 0,2 0,2 0,1 Кантаксантин 0,9 1,8 1,4 1,2 Фоеникоксантин 1,9 4,1 2,6 2,4 β-криптоксантин 0,01 0,02 0,01 0,01

Астаксантин 5,3 13,7 7,7 6,1 Астероиденон 0,1 0,2 0,1 0,1 Адониксантин 1,4 3,3 1,7 1,6 Зеаксантин 0,03 0,06 0,04 0,04 Общее содержание каротиноидов 11,1 26,3 16,0 13,5

Пример 5.

Среда следующего состава (сахароза 20 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 5 г/л, дигидрофосфат калия 0,54 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 2,78 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 3,0 г/л, пеногаситель на спиртовой основе 0,2 г/л, pH 7,5) была распределена на объемы по 100 мл в 500-мл закрытые ватными пробками колбы Эрленмейера и была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в колбах для посева культуры в 2 колбы.

Затем среда следующего состава (глюкоза 40 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 30 г/л, сульфат аммония 0,5 г/л, дигидрофосфат калия 2,25 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 5,7 г/л, дигидрат хлорида кальция 0,1 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,5 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 5 г/л, пеногаситель на спиртовой основе 0,5 г/л) была распределена на объемы по 2,0 л в 5 л ферментационные емкости (всего 2 емкости). Одна из ферментационных емкостей была дополнена моногидратом L-глутамата натрия до 15 ммоль/л, в то время как другая в качестве контроля не была ничем дополнена. Ферментационные емкости были стерилизованы в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.

Петля для посева с Paracoccus sp., штамм A-581-1 (FERM BP-4671) был инокулирован в среду в колбе для посева культуры и после этого культивировали вращательным встряхиванием при 27°C в течение 2 суток при 150 оборотах в минуту. Результирующий культивированный раствор был инокулирован в 90 мл объемы в индивидуальные ферментационные емкости и после этого культивировался аэробно при 27°C при одном аэрирующем объеме на объем культуры в минуту в течение 100 часов. Для поддержки в культуре pH 7,1, pH постоянно регулировался 20% водным раствором гидроксида натрия. Глюкоза добавлялась в количестве 30 г в день в первый и второй дни для предотвращения глюкозного истощения. На 22 и 29 часы культивирования были добавлены моногидрат L-глутамата натрия и сульфат аммония в количестве 5 г и 3 г, соответственно, на литр первоначальной культуры. Минимальное количество взбалтывающих вращений было установлено на уровне 100 оборотов в минуту и количество взбалтывающих вращений варьировалось так, чтобы концентрация растворенного кислорода в культивируемом растворе поддерживалась на уровне от 2 до 4 ч./млн. Пеногаситель на спиртовой основе добавлялся в количестве 0,1 г в час для предотвращения образования пузырей.

По окончании культивирования в каждом растворе культуры была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты показаны в Таблице 5. Было обнаружено, что образцы, содержащие глутаминовую кислоту, проявляли более высоко продуцированную концентрацию каротиноидов по сравнению с образцами без глутаминовой кислоты.

Таблица 5 Концентрация глутаминовой кислоты 0 ммоль/л 15 ммоль/л β-каротин мг/л 0,92 1,76 Эхиненон мг/л 0,30 0,51 3-гидроксиэхиненон мг/л 0,03 0,05 Кантаксантин мг/л 0,56 1,22 Фоеникоксантин мг/л 1,13 2,01 β-криптоксантин мг/л 0,00 0,01 Астаксантин мг/л 3,13 5,97 Астероиденон мг/л 0,01 0,02 Адониксантин мг/л 1,55 2,10 Зеаксантин мг/л 0,02 0,03 Общее содержание каротиноидов мг/л 7,65 13,68

Пример 6

Paracoccus sp., штамм A-581-1 (FERM BP-4671) был подвергнут мутации с помощью ультрафиолетового излучения для отбора колоний темно-красного цвета. Отобранные штаммы были проанализированы на содержание каротиноидов в растворе их культур для отбора мутантного штамма K-185 с повышенной продуктивностью астаксантина.

Среда следующего состава (сахароза 30 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 30 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 0,3 г/л, pH 7,2) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм и была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в пробирках для посева культуры.

Затем среда следующего состава (глюкоза 30 г/л, соевая мука 20 г/л, сульфат аммония 1,5 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 5 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 0,6 г/л, пеногаситель на основе полимера сложного эфира 0,2 г/л) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм (всего 2 пробирки). Одна из пробирок был дополнена моногидратом L-глутамата натрия до 30 ммоль/л, тогда как другая в качестве контроля не была ничем дополнена. В довершение ко всему pH среды в пробирках был доведен до 7,1 водным раствором аммиака и после этого была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 20 минут.

Paracoccus sp., штамм K-185, был инокулирован в среду в пробирках для посева культуры и после этого культивировали при встряхивании при 28°C в течение 2 дней при 300 оборотах в минуту. 0,1 мл от объема результирующего раствора культуры было инокулировано в 2 пробирки со средой и культивировали при встряхивании при 28°C в течение 3 дней при 300 оборотах в минуту. В каждом растворе культуры была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в Таблице 6.

В мутантном штамме K-185 Paracoccus sp. в образце, содержавшем глутаминовую кислоту, была обнаружена более высоко продуцированная концентрация каротиноидов по сравнению с образцом без глутаминовой кислоты.

Таблица 6 Концентрация глутаминовой кислоты 0 ммоль/л 30 ммоль/л β-каротин мг/л 1,3 2,1 Эхиненон мг/л 0,4 0,6 3-гидроксиэхиненон мг/л 0,1 0,1 Кантаксантин мг/л 0,9 1,3 Фоеникоксантин мг/л 1,3 2,0 β-криптоксантин мг/л 0,01 0,02 Астаксантин мг/л 5,6 9,2 Астероиденон мг/л 0,1 0,1 Адониксантин мг/л 1,2 1,6 Зеаксантин мг/л 0,02 0,03 Общее содержание каротиноидов мг/л 10,9 17,1

Пример 7

Штамм E-396 (FERM BP-4283) был подвергнут мутациям с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина для отбора колоний мутантного штамма темно-пурпурного цвета. Растворы их культур были в дальнейшем проанализированы на содержание каротиноидов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии для выбора штамма L-25 специфически продуцирующего ликопен.

Среда следующего состава (сахароза 30 г/л, жидкий кукурузный экстракт 30 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 0,3 г/л, pH 7,2) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм и стерилизовалась в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в пробирках для посева культуры.

Затем среда следующего состава (глюкоза 30 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 5 г/л, сульфат аммония 1,5 г/л, дигидрофосфат калия 1,5 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 3,8 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 0,6 г/л, пеногаситель на основе сложного эфира 0,2 г/л) была распределена на объемы по 8 мл в закрытые ватными пробками пробирки с внутренним диаметром 18 мм (всего 2 пробирки). Одна из пробирок была дополнена моногидратом L-глутамата натрия до 30 ммоль/л, тогда как другая в качестве контроля не была дополнена ничем. В довершение ко всему pH среды в пробирках был доведен до 7,1 водным раствором аммиака и после этого была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 20 минут.

Paracoccus sp., штамм L-25, выбранный ранее, был инокулирован в среду в пробирках для посева культуры и после этого культивировали при встряхивании при 28°C в течение 2 дней при 300 оборотах в минуту. 0,1 мл результирующего раствора культуры было инокулировано в 2 пробирки со средой и культивировалось при встряхивании при 28°C в течение 3 дней при 300 оборотах в минуту. В каждом растворе культуры была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в Таблице 7.

Было обнаружено, что мутантный штамм L-25 Paracoccus sp. в образце, содержавшем глутаминовую кислоту, проявлял более высоко продуцированную концентрацию каротиноидов по сравнению с образцом без глутаминовой кислоты.

Таблица 7 Концентрация глутаминовой кислоты 0 ммоль/л 30 ммоль/л Ликопен мг/л 12,3 19,6 Астаксантин мг/л 0,2 0,3 Адониксантин мг/л 0,2 0,3 Общее содержание каротиноидов мг/л 12,7 20,2

Пример 8.

Среда следующего состава (сахароза 20 г/л, фильтрованный жидкий кукурузный экстракт 5 г/л, дигидрофосфат калия 0,54 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата калия 2,78 г/л, дигидрат хлорида кальция 5,0 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,7 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 3,0 г/л, пеногаситель на основе жирной кислоты 0,2 г/л, pH 7,5) была распределена на объемы по 100 мл в 500 мл закрытые ватными пробками колбы Эрленмейера и была стерилизована в автоклаве при 121°C в течение 15 минут для приготовления среды в колбах для посева культуры в 2 колбы.

Затем среда следующего состава (сахароза 40 г/л, жидкий кукурузный экстракт 30 г/л, сульфат аммония 0,5 г/л, дигидрофосфат калия 2,25 г/л, 12-водный гидрат гидрофосфата натрия 5,7 г/л, дигидрат хлорида кальция 0,1 г/л, 7-водный гидрат сульфата магния 0,5 г/л, 7-водный гидрат сульфата железа 5 г/л, пеногаситель на основе жирной кислоты 0,5 г/л,) была распределена на объемы по 2,0 л в 5 л ферментационные емкости (всего 2 емкости). Одна из ферментационных емкостей была дополнена моногидратом L-глутамата натрия до концентрации 50 ммоль/л, тогда как другая в качестве контроля не была дополнена ничем. Ферментационные емкости были стерилизованы в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.

Петля для посева с Paracoccus sp., штамм Y-1071, выбранный в Примере 3, был инокулирован в среду в колбе для посева культуры и после этого культивировали с вращательным встряхиванием при 28°C в течение 2 дней при 150 оборотах в минуту. 80 мл результирующего раствора культуры было инокулировано в индивидуальные ферментационные емкости и после этого культивировали в аэробных условиях при 28°C при одном аэрирующем объеме на объем культуры в минуту в течение 120 часов. Для поддержки в культуре pH 7,2 в течение культивирования pH постоянно регулировался 15% водным раствором аммиака. Глюкоза добавлялась в количестве 30 г в день в первый, второй и третий дни для предотвращения глюкозного истощения. Минимальное количество взбалтывающих вращений было установлено на уровне 100 оборотов в минуту и количество взбалтывающих вращений варьировалось так, чтобы концентрация растворенного кислорода в культивируемом растворе поддерживалась на уровне от 2 до 3 ч./млн. Образование пузырей детектировалось датчиком пузырей и подавлялось автоматическим добавлением пеногасителя на основе жирной кислоты.

По окончании культивирования в каждом растворе культуры была измерена концентрация каротиноидов с помощью ВЭЖХ. Полученные результаты представлены в Таблице 8. Было обнаружено, что образец, содержавший глутаминовую кислоту, проявлял более высоко продуцированную концентрацию каротиноидов по сравнению с образцом без глутаминовой кислоты.

Таблица 8 Концентрация глутаминовой кислоты 0 ммоль/л 50 ммоль/л β-каротин мг/л 57 93 Эхиненон мг/л 32 62 3-гидроксиэхиненон мг/л 5 10 Кантаксантин мг/л 58 101 Фоеникоксантин мг/л 131 217 β-криптоксантин мг/л 0,3 0,5 Астаксантин мг/л 376 805 Астероиденон мг/л 5 9 Адониксантин мг/л 70 158 Зеаксантин мг/л 2 3 Общее содержание каротиноидов мг/л 737 1458

Свободный текст списка последовательностей

SEQ ID NO:1: Пояснение: неизвестный организм (E-396)

n = a, c, g или t (Локализация: 1350)

Изобретение относится к области микробиологии и микробной ферментации. Предложен способ производства каротиноидов, который включает культивирование каротиноид-продуцирующей бактерии в аминокислотно-дополненной среде и сбор каротиноидов из результирующего культивированного продукта, где, но меньшей мере, одна аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глутамина, аспарагина, аланина, глицина, серина, треонина, аргинина, тирозина, пролина, фенилаланина и лейцина и их солей, а каротиноид-продуцирующая бактерия относится к роду Paracoccus. Изобретение может быть использовано при получении натуральных пигментов, применимых в качестве кормовых и пищевых добавок, фармацевтических ингредиентов. 5 з.п. ф-лы, 8 табл., 8 пр.

1. Способ производства каротиноидов, который включает: культивирование каротиноидпродуцирующей бактерии в аминокислотно-дополненной среде и сбор каротиноидов из результирующего культивированного продукта, где по меньшей мере одна аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глутамина, аспарагина, аланина, глицина, серина, треонина, аргинина, тирозина, пролина, фенилаланина и лейцина и их солей, где каротиноидпродуцирующая бактерия принадлежит к роду Paracoccus.

2. Способ по п.1, где аминокислотой является глутаминовая кислота или соль глутамата.

3. Способ по п.1, где концентрация дополняющей аминокислоты составляет от 1 до 200 ммоль/л.

4. Способ по п.1, где по меньшей мере один каротиноид выбран из группы, состоящей из астаксантина, кантаксантина, зеаксантина, β-криптоксантина, ликопена, β-каротина, фоеникоксантина, адониксантина, эхиненона, астероиденона и 3-гидроксиэхиненона.

5. Способ по п.1, где бактерия имеет гомологию 95% или более последовательности оснований ДНК, соответствующей 16S рибосомальной РНК, по отношению к нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.

6. Способ по п.1, где бактерия представляет собой штамм Е-396 (FERM ВР-4283) или А-581-1 (FERM BP-4671) или является их мутантом.