ШТАММ "ВН-96" ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N7/00 A61K39/225 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), и может быть использовано при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности.

ТГЭС является острым высококонтагиозным заболеванием свиней, которое широко распространено во многих странах с развитым свиноводством и причиняет большой экономический ущерб. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов. Однако наиболее восприимчивыми являются новорожденные поросята до 2-недельного возраста, уровень летальности среди которых может достигать 100%. Заболевание сопровождается изнуряющей диареей, рвотой и дегидратацией. Этиологическим агентом трансмиссивного гастроэнтерита является представитель семейства Coronaviridae.

В настоящее время для профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней в России и за рубежом распространение получили живые и инактивированные вирусовакцины из аттенуированных или убитых штаммов вируса ТГЭС.

Известны штаммы для получения инактивированных вирусовакцин, разработанные Федеральным государственным учреждением «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ ВНИИЗЖ):

- «Ленинградский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (см. патент РФ №2266326 по кл. МПК C12N 7/00, опуб. 20.12.2005);

- «Краснодонский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (см. патент РФ №2266327 по кл. МПК C12N 7/00, опуб. 20.12.2005);

- «Ильиногорский» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (см. патент РФ №2266328 по кл. МПК C12N 7/00, опуб. 20.12.2005).

Штаммы получены последовательными пассажами на культурах клеток почки свиньи (СП) и почки эмбриона свиньи (СПЭВ), обладают высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, депонированы в Коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ») под следующими наименованиями соответственно:

- «Ленинградский - ВНИИЗЖ-ДЕП»;

- «Краснодонский - ВНИИЗЖ-ДЕП»;

- «Ильиногорский - ВНИИЗЖ-ДЕП».

Однако эти штамм пригодны для изготовления инактивированных вакцинных препаратов.

Известны также штаммы для изготовления живых вакцин производства ФГУ «ВГНКИ»:

- "№5 ВГНКИ" вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (см. а.с. СССР №734279 по кл. МПК С12К 7/00, опуб. 15.05.80);

- МК-25′′ вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (см. патент РФ №1238294 по кл. МПК А61К 39/225, опуб. 20.10.95).

Однако применение вакцин на основе данных штаммов не позволяет в дальнейшем определить, какой из штаммов, вакцинный или вирулентный, циркулирует среди поголовья после проведения специфической профилактики.

Наиболее близким к заявляемому является штамм для изготовления живых вакцин против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, свободный от указанных недостатков и позволяющий отличить вакцинный вирус ТГЭС от вирулентных штаммов по антигенной структуре и по индуцированной данным вакцинным штаммом сероконверсии (см. патент РФ №2140982 по кл. МПК C12N 7/00, опуб. 10.11.1999). Данный штамм обозначен как штамм «Горский-95» и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ) за инв. №1941.

Штамм получен путем аттенуирования вируса ТГЭС пассированием на культуре клеток тестикул поросенка (ПТП) с параллельным клонированием и отбором клонов, имеющих антигенные отличия от исходной популяции вирулентного вируса. Данный штамм отличается от вирулентных штаммов вируса ТГЭС отсутствием на поверхностном гликопропеине (S) нейтрализующей антигенной детерминанты, которая всегда присутствует на соответствующем гликопротеине вирулентных штаммов вируса ТГЭС. Данная детерминанта распознается моноклональными антителами клона Т9С9.2, что позволяет отличать данный вакцинный вирус ТГЭС от вирулентных штаммов вируса ТГЭС по антигенной структуре и по индуцированной сероконверсии методами твердофазного иммуноферментного анализа и гистохимического иммуноферментного анализа. Штамм характеризуется высокой репродуцирующей способностью в культуре клеток ПТП с проявлением характерного цитопатического эффекта и накоплением вируса в титре до 10⁵ ТЦД 50/см³, безвредностью, ареактогенностью, высокой иммуногенной активностью, отсутствием контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм антигенно стабилен, неконтагиозен, нереверсибелен.

Однако активность данного штамма невысока, он способен накапливаться только до 10⁵ ТЦД 50/см³, обладает не очень высокой стабильностью (до 50 пассажа), не пригоден для профилактики трансмиссивного гастроэнтерита у поросят всех возрастных групп, включая отъемышей и высокочувствительных «домолозивных» новорожденных поросят.

Изобретение направлено на решение задачи создания более стабильного по генетическим и иммунобиологическим признакам авирулентного штамма вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, пригодного для профилактики данного заболевания у свиней разных половозрастных групп, в том числе отъемышей и высокочувствительных «домолозивных» новорожденных поросят, и позволяющего быстрее и дешевле проводить диагностические исследования за счет более высокой способности к накоплению вируса в перевиваемой культуре клеток СПЭВ.

Штамм «ВН-96» выделен в 1988 году из вакцины «Римс» (ГДР) путем 30-кратного пассирования в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи и методом предельных разведений с последующим 5-кратным клонированием микробляшек исходного вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, всего проведено 96 пассажей.

Штамм депонирован во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ») 27 мая 2009 года (справка о депонировании прилагается) - производственный штамм «ВН-96»-ДЕП вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Место хранения производственного штамма «ВН-96»-ДЕП вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней - Коллекция микроорганизмов Государственного научного учреждения. Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Саратовская НИВС Россельхозакадемии) (Россия, 410028, г.Саратов, ул. 53 Стрелковой дивизии, д.6). Местом дублированного хранения определена Всероссийская государственная коллекция штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГУ «ВГНКИ»).

Штамм «ВН-96»-ДЕП характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки

При электронно-микроскопическом исследовании вируссодержащего материала установлено, что вирус штамма «ВН-96» является оболочечным, плеоморфным, диаметром 80-150 нм, имеет один слой булавовидных отростков (пепломеров) в виде короны длиной 12-20 нм, т.е. штамм морфологически тождественен представителям рода Coronavirus семейства Coronaviridae.

Культуральные признаки

Штамм «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней размножается в перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи - СПЭВ (ГНУ ВНИИВВиМ). Допустимое количество пассажей - 10.

Инфекционная активность штамма в культуре СПЭВ составляет 5,25±0,25 lg ТЦД _50/см ³ - После 7-го пассажа титр вируса ТГЭС штамма «ВН-96» составляет 7,00±0,3 lg ТЦД _50/см ³, дальнейшее пассирование к повышению титра вируса не приводит.

Антигенные свойства

Штамм «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител к вирусу ТГЭС в организме свиней и кроликов в титрах 4-6 log₂.

Вирулентные свойства. Не вирулентен.

Патогенность для естественно-восприимчивых и лабораторных животных. Штамм «ВН-96» апатогенен для поросят всех возрастных групп при пероральном и подкожном методах введения в дозах 5,0-6,5 lg ТЦД _50/см ³.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Не контаминирован.

Молекулярно-генетическая особенность штамма

Штамм «ВН-96» является РНК-содержащим вирусом. Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса ТГЭС, включающий 800 и.о. на 5′-конце S-гена.

Вирус содержит 3 главных структурных белка: крупный поверхностный гликопротеин (S) с молекулярной массой 170-200 кДа, нуклеокапсидный белок (N) с молекулярной массой 50-62 кДа и мелкий оболочечный гликопротеин (М) с молекулярной массой 25-35 кДа.

ПЦР-анализ показал, что в треках вирусной нуклеиновой кислоты выявлена единственная характерная фракция специфического продукта ПЦР (кДНК величной 886 пн), свидетельствующая о наличии генома вируса ТГЭС в достаточно большом количестве.

Условия хранения

Штамм «ВН-96» хранят в лиофилизированном виде в герметически закрытых ампулах при температуре минус 20-40°С в течение 5 лет. В течение срока хранения допускается снижение активности не более, чем на 1,5 lg ТЦД _50/см ³.

Стабильность основных свойств штамма

Штамм «ВН-96» стабилен в течение 10 серийных пассажей в культуре клеток СПЭВ.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует критерию патентоспособности «изобретательский уровень».

Примеры испытаний штамма «ВН-96» по биологической активности и стабильности, антигенной активности, идентичности и авирулентности на «домолозивных» поросятах представлены ниже.

Пример 1

Биологическая активность штамма

Проводили титрование вируса штамма «ВН-96» на культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) согласно «Методике выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в реакции нейтрализации на панелях», утвержденной директором ФГУ ВНИИЗЖ» 15.06.2004 г.

Исходный вирус и вирус 3-го, 5-го и 7-го пассажей титровали в планшетах в 3-кратной повторности. Результаты титрования штамма «ВН-96» вируса ТГЭС представлены в таблице 1.

Таблица 1 Титры штамма ВН-96 вируса ТГЭС в культуре клеток СПЭВ № пассажа Титр вируса ТГЭС штамма «ВН-96» (lg ТЦД_50/см ³) Исходный вирус 5,25±0,25 3 5,75±0,31 5 7,00±0,51 7 7,00±0,30

Из таблицы 1 видно, что к 5-му пассажу вирус накапливался в максимальных титрах и составлял 7,00±0,51. Дальнейшее пассирование не приводило к повышению титра вируса ТГЭС штамма «ВН-96».

Пример 2

Антигенная активность штамма ВН-96 вируса ТГЭС определялась на подсвинках. Животным массой 25-30 кг внтримышечно в заднебедренную группу мышц вводили исходный вирус в дозе 2,0 см³. Перед введением и через 22 дня после инъекции вируса у животных отбирали пробы крови, полученные сыворотки исследовали в реакции микронейтрализации (РМН) на наличие антител к вирусу ТГЭС. Для сравнения, аналогичные исследования проводили с сыворотками крови после введения животным вируса штамма «Ленинградский». Результаты исследований сывороток крови свиней представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что все животные до опыта были серонегативны по отношению к вирусу ТГЭС. Через 22 дня после иммунизации все подсвинки стали сероположительными и титры специфических антител были на уровне 4,5-7,0 log₂ против штамма «Ленинградский» и 5,5-7,5 log₂ против штамма «ВН-96».

Клинические наблюдения за животными показали, что у всех поросят каких-либо отклонений в их состоянии не регистрировали, животные оставались клинически здоровыми, показатели температуры также не превышали нормы.

Таблица 2 Вируснейтрализующая активность сывороток крови свиней, иммунизированных штаммом «ВН-96» вируса ТГЭС Сыворотки исследованы против вируса №поросят Титр антител, log₂ до иммунизации через 22 дня после иммунизации Штамм«Ленинградский» 1 <2,0 4,50±0,25 2 <2,0 6,00±0,75 3 <2,0 6,50±0,51 4 <2,0 7,00±0,75 Среднее, M±S   <2,0 6,00±0,56 Штамм «ВН-96» 1 <2,0 5,50±0,25 2 <2,0 6,50±0,25 3 <2,0 7,00±0,75 4 <2,0 7,50±0,25 Среднее, M±S   <2,0 6,63±0,38

Пример 3

Определение идентичности штамма «ВН-96» проводили в реакции РМН.

Для этого использовали гипериммунные сыворотки крови кроликов, полученные на производственный штамм «Ленинградский» вируса ТГЭС.

В реакции нейтрализации использовали 7 пассаж штамма «ВН-96» вируса ТГЭС в последовательных десятикратных разведениях и гипериммунную сыворотку крови кроликов с постоянной дозой.

В качестве контроля использовали нормальную сыворотку крови кроликов. Реакцию проводили в трех повторностях. Индекс нейтрализации (ИН) рассчитывали по формуле:

ИН=T_AS+SN/T_AS+SS, где:

T_AS+SN - титр вируса в присутствии нормальной сыворотки,

T_AS+SS - титр вируса в присутствии специфической сыворотки.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Результаты вычисления индекса нейтрализации Разведение вируса ТГЭС, шт.ВН-96 Результаты исследования со специфической сывороткой крови Результаты исследования с нормальной сывороткой крови 1 2 3 1 2 3 10^-1 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 10^-2 0/4 1/4 2/4 4/4 4/4 4/4 10^-3 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 10^-4 0/4 0/4 0/4 4/4 3/4 3/4 10^-5 0/4 0/4 0/4 3/4 3/4 3/4 10^-6 0/4 0/4 0/4 2/4 2/4 3/4 10^-7 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 Титр вируса 1,5±0,38 1,75±0,25 2,0±0,51 6,0±0,25 5,75±0,25 6,0±0,51 Примечание: знаменатель - количество зараженных лунок, числитель - количество лунок, в которых наблюдали цитопатическое действие вируса.

Из данных таблицы 3 видно, что цитопатический эффект вируса со специфической сывороткой крови наблюдался в разведениях вируса от 10^-1 до 10^-2, средний титр вируса составлял 1,75±0,25 lg ТЦД_50/см ³. В лунках, куда вносили вирус с нормальной сывороткой, средний титр вируса составлял 5,91±0,13 lg ТЦД_50/см ³.

Индекс нейтрализации в среднем составлял 3,42±0,511 g ТЦД_50/см ³.

Таким образом, штамм «ВН-96» вируса ТГЭС обладает высокой специфичностью.

Пример 4

Изучение авирулентности штамма «ВН-96» вируса ТГЭС проводили на 10 «домолозивных» поросятах, родившихся от клинически здоровой и серонегативной к вирусу ТГЭС свиноматки первого опороса. Поросят разделили на 2 группы по 5 голов и содержали изолированно в специальных деревянных ящиках при температуре 32-35°С.

Предварительно 10 ампул лиофилизированного штамма «ВН-96» вируса ТГЭС растворили физраствором, объединили в общую пробу развели 1:2 и ввели перорально в объеме 5 см³/гол. и интраназально по 3 капли из пипетки 5 подопытным поросятам. Другая группа осталась незараженной (контрольной). За животными обеих групп вели наблюдение в течение 72 часов.

В течение всего срока наблюдений поросята опытной и контрольной групп оставались живы, у них отсутствовали признаки ТГЭС (диарея, рвота, мышечная дрожь, конвульсии и пр.). Через 72 часа поросята были умерщвлены и проведено их патологоанатомическое вскрытие. Характерных для ТГЭС патологоанатомических изменений не выявлено. От животных были отобраны пробы тонкого отдела кишечника и исследованы с помощью ПЦР на наличие генома вируса ТГЭС. Результаты исследования патматериала от зараженных животных дали положительный результат на наличие генома вируса ТГЭС при отрицательном результате у контрольных (незараженных).

Таким образом, штамм «ВН-96» вируса ТГЭС является авирулентным для наиболее высокочувствительной модели - «домолозивных» поросят, стабилен по генетическим и иммунобиологическим признакам, позволяет быстрее и дешевле проводить диагностические исследования за счет более высокой способности к накоплению вируса в перевиваемой культуре клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штаммам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Направлено на решение задачи создания более стабильного по генетическим и иммунобиологическим признакам авирулентного штамма вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Позволяет быстрее и дешевле проводить диагностические исследования за счет более высокой способности к накоплению вируса в перевиваемой культуре клеток СПЭВ. Может быть использовано в ветеринарии и животноводстве, при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности. 3 табл.

Штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней рода Coronavirus семейства Coronaviridae для производства диагностических и вакцинных препаратов, депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под номером «ВН-96»-ДЕП.