СОЕДИНЕНИЯ ДИ(АРИЛАМИНО)АРИЛА Российский патент 2012 года по МПК C07D401/12 C07D401/14 C07D403/12 C07D403/14 C07D405/12 C07D405/14 C07D413/12 C07D413/14 C07D417/12 C07D471/10 C07D487/08 C07D491/113 C07D498/10 A61K31/517 A61K31/53 A61K31/5377 A61K31/541 A61K31/551 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям ди(ариламино)арила, которые можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях, особенно в фармацевтических композициях для лечения онкологических заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак легких вызывается беспорядочным ростом трахеальных, бронхиальных и/или альвеолярных клеток в результате утраты их нормальных функций. Количество людей, которые умирают от рака легких, составляет самую большую часть от полного количества смертей от рака (17%), и во всем мире около 1,3 миллиона людей умирают от рака легких ежегодно.

Лечение рака легких подразделяют на три основных категории: хирургические операции (хирургическая терапия), лечение противораковыми агентами (химиотерапия) и радиоактивное облучение (радиационная терапия), но эффективность лечения будет меняться в зависимости от типа тканей рака легких. Например, несмотря на то, что точный диагноз рака легких осуществляется патофизиологом на основании его цитогистопатологического диагноза микроскопического образца, мелкоклеточный рак легких, который составляет около 20% от всех случаев рака легких, к моменту обнаружения уже развивается до поздней стадии, так как он обычно характеризуется высокой степенью злокачественности, и быстро разрастается и распространяется, и очень часто дает метастазы в другие органы. По этой причине химиотерапию и/или радиационную терапию часто используют для лечения указанного типа рака, но прогноз бывает неудовлетворительным, так как мелкоклеточный рак легких часто дает рецидивы, несмотря на то, что он относительно восприимчив к указанным типам терапии. С другой стороны, в случае немелкоклеточного рака легких, который составляет остальные около 80%, хирургическую терапию рассматривают как возможную до определенной стадии, но существует мало возможностей применять хирургические операции на следующих стадиях, на которых для лечения используют, главным образом, химиотерапию и/или радиационную терапию.

Таким образом, при любом из типов рака легких химиотерапия является преимущественным выбором терапии.

EGFR представляет собой рецептор тирозинкиназы и, будучи активированным в результате связывания с лигандом, вызывает фосфорилирование тирозиновых остатков во внутриклеточных участках рецепторов и после этого индуцирует последующую активацию цитоплазмических белков, тем самым облегчая дифференцирование и рост клеток (Clinical Cancer Research, 12(18), 2006, p. 5268-5272). Обнаружено, что EGFR сверхэкспрессируется в различных злокачественных опухолях (Journal Cellular Physiology, 194(1), 2003, p. 13-19), и показано, что сверхэкспрессия EGFR является фактором, ответственным за неудовлетворительные прогнозы раковых заболеваний (Annals of Oncology, 15(1), 2004, p. 28-32, Journal of Clinical Oncology, 21(20), 2003, p. 3798-3807). В последние годы наблюдалось, что ингибиторы EGFR оказывают высокий клинический эффект в отношении ограниченной популяции пациентов с немелкоклеточным раком легких, и имеются сообщения о том, что происходит активная мутация EGFR у пациентов такого сегмента (N. Engl. J. Med. 350, 2004, p. 2129-2139, Science 304, 2004, p. 1497-1500, Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2004, p. 13306-13311). В результате конформационного изменения АТФ-связывающего сайта EGFR, такой мутантный EGFR конститутивно активируется даже в отсутствие лигандной стимуляции и, тем самым, вызывает перерождение клеток в раковые. Известно также, что в раковых клетках, содержащих такие мутантные EGFR, они вызывают апоптоз под действием гефитиниба или эрлотиниба, известных как ингибиторы EGFR, приводя к уменьшению размера опухоли (Nat. Rev. Cancer 7, 2007, p. 169-181).

ALK (киназа анапластической лимфомы) представляет собой рецептор тирозинкиназы и является белком, содержащим трансмембранный участок в средней части, ограниченный участком тирозинкиназы с карбоксил-концевой стороны и внеклеточным участком с амино-концевой стороны. Ранее сообщалось, что ALK полной длины экспрессируется в нескольких типах раковых клеток эктодермального происхождения (например, в нейробластоме, глиобластоме, в клетках рака груди, в меланоме) (непатентный документ 1). Сообщалось также, что в некоторых случаях злокачественной лимфомы человека ген ALK слит с другим геном (например, геном NPM, геном CLTCL, геном TFG) в результате хромосомальной транслокации, и поэтому продуцирует онкогенную гибридную тирозинкиназу (Science, vol. 263, p. 1281, 1994; Blood, vol. 86, p. 1954, 1995; Blood, vol. 95, p. 3204, 2000; Blood, vol. 94, p. 3265, 1999). Известно также, что в случае воспалительной миофибробластической опухоли ген ALK слит с другим геном (например, геном CARS, геном SEC31L1) в результате хромосомальной транслокации, и поэтому продуцирует гибридную тирозинкиназу (Laboratory Investigation, a journal of technical methods and pathology, vol. 83, p. 1255, 2003; International Journal of Cancer, vol. 118, p. 1181, 2006). Большинство молекул-партнеров (включая EML4 (белки, ассоциированные с микротрубочками иглокожих, подобные белку-4)), которые гибридизуются с ALK, содержат комплексообразующий домен, и образующиеся гибридные продукты непосредственно также, по-видимому, образуют комплексы. Указанное комплексообразование будет индуцировать неконтролируемую активность тирозинкиназы ALK и аномальную активацию внутриклеточных сигналов, вызывая, тем самым, развитие ракового заболевания (Cellular and Molecular Life Science, vol. 61, p. 2939, 2004; Nature Reviews Cancer, vol. 8, p. 11, 2008).

Более того, последние сообщения указывают на присутствие гибридного белка TPM4-ALK при эзофагеальном раке, причем результаты получены с помощью методик протеомного анализа (World Journal of Gastroenterology, vol. 12, p. 7104, 2006; Journal Molecular Medicine, vol. 85, p. 863, 2007). Далее, уже после даты приоритета рассматриваемой заявки, было подтверждено присутствие гибридного гена EML4 и ALK в образцах, полученных у пациентов с раком легких, и сообщалось также, что указанный гибридный ген EML4-ALK является канцерогенным и является причинным геном рака, и что ингибиторы его киназной активности подавляют рост различных клеток, в которых экспрессируется гибридный белок EML4-ALK (патентный документ 1 и непатентный документ 2). В указанных документах показано также, что ингибиторы гибридного белка EML4-ALK можно использовать в качестве терапевтических агентов при раке легких у пациентов с EML4-ALK полинуклеотид-позитивным раком легких.

Упомянутые выше гефитиниб и эрлотиниб, которые являются ингибиторами EGFR и которые, как известно, можно использовать в качестве терапевтических агентов при немелкоклеточном раке легких, имеют следующую химическую структуру.

Более того, патентный документ 1, опубликованный после даты приоритета рассматриваемой заявки, раскрывает следующие соединения (причем каждое из них известно как ингибитор ALK), как примеры соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении гибридного белка EML4-ALK, и также раскрывает реальные значения их ингибирующей активности в отношении гибридного белка EML4-ALK (патентный документ 1). Следует заметить, что сокращения, принятые для следующих соединений, те же, что использованы в патентном документе 1.

Соответствующие им химические названия таковы: 4-[(3'-бром-4'-гидроксифенил)амино]-6,7-диметоксихиназолин (именуемый также WHI-P154) для соединения A; N-[2-(3-хлорфенил)этил]-2-[({[4-(трифторметокси)фенокси]ацетил}амино)метил]-1,3-тиазол-4-карбоксамид для соединения B; 5-хлор-N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}пиримидин-2,4-диамин для соединения C; и 2-[(5-бром-2-{[2-метокси-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]амино}пиримидин-4-ил)амино]-N-метилбензолсульфонамид для соединения D.

Кроме того, сообщалось, что клетки лимфомы, экспрессирующие гибридный белок ALK, соединение, обладающее ингибирующей ALK активностью, WHI-P154, ингибирует рост клеток и индуцирует апоптоз (непатентный документ 3). Следует заметить, что WHI-P154 является тем же самым, что и представленное выше соединение A.

Аналогично, TAE684, представленное следующей формулой, известно в качестве ингибитора гибридного белка из гибридного гена гена NPM и гена ALK. Следует заметить, что указанное соединение является тем же самым, что и представленное выше соединение C.

TAE684 структурно отличается от соединений настоящего изобретения тем, что центральное кольцо, заключенное между двумя группами -NH, представляет собой хлорзамещенное пиримидиновое кольцо.

Кроме того, сообщалось, что TAE684 ингибирует распространение анапластической крупноклеточной лимфомы (ALCL) в результате своей ингибирующей активности в отношении NPM-ALK гибридного белка (непатентный документ 4). С другой стороны, несмотря на то, что в этом документе указано, что соединения, включая TAE684, обладают ингибирующей активностью в отношении киназы фокальной адгезии (FAK), и поэтому их можно использовать для профилактики и/или лечения немелкоклеточного рака легких и мелкоклеточного рака легких, в нем отсутствует информация относительно реальных терапевтических эффектов при раке легких (патентный документ 2).

Уже после даты приоритета рассматриваемой заявки появились сообщения о том, что EML4-ALK экспрессируется в клетках немелкоклеточного рака легких (NCI-H2228), что TFG-ALK экспрессируется у пациентов с немелкоклеточным раком легких и что TAE684 ингибирует рост клеток немелкоклеточного рака легких (NCI-H2228) (патентный документ 1 и непатентные документы 5 и 6).

Дополнительные данные, содержащиеся в непатентном документе 6, свидетельствуют о том, что TAE684 обладает незначительной ингибирующей активностью (степень ингибирования: 7,5%) в отношении клеток HCC-827 (клетки, экспрессирующие мутантный белок EGFR) в указанных в документе условиях.

Кроме того, после даты приоритета рассматриваемой заявки в более позднем сообщении содержится указание на то, что TAE684 демонстрирует ингибирующую активность в отношении роста EGFR (мутация L858R)/клеток BaF (непатентный документ 7).

Патентный документ 1: European Patent Publication № EP 1914240.

Патентный документ 2: International Publication № WO 2004/080980.

Непатентный документ 1: International Journal of Cancer, vol. 100, p. 49, 2002.

Непатентный документ 2: Nature, vol. 448, no. 2, p. 561, 2007.

Непатентный документ 3: Laboratory Investigation, vol. 85, p. 1544, 2005.

Непатентный документ 4: Proceedings of the National Academy of Science, vol. 104, no. 1, p. 270, 2007.

Непатентный документ 5: Cell, vol. 131, p. 1190, 2007.

Непатентный документ 6: Proceedings of the National Academy of Science, vol. 104, no. 50, p. 19936, 2007.

Непатентный документ 7: American Association for Cancer Research Annual Meeting 2008 Proceedings, vol. 49, April 2008, p. 560, #2373.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, КОТОРЫЕ ДОЛЖНО РЕШИТЬ РАССМАТРИВАЕМОЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В настоящем изобретении предложено соединение, которое можно использовать в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях, особенно в фармацевтических композициях для лечения онкологических заболеваний, и которое можно более безопасно использовать в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

В результате обширных и интенсивных исследований соединений, которые можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для лечения онкологических заболеваний, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение настоящего изобретения, ди(ариламино)арил, обладает превосходной ингибирующей активностью в отношении киназной активности гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR, и это соединение можно использовать в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения онкологических заболеваний. Указанное открытие легло в основу настоящего изобретения.

Итак, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) или к его соли, а также к фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его соль и эксципиент.

(где символы имеют указанные далее значения:

-X- представляет собой

(1) группу формулы (II) или

(2) группу формулы (III)

-R⁵ представляет собой

(1) -H,

(2) -OH,

(3) галоген,

(4) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(6) -S-низший алкил,

(7) циано,

(8) амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами, или

(9) циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами (при условии, что триазиновое кольцо, к которому присоединен -R⁵, присоединено к атому азота в циклическом амино),

-R^6a, -R^6b, -R^6c и -R^6d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой

(1) -H,

(2) галоген,

(3) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(4) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) -S-низший алкил или

(6) циано,

-W представляет собой

(1) -H,

(2) галоген,

(3) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(4) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) -S-низший алкил,

(6) циано или

(7) группу, представленную -A-B,

-A- представляет собой

(1) -S(=O)₂- или

(2) -C(=O)-,

-B представляет собой

(1) низший алкил,

(2) амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZA,

(3) циклический амино (при условии, что -A- присоединен к атому азота в циклическом амино) или

(4) циклоалкил,

R^ZA представляет собой

(1) низший алкил или

(2) циклоалкил,

-R^1a, -R^1b, -R^1c и -R^1d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой

(1) -H,

(2) галоген,

(3) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(4) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) -S-низший алкил или

(6) циано,

или альтернативно:

если -W представляет собой -H, один из -R^1a или -R^1b представляет собой группу, представленную -A-B, а другой из -R^1a или -R^1b, и -R^1c и -R^1d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой любой из (1)-(6), представленных выше,

-R² представляет собой

(1) -H,

(2) -OH,

(3) галоген,

(4) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(6) -S-низший алкил или

(7) циано,

-R³ и -R⁴ имеют следующие значения:

(1) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из R^ZB, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZB (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в циклическом амино),

(2) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой группу, представленную формулой (IV) (при условии, что -L¹ и -L², взятые вместе с соседним с ними атомом углерода, представляют собой неароматическое гетероциклическое кольцо, где, если указанное неароматическое гетероциклическое кольцо содержит атом азота, указанный атом азота может быть замещен R^ZC)

(3) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой группу, представленную -Y-Z, или

(4) -R³ и -R⁴, взятые вместе с соседним с ними атомом углерода, представляют собой неароматическое гетероциклическое кольцо (при условии, что, если неароматическое гетероциклическое кольцо содержит атом азота, указанный атом азота может быть замещен -CO₂-(низшим алкилом, который может быть замещен одним или более галогенами)),

R^ZB представляет собой

(1) низший алкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из оксо, -OH, -O-низшего алкил, -S-низшего алкила, галогена и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

R^ZC представляет собой

(1) низший алкил или

(2) -CO₂-(низший алкил, который может быть замещен фенилом),

-Y- представляет собой

(1) пиперидин-1,4-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении пиперидина, и -Z присоединен к атому углерода в 4-положении пиперидина),

(2) пиперазин-1,4-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо,

(3) пирролидин-1,3-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении пирролидина, и -Z присоединен к атому углерода в 3-положении пирролидина),

(4) азетидин-1,3-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении азетидина, и -Z присоединен к атому углерода в 3-положении азетидина),

(5) -O- или

(6) -N(-R^ZD)-,

-R^ZD представляет собой

(1) -H или

(2) низший алкил,

-Z представляет собой

(1) циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -R^ZE, оксо, -OH, -O-низшего алкила, фенила, который может быть замещен галогеном, пиперидин-1-ила, пиримидин-2-ила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

(2) арил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -O-низшего алкила и циано,

(3) циклоалкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -O-низшего алкила, циано и оксо,

(4) ароматическое гетероциклическое кольцо, которое может быть замещено одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -OH, -O-низшего алкила и циано, или

(5) группу формулы (V)

, и

-R^ZE представляет собой

(1) низший алкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из оксо, -OH, фенила, который может быть замещен галогеном, и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами).

Если не указано иначе, когда символы, используемые в одной химической формуле, используют также в другой химической формуле, одни и те же символы имеют одинаковые значения.

Настоящее изобретение относится также к ингибитору активности киназы мутантных белков EGFR, который включает соединение формулы (I) или его соль. В некоторых вариантах настоящее изобретение относится к ингибитору активности киназы гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR.

Кроме того, настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, которая включает соединение формулы (I) или его соль, то есть терапевтический агент для лечения онкологических заболеваний, который включает соединение формулы (I) или его соль.

Кроме того, настоящее изобретение относится также к применению соединения формулы (I) или его соли для получения фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, к применению соединения формулы (I) или его соли для лечения онкологических заболеваний, а также к способу лечения онкологического заболевания, который включает введение пациенту эффективного количества соединения формулы (I) или его соли.

ПРЕИМУЩЕСТВА НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соединение формулы (I) или его соль обладает ингибирующей активностью в отношении активности киназы гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR, а также ингибирующей рост активностью в отношении клеточных линий человеческого немелкоклеточного рака легких NCI-H2228 и HCC827, и его можно использовать в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения онкологических заболеваний, таких как рак легких в одном варианте, немелкоклеточный рак легких или мелкоклеточный рак легких в другом варианте, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный рак в еще одном варианте, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный рак легких в еще одном варианте или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный немелкоклеточный рак легких в еще одном варианте.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1 демонстрирует результаты скринирования в отношении гибридного полинуклеотида EML4-ALK в образцах, полученных у пациентов с раком легких. Полоса “46, XX” демонстрирует результат применения периферических моноцитов нормальной здоровой женщины, и от “ID #2” до “ID #42” демонстрирует результат применения образцов, полученных из образцов, иссеченных у пациентов с раком легких. Кроме того, полоса “NTC” демонстрирует результат, полученный без добавленного субстрата кДНК. Полоса “маркер” является полосой, где электрофоретированы маркеры размера ДНК (верхняя часть). Результаты амплификации GAPDH кДНК представлены в нижней части. Пол (M, мужской; F, женский), патология (S, плоскоклеточный рак; A, аденокарцинома; AS, аденосквамозная карцинома; B, бронхиоло-альвеолярная карцинома) и наличие или отсутствие мутации EGFR и наличие или отсутствие в истории факта курения представлены в верхней части фигуры.

Фиг.2 демонстрирует онкогенность генов. Верхняя часть фигуры (3T3) демонстрирует клетки 3T3 фибробластов, когда вводят бланковый вектор (Vector), и экспрессионную плазмиду, такую как полной длины ALK/pMXS (ALK), EML4-ALKv1/pMXS (EML4-ALK) или EML4-ALK (K589M)/pMXS. Масштабная шкала составляет 100 мкм. Нижняя часть фигуры (голые мыши) демонстрирует результаты, полученные при инокуляции каждой из клеточных линий 3Т3 голым мышам.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложено следующее.

1. Соединение формулы (I) или его соль

(где символы имеют указанные далее значения:

-X- представляет собой

(1) группу формулы (II) или

(2) группу формулы (III)

-R⁵ представляет собой

(1) -H,

(2) -OH,

(3) галоген,

(4) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(6) -S-низший алкил,

(7) циано,

(8) амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами, или

(9) циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами (при условии, что триазиновое кольцо, к которому присоединен -R⁵, присоединено к атому азота в циклическом амино),

-R^6a, -R^6b, -R^6c и -R^6d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой

(1) -H,

(2) галоген,

(3) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(4) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) -S-низший алкил или

(6) циано,

-W представляет собой

(1) -H,

(2) галоген,

(3) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(4) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) -S-низший алкил,

(6) циано или

(7) группу, представленную -A-B,

-A- представляет собой

(1) -S(=O)₂- или

(2) -C(=O)-,

-B представляет собой

(1) низший алкил,

(2) амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZA,

(3) циклический амино (при условии, что -A- присоединен к атому азота в циклическом амино) или

(4) циклоалкил,

R^ZA представляет собой

(1) низший алкил или

(2) циклоалкил,

-R^1a, -R^1b, -R^1c и -R^1d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой

(1) -H,

(2) галоген,

(3) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(4) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) -S-низший алкил или

(6) циано,

или альтернативно:

если -W представляет собой -H, один из -R^1a или -R^1b представляет собой группу, представленную -A-B, и другой из -R^1a или -R^1b, и -R^1c и -R^1d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой любой из (1)-(6), представленных выше,

-R² представляет собой

(1) -H,

(2) -OH,

(3) галоген,

(4) низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(5) O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами,

(6) -S-низший алкил или

(7) циано,

-R³ и -R⁴ имеют следующие значения:

(1) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из R^ZB, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZB (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в циклическом амино),

(2) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой группу, представленную формулой (IV) (при условии, что -L¹ и -L², взятые вместе с соседним с ними атомом углерода, представляют собой неароматическое гетероциклическое кольцо, где, если неароматическое гетероциклическое кольцо содержит атом азота, указанный атом азота может быть замещен R^ZC)

(3) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой группу, представленную -Y-Z, или

(4) -R³ и -R⁴, взятые вместе с соседним с ними атомом углерода, представляют собой неароматическое гетероциклическое кольцо (при условии, что, если неароматическое гетероциклическое кольцо содержит атом азота, указанный атом азота может быть замещен -CO₂-(низшим алкилом, который может быть замещен одним или более галогенами)),

R^ZB представляет собой

(1) низший алкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из оксо, -OH, -O-низшего алкила, -S-низшего алкила, галогена и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

R^ZC представляет собой

(1) низший алкил или

(2) -CO₂-(низший алкил, который может быть замещен фенилом),

-Y- представляет собой

(1) пиперидин-1,4-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴⁼, присоединено к атому азота в 1-положении пиперидина, и -Z присоединен к атому углерода в 4-положении пиперидина),

(2) пиперазин-1,4-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо,

(3) пирролидин-1,3-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении пирролидина, и -Z присоединен к атому углерода в 3-положении пирролидина),

(4) азетидин-1,3-диил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении азетидина, и -Z присоединен к атому углерода в 3-положении азетидина),

(5) -O- или

(6) -N(-R^ZD)-,

-R^ZD представляет собой

(1) -H или

(2) низший алкил,

-Z представляет собой

(1) циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -R^ZE, оксо, -OH, -O-низшего алкила, фенила, который может быть замещен галогеном, пиперидин-1-ила, пиримидин-2-ила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

(2) арил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -O-низшего алкила и циано,

(3) циклоалкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -O-низшего алкила, циано и оксо,

(4) ароматическое гетероциклическое кольцо, которое может быть замещено одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -OH, -O-низшего алкила и циано, или

(5) группу формулы (V)

, и

-R^ZE представляет собой

(1) низший алкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из оксо, -OH, фенила, который может быть замещен галогеном, и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами).

2. Соединение по п.1 или его соль, где

-R⁵ представляет собой

(1) -H,

(2) -OH,

(3) галоген,

(4) низший алкил,

(5) амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами, или

(6) циклический амино (при условии, что триазиновое кольцо, к которому присоединен -R⁵, присоединено к атому азота в циклическом амино),

-R^6a, -R^6b, -R^6c и -R^6d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой

(1) -H или

(2) галоген,

-W представляет собой

(1) -H,

(2) галоген или

(3) группу, представленную -A-B,

-R^1a, -R^1b, -R^1c и -R^1d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой

(1) -H,

(2) галоген или

(3) -O-низший алкил,

или альтернативно:

если -W представляет собой -H, один из -R^1a или -R^1b представляет собой группу, представленную -A-B, и другой из -R^1a или -R^1b, и -R^1c и -R^1d, которые могут быть одинаковы или различны, каждый представляет собой любой из (1)-(3), представленных выше,

-R² представляет собой

(1) -H,

(2) -OH,

(3) галоген,

(4) низший алкил или

(5) -O-низший алкил,

-R³ и -R⁴ имеют следующие значения:

(1) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из R^ZB, оксо, -OH, и амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZB (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в циклическом амино),

(2) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой группу, представленную формулой (IV) (при условии, что -L¹ и -L², взятые вместе с соседним с ними атомом углерода, представляют собой неароматическое гетероциклическое кольцо, где, если неароматическое гетероциклическое кольцо содержит атом азота, указанный атом азота может быть замещен R^ZC),

(3) один из них представляет собой -H, и другой представляет собой группу, представленную -Y-Z, или

(4) -R³ и -R⁴, взятые вместе с соседним с ними атомом углерода, представляют собой неароматическое гетероциклическое кольцо (при условии, что, если неароматическое гетероциклическое кольцо содержит атом азота, указанный атом азота может быть замещен -CO₂-(низшим алкилом, который может быть замещен одним или более галогенами)),

-Y- представляет собой

(1) пиперидин-1,4-диил (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении пиперидина, и -Z присоединен к атому углерода в 4-положении пиперидина),

(2) пиперазин-1,4-диил,

(3) пирролидин-1,3-диил (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении пирролидина, и -Z присоединен к атому углерода в 3-положении пирролидина),

(4) азетидин-1,3-диил (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединены -R³ или -R⁴, присоединено к атому азота в 1-положении азетидина, и -Z присоединен к атому углерода в 3-положении азетидина),

(5) -O- или

(6) -N(-R^ZD)-,

-Z представляет собой

(1) циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -R^ZE, оксо, -OH, фенила, который может быть замещен галогеном, пиперидин-1-ила, пиримидин-2-ила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

(2) арил,

(3) циклоалкил,

(4) ароматическое гетероциклическое кольцо или

(5) группу формулы (V), и

-R^ZE представляет собой

(1) низший алкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из оксо, -OH, фенила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами).

3. Соединение формулы (VI) или его соль

(где символы имеют следующие значения:

-X¹- представляет собой группу формулы (VII) или (VIII)

-R¹⁵ представляет собой -H, галоген, низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, -S-низший алкил, циано, амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами, или циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

-R^16a, -R^16b, -R^16c и -R^16d, которые могут быть одинаковы или различны, представляют собой -H, галоген, низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, -S-низший алкил или циано,

-W¹ представляет собой галоген, низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, -S-низший алкил, циано или группу, представленную -A¹-B¹,

-A¹- представляет собой -S(=O)₂- или -C(=O)-,

-B¹ представляет собой низший алкил или амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами,

-R^11a, -R^11b, -R^11c и -R^11d, которые могут быть одинаковы или различны, представляют собой -H, галоген, низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, -S-низший алкил или циано,

-R¹² представляет собой галоген, низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, O-низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами, -S-низший алкил или циано,

-R¹³ и -R¹⁴: один из них представляет собой -H, и другой представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами, или группу, представленную -Y¹-Z¹,

-Y¹- представляет собой пиперидин-1,4-диил или пиперазин-1,4-диил, каждый из которых может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и оксо, или -O- или -N(-R^Y)-, при условии, что, если -R¹³ или -R¹⁴ представляют собой -Y¹-Z¹ и -Y¹- представляет собой пиперидин-1,4-диил, бензольное кольцо, к которому присоединены -R¹³ или -R¹⁴, присоединено к атому азота в 1-положении пиперидина, и -Z¹ присоединен к атому углерода в 4-положении пиперидина, и где -R^Y представляет собой -H или низший алкил, и

-Z¹ представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, оксо, -OH, -O-низшего алкила и амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами; арил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -O-низшего алкила и циано; циклоалкил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -O-низшего алкила, циано и оксо; или ароматическое гетероциклическое кольцо, которое может быть замещено одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из галогена, низшего алкила, который может быть замещен одним или более галогенами, -OH, -O-низшего алкила и циано).

4. Соединение по п.1 или его соль, где -R^1a, -R^1b, -R^1c и -R^1d, каждый представляет собой -H, -R² представляет собой -O-метил, и -R⁴ представляет собой -H.

5. Соединение по п.4 или его соль, где -R³ представляет собой 4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил.

6. Соединение по п.5 или его соль, где -X- представляет собой группу, представленную формулой (II), и -R⁵ представляет собой -H.

7. Соединение по п.6 или его соль, где -W представляет собой группу, представленную -A-B, -A- представляет собой -S(=O)₂-, и -B представляет собой изопропил.

8. Соединение по п.6 или его соль, где -W представляет собой группу, представленную -A-B, -A- представляет собой -S(=O)₂-, -B представляет собой амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZA, и R^ZA представляет собой метил, этил, изопропил или циклопропил.

9. Соединение по п.1 или его соль, где указанное соединение представляет собой:

N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид,

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамид,

N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид,

N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамид,

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамид,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамин,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-(2-метокси-4-пиперазин-1-илфенил)-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-1,8-диазаспиро[4.5]декан-8-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-1,9-диазаспиро[5.5]ундекан-9-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N-циклопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[метил(1-метилпиперидин-4-ил)амино]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

1-(1-{4-[(4-{[2-(изопропилсульфонил)фенил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)амино]-3-метоксифенил}пиперидин-4-ил)пирролидин-3-ол,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин или

N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамин.

10. Соединение по п.9 или его соль, где указанное соединение представляет собой:

N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид,

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамид,

N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид,

N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамид,

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамид,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин,

N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамин или

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин.

11. Соединение по п.10 или его соль, где указанное соединение представляет собой:

N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид,

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамид или

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин.

12. Соединение по п.11 или его соль, где указанное соединение представляет собой:

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин.

13. Фармацевтическая композиция, которая включает соединение по п.1 или его соль и фармацевтически приемлемый эксципиент.

14. Ингибитор киназной активности гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR, который включает соединение по п.1 или его соль.

15. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения онкологических заболеваний, рака легких, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака легких или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких, которая включает соединение по п.1 или его соль.

16. Применение соединения по п.1 или его соли для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения онкологических заболеваний, рака легких, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака легких или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких.

17. Соединение по п.1 или его соль, которые используют в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции для профилактики или лечения онкологических заболеваний, рака легких, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака легких или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких.

18. Способ профилактики или лечения онкологических заболеваний, рака легких, немелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака легких или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких, который включает введение пациенту эффективного количества соединения по п.1 или его соли.

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно.

В том смысле, как здесь использован, термин “галоген” означает F, Cl, Br или I.

Термин “низший алкил” относится к неразветвленному или разветвленному алкилу, содержащему 1-6 атомов углерода (здесь и далее сокращенно как “C_1-6”). Примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п. Другим вариантом является C_1-4 алкил, и еще одним вариантом являются метил, этил или изопропил.

Термин “циклический амино” относится к одновалентной группе, состоящей из 3-8-членного моноциклического неароматического циклического амина, который содержит, по меньшей мере, один атом азота и может далее содержать такой же или отличающийся один или более из гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы, где, по меньшей мере, один его атом имеет свободную валентность. Конкретные примеры включают азиридинил, азетидинил, пирролидинил, пиперидинил, азепанил, азоканил, пиперазинил, гомопиперазинил, морфолинил, оксазепанил, тиоморфолинил, тиазепанил и т.п. Альтернативно, другой вариант представляет собой одновалентная группа, состоящая из 5- или 6-членного моноциклического неароматического циклического амина. Следует заметить, что такое кольцо может быть мостиковой циклической аминогруппой, представленной, например, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептаном и т.п., или может содержать ненасыщенную связь в части кольца, примерами чего служат дигидропирролил, тетрагидропиридил, тетрагидропиразил или т.п.

Термин “неароматическое гетероциклическое кольцо” относится к 5-10-членному моноциклическому неароматическому гетероциклическому кольцу, которое содержит 1-4 гетероатома, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Примеры включают азиридин, азетидин, пирролидин, пиперидин, азепан, азокан, пиперазин, гомопиперазин, морфолин, оксазепан, тиоморфолин, тиазепан, тетрагидропиран, тетрагидрофуран, диоксан, диоксолан и т.п. Другой вариант представляет собой 5- или 6-членный моноциклический неароматический циклический амин, включая пирролидин, пиперидин, пиперазин, морфолин, тиоморфолин и т.п. Следует заметить, что такое кольцо может содержать ненасыщенную связь в части кольца, примерами чего служат дигидропиррол, тетрагидропиридин, тетрагидропиразин или т.п.

Термин “арил” относится к C_6-14 моноциклической-трициклической ароматической углеводородной группе, включая фенил, нафтил и т.п. Другим вариантом является фенил.

Термин “циклоалкил” относится к необязательно мостиковой C_3-10 насыщенной циклической углеводородной группе, включая циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, адамантил и т.п. Другие примеры включают такие частично ненасыщенные соединения, как циклогексенил, циклооктадиенил и т.п. Дальнейшие примеры включают такие соединения, в которых одна или две метиленовые группы в кольце заменены -O-, примерами чего служат тетрагидропиранил, тетрагидрофуранил, диоксанил и т.п. Дальнейшие примеры включают такие кольца, каждое из которых конденсировано с бензольным кольцом, примерами чего служат инданил, тетрагидронафтил, инденил, дигидронафтил, дигидрохроменил и т.п.

Термин “ароматическое гетероциклическое кольцо” относится к одновалентной группе, содержащей 5-10-членное моноциклическое или бициклическое ароматическое гетероциклическое кольцо, которое содержит 1-4 гетероатома, выбранные из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Примеры включают пиридил, пирролил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, имидазолил, тиазолил, оксазолил, тиенил, фурил, индолил, бензимидазолил, хинолил, изохинолил, хиназолинил, хиноксалинил, фталазинил, бензoтиазолил, бензоксазолил и т.п. Другими вариантами являются пиридил, пиразинил, пиримидинил, хинолил, изохинолил, хиназолинил, хиноксалинил или фталазинил, и еще одним вариантом является пиридил.

Фраза “который может быть замещен” предполагает, что включены как “замещенный”, так и “незамещенный” варианты. Если существует замещение несколькими группами, указанные группы могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

Фраза “низший алкил, который может быть замещен одним или более галогенами” относится, например, к низшему алкилу, который может быть замещен одинаковыми или отличающимися 1-7 галогенами. Другим вариантом является низший алкил, который может быть замещен 1-5 галогенами. Еще одним вариантом является низший алкил, который может быть замещен 1-3 галогенами.

Во фразе “амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZA”, если указанный амино замещен двумя R^ZA, эти два заместителя R^ZA могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

Некоторые варианты настоящего изобретения представлены далее.

(1) Соединения формулы (I), где -R^1a, -R^1b, -R^1c и -R^1d, каждый представляет собой -H.

(2) Соединения формулы (I), где

(2-1) -R² представляет собой -O-низший алкил, или

(2-2) -R² представляет собой -O-метил.

(3) Соединения формулы (I), где

(3-1) -R³ представляет собой циклический амино, который может быть замещен низшим алкилом (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединен -R³, присоединено к атому азота в циклическом амино),

(3-2) -R³ представляет собой пиперазинил, который может быть замещен низшим алкилом (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединен -R³, присоединено к атому азота в пиперазине),

(3-3) -R³ представляет собой пиперазинил, который может быть замещен метилом (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединен -R³, присоединено к атому азота в пиперазине),

(3-4) -R³ представляет собой 4-метилпиперазин-1-ил,

(3-5) -R³ представляет собой группу, представленную формулой (IV), в которой -L¹ и -L², взятые вместе, представляют собой циклический амино, который может быть замещен низшим алкилом,

(3-6) -R³ представляет собой группу, представленную формулой (IV), в которой -L¹ и -L², взятые вместе, представляют собой пирролидин или пиперидин, который может быть замещен низшим алкилом,

(3-7) -R³ представляет собой группу, представленную формулой (IV), в которой -L¹ и -L², взятые вместе, представляют собой пирролидин или пиперидин, который может быть замещен метилом,

(3-8) -R³ представляет собой группу, представленную -Y-Z, в которой -Y- представляет собой пиперидин-1,4-диил, пиперазин-1,4-диил, азетидин-1,3-диил или -N(-низший алкил)-, и -Z представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и -OH,

(3-9) -R³ представляет собой группу, представленную -Y-Z, в которой -Y- представляет собой пиперидин-1,4-диил, пиперазин-1,4-диил, азетидин-1,3-диил или -N(-метил)-, и -Z представляет собой пиперазинил, пиперидинил или пирролидинил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из метила и -OH, или

(3-10) -R³ представляет собой 4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил.

(4) Соединения формулы (I), где -R⁴ представляет собой -H.

(5) Соединения формулы (I), где

(5-1) -X- представляет собой группу, представленную формулой (II), и -R⁵ представляет собой -H, или

(5-2) -X- представляет собой группу, представленную формулой (III), и -R^6a, -R^6b, -R^6c и -R^6d, каждый представляет собой -H.

(6) Соединения формулы (I), где

(6-1) -W представляет собой группу, представленную -A-B, в которой -A- представляет собой -S(=O)₂-, и -B представляет собой низший алкил,

(6-2) -W представляет собой группу, представленную -A-B, в которой -A- представляет собой -S(=O)₂-, и -B представляет собой изопропил, или

(6-3) -W представляет собой группу, представленную -A-B, в которой -A- представляет собой -S(=O)₂-, и -B представляет собой амино, который может быть замещен одним или двумя R^ZA, и R^ZA представляет собой метил, этил, изопропил или циклопропил.

(7) Соединения, к которым применимы любые комбинации двух или более из (1)-(6), представленных выше.

(8) Соединения формулы (VI), где -R^11a, -R^11b, -R^11c и -R^11d, каждый представляет собой -H.

(9) Соединения формулы (VI), где

(9-1) -R¹² представляет собой -O-низший алкил, или

(9-2) -R¹² представляет собой -O-метил.

(10) Соединения формулы (VI), где

(10-1) -R¹³ представляет собой циклический амино, который может быть замещен низшим алкилом (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединен -R¹³, присоединено к атому азота в циклическом амино),

(10-2) -R¹³ представляет собой пиперазинил, который может быть замещен низшим алкилом (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединен -R¹³, присоединено к атому азота в пиперазине),

(10-3) -R¹³ представляет собой пиперазинил, который может быть замещен метилом (при условии, что бензольное кольцо, к которому присоединен -R¹³, присоединено к атому азота в пиперазине),

(10-4) -R¹³ представляет собой 4-метилпиперазин-1-ил,

(10-5) -R¹³ представляет собой группу, представленную -Y¹-Z¹, в которой -Y¹- представляет собой пиперидин-1,4-диил, пиперазин-1,4-диил или -N(-низший алкил)-, и -Z¹ представляет собой циклический амино, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из низшего алкила и -OH,

(10-6) -R¹³ представляет собой группу, представленную -Y¹-Z¹, в которой -Y¹- представляет собой пиперидин-1,4-диил, пиперазин-1,4-диил или -N(-метил)-, и -Z¹ представляет собой пиперазинил, пиперидинил или пирролидинил, который может быть замещен одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из метила и -OH, или

(10-7) -R¹³ представляет собой 4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил.

(11) Соединения формулы (VI), где -R¹⁴ представляет собой -H.

(12) Соединения формулы (VI), где

(12-1) -X¹- представляет собой группу, представленную формулой (VII), и -R¹⁵ представляет собой -H, или

(12-2) -X¹- представляет собой группу, представленную формулой (VIII), и -R^16a, -R^16b, -R^16c и -R^16d, каждый представляет собой -H.

(13) Соединения формулы (VI), где

(13-1) -W¹ представляет собой группу, представленную -A¹-B¹, в которой -A¹- представляет собой -S(=O)₂-, и -B¹ представляет собой низший алкил,

(13-2) -W¹ представляет собой группу, представленную -A¹-B¹, в которой -A¹- представляет собой -S(=O)₂-, и -B¹ представляет собой изопропил, или

(13-3) -W¹ представляет собой группу, представленную -A¹-B¹, в которой -A¹- представляет собой -S(=O)₂-, и -B¹ представляет собой амино, который может быть замещен одним или двумя низшими алкилами.

(14) Соединения, в которых применимы любые комбинации из двух или более из (8)-(13), представленных выше.

Примеры конкретных соединений, попадающих в объем настоящего изобретения, включают те соединения, которые выбраны из соединений групп P, Q, R и S, представленных далее.

Соединения группы P:

группа, состоящая из N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина и соли указанного соединения.

Соединения группы Q:

группа, состоящая из N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида и

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамида, а также солей указанных соединений.

Соединения группы R:

группа, состоящая из N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,

N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамида,

2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамида,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина и

N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамина, а также солей указанных соединений.

Соединения группы S:

группа, состоящая из N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-(2-метокси-4-пиперазин-1-илфенил)-1,3,5-триазин-2,4-диамина,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-1,8-диазаспиро[4.5]декан-8-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-1,9-диазаспиро[5.5]ундекан-9-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина,

N-циклопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[метил(1-метилпиперидин-4-ил)амино]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина,

1-(1-{4-[(4-{[2-(изопропилсульфонил)фенил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)амино]-3-метоксифенил}пиперидин-4-ил)пирролидин-3-ола,

N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина и

N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамина, а также солей указанных соединений.

Соединения формулы (I) могут иметь таутомеры и/или геометрические изомеры, в зависимости от типа их заместителей. Даже если соединения формулы (I) демонстрируют здесь только одну изомерную форму, настоящее изобретение включает остальные изомеры, и также включает отдельные изомеры или их смеси.

Кроме того, так как некоторые соединения формулы (I) содержат асимметричный атом углерода или обладают аксиальной асимметрией, могут также существовать оптические изомеры на основе указанной асимметрии. Настоящее изобретение также включает отдельные оптические изомеры соединений формулы (I) или их смеси.

Кроме того, настоящее изобретение включает фармацевтически приемлемые пролекарственные формы соединений, представленных формулой (I). Термин “фармацевтически приемлемая пролекарственная форма” относится к соединению, содержащему группу, которую можно превратить в аминогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу или тому подобные группы путем сольволиза или в физиологических условиях. Примеры образующих пролекарственные формы групп включают группы, раскрытые в Prog. Med., 5, 2157-2161 (1985) или раскрытые в “Development of Pharmaceuticals” (Hirokawa Publishing, 1990) vol. 7, Molecular Design 163-198.

Аналогично, соли соединений формулы (I) представляют собой фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I). Соединения формулы (I) могут образовывать соли присоединения кислот или оснований, в зависимости от типа их заместителей. Конкретные примеры включают соли присоединения неорганических кислот (например, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.) или органических кислот (например, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, винная кислота, дибензоилвинная кислота, дитолуоилвинная кислота, лимонная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, аспарагиновая кислота, глутамовая кислота и т.п.), соли присоединения неорганических оснований (например, таких как натрий, калий, магний, кальций, алюминий и т.п.) или органических оснований (например, таких как метиламин, этиламин, этаноламин, лизин, орнитин и т.п.), соли присоединения различных аминокислот и производных аминокислот (например, таких как ацетиллейцин и т.п.), а также соли аммония и т.д.

Более того, настоящее изобретение также включает соединения формулы (I) и их соли в форме различных гидратов, сольватов и кристаллических полиморфных веществ. Настоящее изобретение также включает соединения, меченные различными радиоактивными или нерадиоактивными изотопами.

Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли можно получить, используя различные известные способы синтеза на основании характеристик, полученных из структур их скелетов или типов их заместителей. В некоторых случаях, в зависимости от типа функциональной группы, технически эффективно заменять такую функциональную группу соответствующей защитной группой (группой, которую можно легко превратить в исходную функциональную группу) на стадии исходного материала или на промежуточной стадии. Примеры таких защитных групп включают группы, раскрытые в Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis (third edition, 1999)” и т.п., которые можно выбрать и использовать соответствующим образом в зависимости от условий реакции. При использовании такого метода, после введения защитной группы и последующего осуществления реакции защитную группу можно при необходимости удалить для получения целевого соединения.

Аналогично, пролекарственную форму соединения формулы (I) можно получить путем введения специфической группы на стадии исходного материала или на промежуточной стадии, как и в случае вышеуказанной защитной группы, или подвергая полученное соединение формулы (I) следующей реакции. Указанную реакцию можно осуществить с помощью обычной этерификации, амидирования, дегидратации или другими известными специалистам способами.

Далее будут раскрыты типичные способы получения соединения формулы (I). Каждый из способов можно осуществить со ссылкой на документы, цитированные в указанном объяснении. Следует заметить, что указанные способы настоящего изобретения не ограничены приводимыми далее иллюстративными примерами.

Способ получения 1

(где -L представляет собой уходящую группу (то же самое относится и к последующим обозначениям L)).

Указанный способ предназначен для получения соединения (I) настоящего изобретения путем осуществления взаимодействия соединения (1a), содержащего уходящую группу, с производным анилина (1b). Примеры уходящих групп, которые можно использовать для этой цели, включают галогены (например, F, Cl и т.п.), сульфонилокси (например, метансульфонилокси, п-толуолсульфонилокси, трифторметансульфонилокси и т.п.), а также низший алкилсульфанил или низший алкансульфонил.

В указанной реакции соединение (1a), содержащее уходящую группу, и производное анилина (1b) используют в равных количествах, или одно из них используют в избыточном количестве. Смесь указанных соединений перемешивают в растворителе, инертном в указанной реакции, или в отсутствие растворителя при охлаждении или при повышенной температуре до температуры кипения с обратным холодильником, предпочтительно при 0-80°C, обычно в течение от 0,1 часа до 5 дней. Примеры растворителей, используемых для указанной цели, включают, но ими не ограничиваются, ароматические углеводороды (например, бензол, толуол, ксилол и т.п.), простые эфиры (например, диэтиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и т.п.), галогенированные углеводороды (например, дихлорметан, 1,2-дихлорпентан, хлороформ и т.п.), спирты (например, метанол, этанол, 2-пропанол и т.п.), N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, этилацетат, ацетонитрил и их смеси. Указанную реакцию можно вести в присутствии органического основания (например, триэтиламина, N,N-диизопропилэтиламина, N-метилморфолина или т.п.) или в присутствии неорганического основания (например, карбоната калия, карбоната натрия, гидроксида калия или т.п.), так как в некоторых случаях это выгодно для спокойного протекания реакции.

Если реакцию осуществляют в присутствии таких оснований, как указано выше, в зависимости от свойств или т.п. исходных соединений, необходимая реакция может оказаться невозможной или может протекать с трудом, например, из-за разложения или т.п. исходных соединений. В таком случае реакцию можно вести в присутствии минеральной кислоты (например, хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты и т.п.), органической кислоты (например, уксусной кислоты, пропионовой кислоты и т.п.) или сульфоновой кислоты (например, метансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты и т.п.), так как в некоторых случаях это может оказаться благоприятным для спокойного протекания реакции.

Документы

S. R. Sandler and W. Karo, “Organic Functional Group Preparations,” second edition, vol. 1, Academic Press Inc., 1991.

The Chemical Society of Japan, “Fifth Series of Experimental Chemistry,” vol. 14 (2005) (MARUZEN Co., Ltd., Japan).

Способ получения 2

Указанный способ предназначен для получения соединения (I) настоящего изобретения путем осуществления взаимодействия соединения (2a), содержащего уходящую группу, с производным анилина (2b).

В указанной реакции можно использовать процедуру способа получения 1.

Синтез исходных материалов

(где L₁ и L₂, каждый представляет собой уходящую группу, выбранную из членов представленного выше списка L (то же самое справедливо для значений L₁ и L₂, встречающихся здесь и далее)).

Указанный способ предназначен для получения соединения (1a) путем осуществления взаимодействия соединения (3), содержащего уходящую группу, с производным анилина (2b).

В указанной реакции можно применить процедуру способа получения 1.

Указанный способ предназначен для получения соединения (2a) путем осуществления взаимодействия соединения (3), содержащего уходящие группы, с производным анилина (1b).

В указанной реакции можно использовать процедуру способа получения 1.

Соединение формулы (I) выделяют и очищают в виде свободного соединения или в виде его фармацевтически приемлемой соли, гидрата, сольвата или кристаллического полиморфного вещества.

Фармацевтически приемлемую соль соединения формулы (I) можно также получить, осуществляя обычную реакцию образования соли.

Выделение и очистку можно осуществить, используя обычные химические методики, такие как экстрагирование, фракционная кристаллизация, различные типы фракционной хроматографии и т.д.

Различные изомеры можно получить, выбирая соответствующие исходные соединения, или можно выделить, используя различия в физических и химических свойствах изомеров. Например, оптические изомеры можно получить в виде оптически чистых изомеров, используя обычные методики оптического разрешения (например, фракционную кристаллизацию, получая диастереоизомерную соль, используя оптически активное основание или кислоту, хроматографию на хиральной колонке или т.п.). Их можно также получить из соответствующих оптически активных исходных соединений.

Фармакологическую активность соединения формулы (I) подтверждают в следующих испытаниях. Если не указано иначе, представленные далее примеры испытаний можно осуществить обычными способами, и, используя коммерчески доступные реагенты, наборы или т.п., можно осуществить в соответствии с инструкциями, сопровождающими указанные коммерчески доступные продукты.

Пример испытания 1: Оценка ингибирующей активности в отношении активности киназы гибридного белка EML4-ALK v1

Гибридный белок EML4-ALK v1 (выделенный из клеток BA/F3, экспрессирующих гибридный белок EML4-ALK v1) исследуют на предмет его активности фосфорилирования пепетидного субстрата, используя набор для определения активности киназы (HTRF KinEASE-TK; Cisbio Inc.). Каждое из тестируемых соединений добавляют к реакционному раствору, содержащему ферментный белок, получая 8 конечных концентраций от 1000 нМ до 0,3 нМ (от 100 нМ до 0,03 нМ для TAE684), с последующим добавлением АТФ и осуществлением взаимодействия в течение 1 часа. Используемая концентрация АТФ составляет 100 мкМ. Приготавливают другой реакционный раствор, который содержит указанный ферментный белок, но не содержит тестируемого соединения (в который добавляют только растворитель ДМСО при 0,4% вместо тестируемого соединения), с последующим осуществлением взаимодействия таким же образом, с добавлением или без добавления АТФ. В отсутствие тестируемого соединения уровень фосфорилирования без добавления АТФ и с добавлением АТФ принимают за 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно. Концентрацию, вызывающую 50% ингибирования (ИК₅₀), рассчитывают для каждого тестируемого соединения, используя метод логарифмической регрессии.

В результате было обнаружено, что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают ингибирующей активностью в отношении активности киназы гибридного белка EML4-ALK v1. В таблице 1 представлены значения ИК₅₀, полученные для некоторых соединений настоящего изобретения и TAE684. "Пример" означает "пример №".

Таблица 1 Пример ИК₅₀ (нМ) Пример ИК₅₀ (нМ) 1 42 128 2,3 23 17 12 61 24 29 149 40 45 66 166 49 52 72 7 50 58 25 171 33 63 26 176 150 72 51 TAE684 0,63 120 74     123 33    

Пример испытания 2: Оценка ингибирующей активности в отношении киназной активность мутантного белка EGFR (L858R)

Мутантный белок EGFR (L858R) (Carna Biosciences Inc., Japan) исследуют на предмет его активности фосфорилирования пептидного субстрата, используя набор для определения активности киназы (HTRF KinEASE-TK; Cisbio Inc.). Каждое из тестируемых соединений добавляют к реакционному раствору, содержащему ферментный белок, до получения 8 конечных концентраций от 10000 нМ до 3 нМ, с последующим добавлением АТФ и осуществлением взаимодействия в течение 1 часа. Используемая концентрация АТФ составляет 5 мкМ. Приготавливают другой реакционный раствор, содержащий ферментный белок, но без тестируемого соединения (в который добавляют только один растворитель ДМСО в концентрации 0,4% вместо тестируемого соединения), с последующим осуществлением взаимодействия тем же способом, с добавлением или без добавления АТФ. В отсутствие тестируемого соединения уровень фосфорилирования без добавления АТФ и с добавлением АТФ оценивают как 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно. Концентрацию, вызывающую 50% ингибирования (ИК₅₀), рассчитывают для каждого тестируемого соединения, используя метод логарифмической регрессии.

В результате было обнаружено, что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают ингибирующей активностью в отношении активности киназы мутантного белка EGFR (L858R). Результаты, приведенные в таблице 2, демонстрируют значения ИК₅₀, полученные для некоторых соединений настоящего изобретения и TAE684. "Пример" означает "пример №".

Таблица 2 Пример ИК₅₀ (нМ) 23 120 123 100 128 98 TAE684 92

Пример испытания 3: Оценка ингибирующего действия в отношении субстрат-независимого роста клеток клеточной линии человеческого немелкоклеточного рака легких NCI-H2228 (клетки, экспрессирующие гибридный белок EML4-ALK)

Известно, что измерение субстрат-независимого роста клеток (метод колоний и т.д.) является системой для исследования противоракового эффекта (фармакологическое действие) тестируемого соединения (Clinical Oncology, second edition, Cancer and Chemotherapy Publishers Inc.). Вместо метода колоний представлен следующий способ с использованием сфероидных планшетов для измерения роста свободных клеток.

В 96-луночный сфероидный планшет (Sumilon Celltight Spheroid 96U; Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan) высевают клетки клеточной линии NCI-H2228 человеческого немелкоклеточного рака легких в количестве 2000 клеток на лунку в среде RPMI1640 (Invitrogen), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Клетки NCI-H2228 являются клетками, которые экспрессируют другой гибридный белок EML4-ALK, который отличается от гибридного белка EML4-ALK v1 тем, что его кодирует гибридный полинуклеотид EML4-ALK, чей сайт слияния на EML4 кДНК отличается от сайта гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1, но участок ALK которого такой же, что и у гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1. Вышеуказанные клетки NCI-H2228, высеянные в планшет, культивируют в течение ночи в атмосфере 5% CO₂ при 37°C, с последующим добавлением тестируемого соединения (конечная концентрация: от 10 мкМ до 1 нМ). В качестве негативного контроля добавляют ДМСО, используемый в качестве растворителя, в той же самой концентрации, что и концентрация тестируемого соединения. Затем клетки культивируют в атмосфере 5% CO₂ при 37°C в течение 5 дней. Клетки, содержащие реагент (CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay; Promega), добавляют и перемешивают в течение 20 минут, с последующим измерением с помощью люминометра (ML3000 микротитровальный планшетный люминометр; Dynatech Laboratories). Предполагая, что величины, измеренные для одной среды, и величины, измеренные для негативного контроля, составляют 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно, степень ингибирования рассчитывают для каждого соединения, определяя концентрацию, вызывающую 50% ингибирования (величина ИК₅₀), с помощью метода логарифмической регрессии.

В результате было обнаружено, что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают ингибирующей рост активностью в отношении клеток клеточной линии NCI-H2228 человеческого немелкоклеточного рака легких. В таблице 3 представлены значения ИК₅₀, полученные для некоторых соединений настоящего изобретения и TAE684. "Пример" означает "пример №".

Таблица 3 Пример ИК₅₀ (нМ) Пример ИК₅₀ (нМ) 1 473 128 64 23 71 12 134 24 125 149 62 45 1039 166 125 52 159 7 87 58 156 171 61 63 96 176 119 72 93 TAE684 8,5 120 168     123 30    

Пример испытания 4: Оценка ингибирующего действия в отношении субстрат-независимого роста клеток клеточной лини HCC827 человеческого немелкоклеточного рака легких (клетки, экспрессирующие мутантный белок EGFR (с частичной делецией экзона 19 в EGFR), American Type Culture Collection)

Оценку осуществляют тем же способом, который представлен в примере испытания 3.

В результате было обнаружено, что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают ингибирующей рост активностью в отношении клеток клеточной линии HCC827 человеческого немелкоклеточного рака легких. В таблице 4 представлены значения ИК₅₀, полученные для некоторых соединений настоящего изобретения и TAE684. "Пример" означает "пример №".

Таблица 4 Пример ИК₅₀ (нМ) Пример ИК₅₀ (нМ) 1 2513 128 175 23 272 12 509 24 1027 149 512 45 1899 166 419 52 820 7 214 58 648 171 252 63 791 176 496 72 670 TAE684 301 120 660     123 238    

Результаты представленных выше примеров 1-4 подтверждают, что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают ингибирующей активностью в отношении киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1 и активностью ингибирования роста в отношении клеток клеточной линии NCI-H2228 человеческого немелкоклеточного рака легких, и что TAE684 обладают более высокой активностью, чем активность соединений настоящего изобретения. Было также подтверждено, что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают ингибирующей активностью в отношении киназной активности мутантного белка EGFR (L858R) и активностью ингибирования роста в отношении клеток клеточной линии HCC827 человеческого немелкоклеточного рака легких, и что соединения настоящего изобретения и TAE684 обладают почти одинаковой активностью.

Пример испытания 5: Испытание на токсичность на крысах

Каждое из тестируемых соединений суспендируют в 0,5% водном растворе метилцеллюлозы и повторно вводят SD крысам (по две самки и четыре самца в каждой группе) перорально в каждой из доз в течение 7 дней. TAE684 вводят в дозах 3, 10, 30 и 100 мг/кг, тогда как соединение примера 23 вводят в дозах 10, 30, 100 и 300 мг/кг.

Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5   Доза Соединение примера 23 TAE684 Самцы
(4 крысы) Самки
(2 крысы) Самцы
(4 крысы) Самки
(2 крысы) Нетоксичная доза 10 10 3 3 Ингибирование костного мозга 100 100 10 10 Обострение общих симптомов (>300) (>300) 100 30 Условия гибели (>300) (>300) (>100) 100

В дозах, которые были использованы в этом испытании, TAE684 вызывает следующие четкие токсические симптомы: обострение общих симптомов (например, снижение автономной подвижности, закрывание век, шелушение кожи, блефарофимоз) у самок в группе 30 мг/кг; указанные проявления, а также пронация, брадипноз и гиперсаливация у самок и самцов в группе 100 мг/кг; и заметное обострение состояния после введения на 7 день у двух самок (все случаи) в группе 100 мг/кг (по этой причине указанные два случая были исследованы путем вскрытия после агонии). Напротив, несмотря на то, что было обнаружено, что соединение примера 23 вызывает уменьшение количества испражнений у 2 из 4 самцов в группе 300 мг/кг, ни в одной из дозовых групп не было случаев, которые демонстрировали бы обострение общих симптомов при введении в течение 7 дней. Кроме того, ни в одной из дозовых групп не наблюдалось случаев гибели.

То есть соединение примера 23 обладает эффектом, равным с TAE684 в отношении ингибирования роста клеток, экспрессирующих мутантный белок EGFR, но с другой стороны, не вызывает обострения общих симптомов или не приводит к случаям смерти, даже при введении в дозе 300 мг/кг, которая выше, чем дозы 30 мг/кг или 100 мг/кг, при которых наблюдалось обострение общих симптомов или случаи смерти. Таким образом, можно считать, что соединение примера 23 более безопасно, чем соединение TAE684.

На основании вышеприведенных результатов при проведении противораковой терапии для пациентов с EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивным раком, TAE684 вызывает опасения за безопасность (например, за обострение общих симптомов) при более низкой дозе, чем при использовании соединения примера 23 (пример испытания 5), тогда как TAE684, по-видимому, обеспечивает терапевтическое действие при более низкой дозе, чем при использовании соединения примера 23 (примеры испытаний 1 и 3). Поэтому можно сделать вывод о том, что соединения примера 23 и TAE684 почти сравнимы друг с другом в плане баланса между терпевтическим эффектом и безопасностью. С другой стороны, при противораковой терапии для пациентов с мутантный EGFR полинуклеотид-позитивным раком соединение примера 23 и TAE684, по-видимому, создают терапевтическое действие при почти одинаковых дозах (примеры испытаний 2 и 4), тогда как TAE684 вызывает опасения, связанные с безопасностью (например, обострение общих симптомов) при более низкой дозе, чем для соединения примера 23 (пример испытания 5). Поэтому можно сделать вывод о том, что соединение примера 23 превосходит TAE684 в плане баланса между терапевтическим эффектом и безопасностью.

Таким образом, даже если соединение примера 23 и TAE684, оба могут обеспечить противораковое терапевтическое действие с некоторой степенью безопасности во время противораковой терапии для EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивных раковых пациентов, так называемый допустимый предел безопасности оказывается уже для TAE684, чем для соединения примера 23 при проведении противораковой терапии для мутантный EGFR полинуклеотид-позитивных раковых пациентов и, следовательно, TAE684 может не обеспечить достаточное терапевтическое действие, когда дозу следует уменьшить из соображений безопасности. Напротив, соединение примера 23 обладает более широким допустимым пределом безопасности, чем TAE684, и, следовательно, его можно вводить в дозе, которая обеспечит удовлетворительное терапевтическое действие, а именно ожидается, что соединение примера 23 можно использовать в качестве терапевтического агента для лечения онкологических заболеваний, которое применимо для более широкого спектра онкологических пациентов, чем TAE684.

Пример испытания 6: Профилирование киназного ингибирования

Степени ингибирования в отношении 88 типов киназ (ABL, ACK, AXL, BMX, BTK, CSK, DDR2, EGFR, EphA2, EphB4, FES, FGFR1, FGFR3, FLT1, FLT4, FMS, INSR, JAK2, JAK3, KDR, MER, MUSK, PDGFRa, RET, TEC, TIE2, TYK2, TYRO3, ABL[T315I], EGFR[L858R], EGFR[T790M], AKT2, AurC, BMPR1A, BRAF, BRAF[V600E], CaMK2a, CaMK4, CDK3, CHK2, CK1a, CK1d, COT, CRIK, DAPK1, DLK, Erk5, GSK3a, GSK3b, IKKa, IKKb, IKKe, IRAK4, JNK1, JNK3, MAP2K2, MAP2k3, MAP2K4, MAP2K5, MAP2K7, MAP3K1, MAP3K2, MAP3K3, MAP3K4, MAP3K5, MAPKAPK2, MAPKAPK3, MAPKAPK5, MLK1, MLK2, MLK3, MNK1, MNK2, MSK1, NEK2, p38d, p38g, PAK6, PHKG1, PIM1, PKACa, PKCh, PKD2, ROCK1, RSK2, SRPK1, TAK1, TTK) рассчитывают для каждого тестируемого соединения при концентрации 100 нМ. Измерение активности осуществляют по способу Carna Biosciences Inc., Japan, и полученные результаты анализируют следующим образом: предполагая, что средняя величина сигнала от контрольных лунок, содержащих все компоненты реакции, соответствует 0% ингибирования и средняя величина сигнала в отсутствие фермента соответствует 100% ингибирования, степень ингибирования рассчитывают для каждого тестируемого вещества из средней величины сигнала для двух лунок с тестируемым веществом.

В результате, при концентрации 100 нМ, TAE684 демонстрирует 50% или более ингибирующую активность в отношении 29 типов киназ, тогда как соединение примера 23 демонстрирует ингибирующую активность только против 4 типов.

А именно, TAE684 обладает высокой ингибирующей активностью в отношении широкого круга киназ, тогда как соединение примера 23 при той же самой концентрации обладает профилем ингибирования, отличающимся от профиля TAE684 и, по-видимому, является высокоселективным для специфических киназ, то есть, по-видимому, вызывает гораздо меньше опасений в отношении безопасности, чем TAE684, причем эти опасения вызваны ингибированием немишеневых киназ, ответственных за побочные эффекты.

Дополнительно следует указать, что когда были реально проведены тщательные исследования профилей ингибирования различных киназ, оказалось, что киназами, в отношении которых TAE684 обладает более высокой ингибирующей активностью, чем соединение примера 23, являются MUSK, MER и PHKG1. TAE684 демонстрирует 90% или более ингибирующей активности в отношении указанных киназ при концентрации 100 нМ, тогда как соединение примера 23 демонстрирует низкую ингибирующую активность в той же самой концентрации (менее 20%).

MUSK представляет собой киназу, существенную для функций ацетилхолинового рецептора в нейромышечном соединении. Если у людей присутствует мутация в указанной киназе или если они оказываются позитивными в отношении анти-MUSK антител, известно, что у них развивается наследственное заболевание с миастеническими симптомами, такими как блефароптозия, гиперсаливация и респираторные нарушения (Hum Mol Genet. 2004 13, 3229-3240 и Nat Med. 2001 7, 365-368). Существует множество общих симптомов для обострения общих симптомов, наблюдающихся для TAE684 в примере испытания 5, и фенотипами, вызываемыми мутациями в MUSK. Таким образом, обострение общих симптомов, наблюдаемое для TAE684, вводимого в концентрации 30 мг/кг или более, может иметь некоторое отношение к ингибированию MUSK.

MER представляет собой киназу, необходимую для того, чтобы ретинальные клетки поддерживали свое существование. Известно, что если у людей имеется мутация в указанной киназе, у них развивается наследственное заболевание с пигментной дегенерацией сетчатки, ответственной за постепенное сужение зрительного поля, что может привести к слепоте (Nature Genet. 2000 26, 270-271). Таким образом, нельзя отрицать способность TAE684 создавать дефект в ретинальных клетках за счет его ингибирующей активности в отношении MER. Напротив, соединение примера 23, по-видимому, не вызывает опасений, связанных с образованием дефекта в ретинальных клетках, так как его ингибирующая активность в отношении MER ниже, чем активность TAE684.

PHKG1 представляет собой фермент, необходимый для метаболизма гликогена в мышцах, и, как известно, вносит вклад в наследственное заболевание, вызываемое мутациями в субъединицах комплекса фермента, которые, как опасаются, вызывают гликогеноз, мышечную боль во время упражнений, быструю усталость, миотонию, опухание печени, абдоминальное опухание, гликогеноз(накопление гликогена)-индуцируемую атрофию мышечных тканей и метаболическую миопатию (Am. J. Med. Genet. 2005 133A, 82-84). Таким образом, нельзя отрицать способность TAE684 вызывать дефект в мышечной ткани благодаря его ингибирующей активности в отношении PHKG1. Напротив, соединение примера 23, по-видимому, почти не вызывает опасений в плане образования дефекта в мышечных тканях, так как его ингибирующая активность в отношении PHKG1 слабее, чем активность TAE684.

С другой стороны, киназами, в отношении которых соединение примера 23 обладает более высокой ингибирующей активностью, чем активность TAE684, являются MNK1 и MNK2. TAE684 демонстрирует 4,8% и 32% ингибирующую активность в отношении указанных киназ, соответственно, при 100 нМ, тогда как соединение примера 23 демонстрирует 60% и 80% ингибирующую активность при той же самой концентрации. Однако имеется сообщение, что мыши, у которых разрушены оба гена MNK1 и MNK2, будут расти нормально (Molecular and Ctllular Biology 2004 24, 6539-6549). Вот почему трудно поверить, что серьезные заболевания вызываются ингибирующей активностью соединения примера 23 в отношении MNK1 и MNK2.

Пример испытания 7: Оценка ингибирующей активности в отношении киназной активности белка MUSK

Белок MUSK (Carna Biosciences Inc., Japan) исследуют в отношении его активности фосфорилирования пептидного субстрата, используя набор для определения киназной активности (HTRF KinEASE-TK; Cisbio Inc.). Каждое из тестируемых соединений добавляют к реакционному раствору, содержащему ферментный белок, получая 8 конечных концентраций от 10000 нМ до 3 нМ, с последующим добавлением АТФ и осуществлением взаимодействия в течение 1 часа. Используют концентрацию АТФ 10 мкМ. Приготавливают другой реакционный раствор, содержащий ферментный белок, но не содержащий тестируемого соединения (в который добавляют только растворитель ДМСО при концентрации 0,4% вместо тестируемого соединения), с последующим осуществлением взаимодействия таким же образом, с добавлением или без добавления АТФ. В отсутствие тестируемого соединения уровень фосфорилирования без добавления АТФ и с добавлением АТФ принимают за 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно. Концентрацию, вызывающую 50% ингибирование (ИК₅₀), рассчитывают для каждого тестируемого соединения, используя метод логарифмической регрессии.

В результате было обнаружено, что соединения настоящего изобретения и TAE684, обладают ингибирующей активностью в отношении киназной активности белка MUSK. В таблице 6 представлены значения ИК₅₀, полученные для некоторых соединений настоящего изобретения и TAE684. Пример означает пример №.

Таблица 6 Пример ИК₅₀ (нМ) 23 1500 123 1100 128 1800 TAE684 17

Представленные выше результаты примера испытания 7 подтверждают, что TAE684 обладает очень высокой ингибирующей активностью в отношении киназной активности белка MUSK, по сравнению с активностью соединений настоящего изобретения. Существует множество общих симптомов между обострением общих симптомов, наблюдаемых для TAE684 в примере испытания 5, и фенотипами, вызванными мутациями в MUSK. Таким образом, обострение общих симптомов, наблюдаемых для TAE684, при введении в количестве 30 мг/кг или более, может иметь некоторую связь с ингибированием MUSK.

Пример испытания 8: Противоопухолевое испытание (in vivo) на клетках NCI-H2228

3×10⁶ клеток NCI-H2228, суспендированных в PBS, инокулируют подкожно путем инъекции в спину 5-недельным самцам мышей NOD/SCID (Charles River Japan, Inc.). Через 3 недели после инокуляции начинают вводить тестируемые соединения. Испытание проводят для группы растворителя и групп тестируемых соединений, по 6 животных в каждой группе. Каждое из тестируемых соединений растворяют в растворителе, состоящем из смеси 10% 1-метил-2-пирролидинона (SIGMA-ALDRICH Inc.)/90% полиэтиленгликоля 300 (Fluka Inc.), и вводят перорально в дозе 3 мг/кг. Введения осуществляют один раз в день в течение 14 дней, и массу тела и размер опухоли измеряют через день. Объем опухоли рассчитывают, используя следующую формулу:

[Объем опухоли (мм³)]=[Главная ось опухоли (мм)]×[минорная ось опухоли (мм)]²×0,5.

Предположив, что объем опухоли в группе растворителя в день начала и в день окончания введения составляет 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно, степень ингибирования рассчитывают для каждого соединения.

В результате было обнаружено, что соединения настоящего изобретения обладают противоопухолевым эффектом в отношении NCI-H2228 клеток (опухоли). Среди них соединения примеров 23 и 123 ингибируют рост клеток NCI-H2228 (опухоли) на 116% и 108% соответственно.

Так, при пероральном введении, соединения настоящего изобретения ингибируют рост опухолей у мышей, инокулированных клетками H2228, тем самым, подтверждая тот факт, что соединения настоящего изобретения обладают активностью при пероральном введении.

В свете вышеизложенного в примерах испытаний 1-4, было подтверждено, что соединения настоящего изобретения обладают ингибирующей активностью в отношении киназной активности как гибридного белка EML4-ALK v1, так и мутантного белка EGFR (L858R), а также ингибирующей рост активностью в отношении клеточных линий человеческого немелкоклеточного рака легких NCI-H2228 и HCC827. В примере испытания 8 было также подтверждено, что соединения настоящего изобретения обладают противоопухолевым эффектом в отношении NCI-H2228 клеток (опухоли) на основании вышеуказанных результатов. Далее, в примере испытания 5 было подтверждено, что соединения настоящего изобретения более безопасны, чем TAE684, не проявляя токсичности даже при введении в дозе 300 мг/кг, что выше, чем доза, при которой обострение общих симптомов наблюдается для TAE684. Это указывает на то, что соединения настоящего изобретения можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения онкологических заболеваний, таких как рак легких в одном варианте, немелкоклеточный рак легких или мелкоклеточный рак легких в другом варианте, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный рак в еще одном варианте, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный рак легких в еще одном варианте или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный немелкоклеточный рак легких в еще одном варианте.

В непатентном документе 7 подтверждается, что среди клеточных линий рака легких, экспрессирующих гибридный белок EML4-ALK, имеют место некоторые клеточные линии рака легких, экспрессирующие конститутивно активированный белок EGFR наряду с EML4-ALK гибридным белком. Для ингибирования роста указанных клеточных линий рака легких должны ингибироваться оба белка (непатентный документ 7). Соединения настоящего изобретения обладают равной ингибирующей активностью в отношении как гибридного белка EML4-ALK v1, так и мутантного белка EGFR (L858R), и, следовательно, можно ожидать, что они обладают прекрасной ингибирующей рост активностью в отношении таких клеточных линий рака легких при определенных дозах. Так, соединения настоящего изобретения можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного и мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака. Более того, соединения настоящего изобретения можно использовать в одной дозе для лечения как для EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивного рака, так и мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака.

Напротив, несмотря на то, что TAE684 обладает ингибирующей активностью в отношении киназной активности мутантного белка EGFR (L858R) и ингибирующей рост активности в отношении клеток HCC827, причем каждая из активностей равна активности соединений настоящего изобретения, TAE684 начинает развивать серьезную токсичность при более низких дозах, нежели соединение примера 23 в примере испытания 5. Так, при сравнении с соединением примера 23, TAE684 вызывает опасения относительно безопасности при использовании в его эффективной дозе, необходимой для достижения достаточного ингибирующего рост эффекта в отношении мутантный EGFR полинуклеотид-позитивного рака.

Фармакологическая активность соединений формулы (I) была также подтверждена в следующей серии испытаний. Если не указано иначе, представленные далее примеры испытаний можно осуществить известным способом, и в случае использования коммерчески доступных реагентов и/или наборов их можно осуществить в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к коммерчески доступным продуктам.

Полной длины ALK кДНК была любезно предоставлена Dr. Steve Morris, St. Jude Children's Research Hospital. Этот исследовательский проект был утвержден этическим комитетом генетических аналитических исследований университета Jichi Medical University.

Используемое антифосфорилированный ALK антитело было продуктом Cell Signaling Technology Inc., и используемое анти-ALK антитело было продуктом NEOMARKERS Inc.

Пример испытания 9: Выделение гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1

(1) Конструирование библиотеки кДНК

Используя набор для выделения РНК (RNeasy Mini Column; Qiagen Inc.), РНК экстрагируют из образца аденокарциномы легких, иссеченного у 62-летнего мужчины, который дал на это согласие на основании полученной информации, и кДНК синтезируют, используя обратную транскриптазу (Power Script Reverse Transcripthase) и праймеры (олигонуклеотид SEQ ID NO:3 и CDS праймер IIA) (все от Clontech Inc.). После селективной амплификации полной длины кДНК в результате полимеразной цепной реакции (PCR) (17 циклов при 98°C в течение 10 секунд и при 68°C в течение 6 минут), используя праймер (5'-PCR праймер IIA; Clontech Inc.) и полимеразу (primeSTAR HSDNA polymerase, Takara Bio Inc.), адаптер BstX1 (Invitrogen Inc.) присоединяют к обоим концам кДНК. Полученную таким образом кДНК лигируют с ретровирусной плазмидой, и конструируют библиотеку ретровируснной плазмиды, вводя указанную плазмиду в E. coli DH10B (Invitrogen Inc.). В результате успешно создают плазмидную библиотеку, содержащую в целом клоны более 1500000 колоний образующих единиц.

(2) Анализ образования очагов

2 мкг плазмиды из описанной выше библиотеки и 0,5 мкг паковочной плазмиды (pGP и pE-eco, причем обе получены от Takara Bio Inc.) трансфицируют в пакующие клетки BOSC23, используя трансфекционный реагент. Через 2 дня после трансфекции культуральную надосадочную жидкость выделяют в виде раствора рекомбинантной ретровирусной библиотеки, смешивают с полибреном (Sigama Inc.) в концентрации 4 мкг/мл, и полученную смесь добавляют к мышиным клеткам 3T3 при MOI (множественности заражения) в 0,1 концентрации. Через два дня культуральную надосадочную жидкость клеток 3T3 заменяют на среду DMEM-F12 (Invitrogen Inc.), дополненную 5% телячьей фетальной сывороткой (Invitrogen Inc.) и 2 мМ L-глутамина, и клетки культивируют еще 2 недели, получая 10 или более типов трансформированных очагов. После выделения каждого из клонов клеток 3T3 культивирование клонов продолжают отдельно, и экстрагируют геномную ДНК каждого из клонов. Вирусную кДНК, интегрированную в каждый клон 3T3, амплифицируют, и выделяют, осуществляя PCR (30 циклов при 98°C в течение 10 секунд и при 68°C в течение 6 минут), используя 10 нг геномной ДНК в качестве матрицы, праймер 5'-PCR праймер IIA и ДНК полимеразу (PrimeStar HS DNA polynerase; Takara Bio Inc.), и клонируют в вектор pT7Blue-2.

Одна из полученных таким образом кДНК была длиной в 3926 пар оснований (SEQ ID NO:1) и содержала одну длинную открытую считывающую рамку (с 271-го до 3447-го нуклеотида последовательности SEQ ID NO:1), кодирующую белок, содержащий 1059 аминокислотных остатков (SEQ ID NO:2). Интересно, что около половины аминоконцов (1-496 аминокислотные остатки последовательности SEQ ID NO:2) белка, кодируемого указанной кДНК, содержащие новую полной длины последовательность, прекрасно соответствуют 1-496 аминокислотным остаткам белка, связанного с микротрубочками иглокожих, подобно белку-4 (EML4, GenBank accession № NM_019063), и, с другой стороны, около половины карбоксильных концов (497-1059 аминокислотные остатки последовательности SEQ ID NO:2) прекрасно соответствуют аминокислотной последовательности киназы анапластической лимфомы (ALK, GenBank accession № AB209477). Учитывая вышеприведенные результаты, считают, что рассматриваемые кДНК гибридизованы с кДНК между EML4 кДНК и ALK кДНК. Далее, полученная кДНК (кДНК для гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1) содержит домен тирозинкиназы ALK.

Пример испытания 10: Детектирование гибридного полинуклеотида EML4-ALK в клинических образцах

Синтезируют кДНК из 33 случаев клинических образцов (резецированные образцы немелкоклеточного рака легких) и в одном случае из периферических моноцитов нормального здорового субъекта.

Для детектирования кДНК гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1, PCR (50 циклов при 94°C в течение 15 секунд и при 60°C в течение 30 секунд, и при 72°C в течение 1 минуты) осуществляют, используя набор для количественной PCR (Quantitest SYBR Green; Qiagene Inc.), используя кДНК в качестве субстратов, полученных из клинических образцов и образца от нормального здорового субъекта, указанные выше, и олигонуклеотиды последовательностей SEQ ID NO:4 и 5 в качестве праймеров. Используя те же самые образцы, PCR амплификации кДНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (здесь и далее GAPDH) испытывают в качестве контроля. Для детектирования кДНК GAPDH, олигонуклеотиды, состоящие из нуклеотидных последовательностей, представленных последовательностями SEQ ID NO:6 и 7, используют в качестве праймеров. Соответствующие амплифицированные образцы подвергают электрофорезу с маркером размера ДНК (Маркер: 50 о.п. ladder, Invitrogen Inc.). В результате, как представлено в верхней части фиг.1, в 3 случаях определяют кДНК гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1. Кроме того, во всех проанализированных случаях амплификация кДНК GAPDH была четко подтверждена (нижняя часть фиг.1). Кроме того, были проанализированы нуклеотидные последовательности продуктов PCR, идентифицированных в указанных 3 случаях, и полученные результаты подтверждают, что все они содержат одну и ту же последовательность (247 о.п., включая точку слияния гена EML4 и гена ALK; SEQ ID NO:8). Таким образом, результаты анализов 33 случаев немелкоклеточного рака легких подтверждают, что гибридизация гена EML4 и гена ALK происходит в 9,1% случаев (3 из 33 случаев).

Было известно, что мутация гена EGFR является одной из причин, вызывающих рак легких. В 33 образцах, проанализированных как указано выше случаев, анализ наличия анормальности в нуклеотидной последовательности гена EGFR в соответствии с известным способом подтверждает частичную делецию экзона 19 в 6 случаях. Случаи наличия мутации гена EGFR и случаи, позитивные в отношении гибридного полинуклеотида EML4-ALK, относятся к различным подгруппам. То есть существующие терапевтические агенты, которые демонстрируют терапевтическое действие в отношении пациентов с раком легких, у которых наблюдается мутация гена EGFR, как ожидается, не должны быть эффективны для пациентов с раком легких, которые позитивны в отношении гибридного полинуклеотида EML4-ALK.

Кроме того, 33 проанализированных случая, как раскрыто выше, были исследованы на предмет того, наличествует ли полной длины ген ALK, и было обнаружено, что он присутствует в 8 случаях. Образцы в 7 случаях из указанных 8 случаев не содержат гибридный полинуклеотид EML4-ALK. То есть полной длины ген ALK не присутствует в 2 случаях из 3 случаев, в которых гибридный полинуклеотид EML4-ALK оказался позитивным.

Пример испытания 11: Исследование онкогенности гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1

EML4-ALK(K589M)/pMXS, в котором 589-ая аминокислота (сайт связывания АТФ), лизинового остатка, гибридного полинуклеотида EML4-ALK v1, была заменена метионином, получают с использованием EML4-ALKv1/pMXS (полученного из клона, в котором EML4-ALK гибридный полинуклеотид v1 был клонирован в прямом направлении в вектор pT7Blue-2, причем указанный клон был затем переработан рестрикционными ферментами EcoRI и SalI для выделения вставки, которую затем субклонировали в сайт EcoRI-SalI pMXS (J. Biol. Chem., vol. 275, p. 24945-24952, 2000)) в качестве субстрата и с помощью набора для введения мутаций (QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene Inc.). В указанной реакции используют олигонуклеотиды SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. ALK кДНК (Morris, SW et al, Science. 1994 Mar 4; 263 (5151):1281-4) клонируют в ретровирусный вектор pMXS стандартным способом (обозначая как ALK/pMXS и ALK/pMX-iresCD8 соответственно).

Описанный выше EML4-ALKv1/pMXS, полной длины ALK/pMXS, плазмиду, экспрессирующую EML4-ALK(K589M)/pMXS, и бланковый вектор без вставки кДНК (pMXS) трансфицируют в фибробластные клетки 3T3, используя кальций-фосфатный метод, и культивируют в течение 21 дня. Как представлено в верхней части фиг.2, множество очагов трансформации наблюдается только если был трансфицирован вирус, экспрессирующий гибридный белок EML4-ALK v1. Шкала соответствует 100 мкм. Далее, те же самые трансфицированные клетки 3T3 инокулируют подкожно голым мышам в количестве 5×10⁵ клеток/мышь, и наблюдение проводят в течение 20 дней. Выясняется также, что опухоль образуется только в том случае, когда инокулируют клетки, экспрессирующие EML4-ALK v1-клетки. Количество образовавшихся опухолей (количество сайтов инокуляции клеток 3T3 и количество образовавшихся при их инокуляции опухолей) оказалось следующим. Количество образовавшихся опухолей в результате введения клеток, экспрессирующих полной длины ALK, составило 0 из 8, тогда как количество образовавшихся опухолей в результате введения клеток, экспрессирующих гибридный белок EML4-ALK v1, составило 8 из 8. Кроме того, количество образовавшихся опухолей в результате введения клеток, экспрессирующих EML4-ALK (K589M), составило 0 из 8. Полученные результаты показывают, что, так как экспрессия полной длины белка ALK не вызывает образования опухоли, а гибридный белок EML4-ALK является онкогенным, гибридный полинуклеотид EML4-ALK v1 является геном, вызывающим рак. Кроме того, так как онкогенность EML4-ALK не наблюдалась в случае EML4-ALK (K589M), стало очевидным, что онкогенность зависит от киназной активности. Здесь и далее, клетки 3T3, модифицированные таким образом, чтобы экспрессировать гибридный белок EML4-ALK v1 в результате трансфекции экспрессионной плазмидой гибридного белка EML4-ALK v1, обозначают как клетки 3T3, экспрессирующие v1.

Пример испытания 12: Скринирование в отношении ингибиторов киназной активности гибридного белка EML4-ALK

(1) Получение гибридного белка EML4-ALK v1

Гибридный белок EML4-ALK v1 с N-концевой меткой FLAG встраивают в вектор pMX-iresCD8, способный к совместной экспрессии вставки кДНК и антигена клеточной поверхности CD8 (J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, p. 39012-39020) для создания вектора FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8, экспрессирующего и FLAG-EML4-ALKv1 и CD8. FLAG-EML4-ALKv1/pMX-iresCD8 используют для создания рекомбинантного ретровируса описанным выше способом, и инфицируют клетки мышиной лимфоидной клеточной лини BA/F3. Используя реагент магнитных шариков для выделения клеток и колонку очистки (анти-CD8 моноклональные антитела, иммобилизованные на магнитных шариках и колонку очистки MiniMACS; и то и другое продукты Miltenyi Biotec Inc.), клетки, экспрессирующие CD8 клеточной поверхности, очищают обычным способом. Клетки BA/F3, экспрессирующие указанный гибридный белок EML4-ALK v1 с N-концевой меткой FLAG, культивируют в среде RPMI1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки для получения 2,7×10⁹ клеток. После трехкратной промывки PBS полученные клетки подвергают лизису в лизисном растворе (50 мМ Tris·HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Triton X100, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 1 мМ NaVO₄, 1 мМ DTT и полный коктейль ингибиторов протеазы). Гибридный белок EML4-ALK v1, присутствующий в надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования, очищают, используя ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH Inc.), способом, указанным производителем продукта.

(2) Определение in vitro киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1

Гибридный белок EML4-ALK v1, очищенный как указано выше, исследуют в отношении его активности фосфорилирования пептидного субстрата, используя набор для определения киназной активности (HTRF KinEASE-TK; Cisbio Inc.). Используя субстрат TK 1, который включен в набор, в качестве субстрата и после добавления 100 мкМ АТФ или без добавления АТФ, полученные смеси оставляют взаимодействовать при комнатной температуре в течение 1 часа, и количество HTRF определяют в соответствии с инструкциями изготовителя. В результате становится очевидно, что количество HTRF (то есть степень фосфорилирования пептидного субстрата) возрастает примерно в 12 раз при добавлении АТФ по сравнению с вариантом без добавления АТФ. Как показано выше, in vitro киназную активность гибридного белка EML4-ALK v1 можно определять, используя анти-фосфорилированный ALK антитело и набор для определения киназной активности.

(3) Ингибирующий эффект соединений против in vitro киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1

Соединения A, B, C и D, которые известны как соединения, обладающие ингибирующим действием в отношении ALK, исследуют в отношении их ингибирующего эффекта против in vitro киназной активность гибридного белка EML4-ALK v1, используя указанный выше набор для определения киназной активности. Соответствующие соединения добавляют к реакционному раствору, содержащему гибридный белок EML4-ALK v1, до достижения конечной концентрации 10 мкМ или 10 нМ, с последующей реакцией с добавлением АТФ или без добавления АТФ. Все остальные операции осуществляют как раскрыто выше в (2). В отсутствие соединения степень фосфорилирования без добавления АТФ и с добавлением АТФ принимают за 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно. (%) ингибирования киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1 для каждого из соединений рассчитывают, используя следующую формулу:

[Ингибирование киназной активности (%) соединением]=(1-[степень фосфорилирования, если добавляют соединение и АТФ - степень фосфорилирования, если не добавляют ни соединение, ни АТФ]/[степень фосфорилирования, если не добавляют соединение, но добавляют АТФ - степень фосфорилирования, если не добавляют ни соединение, ни АТФ])×100.

Полученные результаты представлены в таблице 7.

Следует заметить, что соединения A-D в приведенной ниже таблице представлены в патентном документе 1.

Таблица 7 Тестируемое соединение Конечная концентрация Активность ингибирования (%) Соединение A 10 мкМ 99 Соединение B 10 мкМ 56 Соединение C 10 нМ 99 Соединение D 10 нМ 99

Было обнаружено, что все соединения ингибируют активность фосфорилирования очищенного гибридного белка EML4-ALK v1 на пептидном субстрате.

Приведенные выше результаты показывают, что скринирование в поисках вещества, которое ингибирует активность белка настоящего изобретения, можно осуществить, получая гибридный белок EML4-ALK и используя in vitro киназную активность в качестве показателя.

Пример испытания 13: Эффект ингибирования роста клеток ингибиторов киназной активности гибридного белка EML4-ALK в отношении клеток, экспрессирующих EML4-ALK гибридный полинуклеотид v1

3×10⁶ клеток 3T3, экспрессирующих v1, суспендированных в PBS, инокулируют подкожно с помощью инъекций в спину 5-недельным самцам BALB/c голых мышей (Charles River Japan, Inc.). Через 7 дней после инокуляции инициируют введение соединения C, ингибитора киназной активности гибридного белка EML4-ALK. Испытание проводят для группы растворителя и для группы соединения С, по 4 животных в каждой группе. Соединение C растворяют в растворителе, состоящем из 10% 1-метил-2-пирролидинон (SIGMA-ALDRICH Inc.)/90% полиэтиленгликоль 300 (Fluka Inc.), и вводят перорально в дозе 10 мг/кг. Введение осуществляют один раз в день в течение 14 дней, и через день измеряют массу тела и размер опухоли. Объем опухоли рассчитывают, используя следующую формулу:

[Объем опухоли (мм³)]=[главная ось опухоли (мм)]×[минорная ось опухоли (мм)]²×0,5.

Принимая, что объем опухоли для группы растворителя в день начала введения и в день окончания введения соответствует 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно, рассчитывают степень ингибирования соединения C. Результаты показывают, что соединение C ингибирует рост клеток 3T3, экспрессирующих v1 (опухоль), на 103%.

Противоопухолевый эффект соединения D исследуют тем же способом, но со следующими исключениями. Введение соединения начинают через 6 дней после инокуляции и осуществляют один раз в день в течение 10 дней. В результате обнаружено, что соединение D ингибирует рост клеток 3T3, экспрессирующих v1 (опухоль), на 101%.

Пример испытания 14: Ингибирующий эффект соединений в отношении in vitro киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1

По способу примера испытания 12(3) соединения исследуют в отношении их ингибирующего эффекта в отношении in vitro киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1, используя указанный выше набор для определения киназной активности. Каждое из тестируемых соединений добавляют к реакционному раствору, содержащему гибридный белок EML4-ALK v1, получая 8 конечных концентраций от 1000 нМ до 0,3 нМ, с последующим добавлением АТФ. Приготавливают другой реакционный раствор, содержащий гибридный белок EML4-ALK v1, но не содержащий тестируемого соединения (в который добавляют только растворитель ДМСО при концентрации 0,4% вместо тестируемого соединения), с последующим осуществлением взаимодействия с добавлением или без добавления АТФ. Остальные операции осуществляют по способу примера испытания 12(2). В отсутствие тестируемого соединения степень фосфорилирования без добавления АТФ и с добавлением АТФ принимают за 100% ингибирования и 0% ингибирования соответственно. Концентрацию, вызывающую 50% ингибирования (ИК₅₀), рассчитывают для каждого тестируемого соединения методом логарифмической регрессии.

В результате было обнаружено, что соединения формулы (I) ингибируют киназную активность гибридного белка EML4-ALK v1. В частности, в проведенном испытании некоторые соединения формулы (I) демонстрируют значения ИК₅₀ не более 1000 нМ или 100 нМ. Среди них соединение примера 1 демонстрирует значение ИК₅₀ в 42 нМ.

В результате вышеприведенных испытаний было подтверждено, что соединения формулы (I) обладают ингибирующим действием в отношении киназной активности гибридного белка EML4-ALK v1. Это позволяет предположить, что соединения формулы (I) можно использовать в качестве терапевтических агентов, например, в случае EML4-ALK гибридный ген-позитивного рака в одном варианте, или в случае EML4-ALK гибридный ген-позитивного рака легких в другом варианте.

Фармацевтическую композицию, которая включает одно или более из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемые соли в качестве активного ингредиента, можно получить обычным способом, используя фармацевтический эксципиент, фармацевтический носитель или другие добавки, обычно используемые специалистами.

Можно использовать любой способ введения, или пероральное введение в дозовой форме в виде таблеток, пилюль, капсул, гранул, порошков растворов или т.п., или парентеральное введение в дозовой форме в виде инъекций (например, внутрисуставных, внутривенных, внутримышечных и т.п.), суппозиториев, глазных капель, глазных мазей, растворов для чрезкожного введения, мазей, пластырей для чрезкожного введения, растворов для введения через слизистую, пластырей для введения через слизистую, растворов для ингаляции или т.п.

Твердые композиции для перорального введения включают таблетки, порошки, гранулы и т.п. В указанных твердых композициях один или более из активных ингредиентов смешивают с, по меньшей мере, одним инертным эксципиентом, например лактозой, маннитом, глюкозой, гидроксипропилцеллюлозой, микрокристаллической целлюлозой, крахмалом, поливинилпирролидоном, и/или магнийалюмосиликатом или т.п. Указанные композиции могут также содержать инертные добавки, например смазывающие агенты (например, стеарат магния и т.п.), разрыхляющие агенты (например, натрийкарбоксиметилкрахмал и т.п.), стабилизаторы и/или способствующие растворению агенты, такие как и в обычных случаях. Таблетки или пилюли могут быть с нанесенным сахарным покрытием или при необходимости с желудочной или кишечной пленками.

Жидкие композиции для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры или тому подобное, и включают обычно используемые инертные разбавители, такие как очищенная вода или этанол. Указанные жидкие композиции могут включать вдобавок к инертным разбавителям вспомогательные вещества (например, способствующие растворению агенты, смачивающие агенты, суспендирующие агенты, и т.п.), подсластители, ароматизаторы, вкусовые агенты и/или антисептики.

Препараты для инъекций для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примеры водных растворителей включают дистиллированную воду для инъекций или физиологический солевой раствор. Примеры неводных растворителей включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или растительные масла (например, оливковое масло и т.п.), а также спирты (например, этанол и т.п.) или полисорбат 80 (фармацевтическое наименование) и т.п. Указанные композиции могут дополнительно содержать придающие изотоничность агенты, антисептики, смачивающие агенты, эмульгаторы, дисперсанты, стабилизаторы или способствующие растворению агенты. Их стерилизуют, например, фильтрованием через удерживающий бактерии фильтр, путем включения дезинфицирующих веществ или путем облучения. Альтернативно, они могут быть приготовлены в виде стерильной твердой композиции и восстановлены для использования путем растворения или суспендирования в стерильной воде или стерильном растворителе для инъекций непосредственно перед употреблением.

Композиции для наружного применения включают мази, пластыри, кремы, желе, катаплазмы, спреи, лосьоны, глазные капли, глазные мази и т.п. Они включают обычно используемые основы для мазей, основы для лосьонов, водные или неводные растворы, суспензии, эмульсии или т.п. Примеры основ для мазей или лосьонов включают полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, белый петролатум, белый пчелиный воск, полиоксиэтилен гидрированное касторовое масло, моностеарат глицерина, стеариловый спирт, цетиловый спирт, лауромакрогол, сорбитансесквиолеат и т.п.

Чрезкожные композиции, такие как композиции для ингаляций, или трансназальные композиции используют в твердой, жидкой или полужидкой форме, и их можно получить обычными хорошо известными способами. Например, такие композиции можно дополнить соответствующими известными эксципиентами и регуляторами рН, антисептиками, поверхностно-активными веществами, загустителями и т.д. Для их введения можно использовать подходящие устройства для ингаляций или вдувания. Например, используя известное устройство (например, дозирующий ингалятор) или распылитель, соединение (соединения) можно вводить отдельно или в виде порошковой смеси или в виде раствора или суспензии в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Сухие порошковые ингаляторы или т.п. могут быть использованы для однократного или многократного введения, и сухие порошки или содержащие порошки капсулы можно использовать в таких устройствах. Альтернативно, они могут быть в форме аэрозольных спреев под давлением или т.п., в которых используют соответствующий пропеллент, например предпочтительный газ, такой как хлорфторалкан, гидрофторалкан, двуокись углерода или т.п.

Обычно для перорального введения дневная доза желательна около 0,001-100 мг/кг, предпочтительно 0,1-30 мг/кг и более предпочтительно 0,1-10 мг/кг массы тела, вводимая в виде одной дозы или разделенная на 2-4 отдельные дозы. Для внутривенного введения дневная доза желательна около 0,0001-10 мг/кг массы тела, вводимая в виде одной или нескольких доз в день. Аналогично, для чрезкожных композиций, дневная доза составляет около 0,001-100 мг/кг массы тела, вводимая в виде одной дозы или нескольких доз в день. Необходимую дозу можно определить соответствующим образом для каждого случая с учетом симптомов, возраста, пола и т.д.

Соединения формулы (I) можно использовать в комбинации с различными терапевтическими или профилактическими агентами, используемыми при заболеваниях, против которых будут эффективными соединения формулы (I). Обычно, если противоопухолевый агент вводят отдельно во время химиотерапии против опухоли, особенно злокачественной опухоли, указанный агент имеет ограничения в своем эффекте из-за побочных эффектов и т.п., и поэтому часто не удается добиться достаточного противоопухолевого действия. По этой причине в клинических случаях используют мультилекарственную терапию, при которой объединяют два или более лекарственных средства с различными механизмами действия. Комбинируя противоопухолевые агенты с различными механизмами действия, такая комбинированная терапия имеет целью уменьшение побочных эффектов и/или усиление необходимого противоопухолевого действия, например, 1) для снижения количества популяции нечувствительных клеток, 2) для предотвращения или задержки наступления устойчивости к лекарству, или 3) для распределения токсичности путем комбинации лекарственных средств с различными уровнями токсичности и т.п. При такой комбинированной терапии лекарственные средства можно вводить одновременно или раздельно, последовательно или с желательными временными интервалами. Композиции для одновременного введения могут быть или в виде смеси, или в отдельной форме.

Лекарственные средства, которые можно комбинировать, включают химиотерапевтические агенты (например, алкилирующий агент, антиметаболит и т.п.), иммунотерапевтические агенты, гормональные терапевтические агенты и ингибиторы фактора роста, более специфические лекарственные препараты, такие как цисплатин, карбоплатин, паклитасел, доцетаксел, гемцитабин, иринотекан, винорелбин, бевацизумаб и т.п.

ПРИМЕРЫ

Получение соединения формулы (I) далее будет описано более подробно с использованием следующих примеров. Следует заметить, что настоящее изобретение не ограничено соединениями, представленными в следующих примерах. Кроме того, получение исходных соединений представлено в примерах получения. Способы получения соединения формулы (I) не ограничены только теми, которые реально представлены в следующих примерах, и соединения формулы (I) можно также получить, используя любую комбинацию указанных способов или используя любой известный специалистам способ.

В примерах, примерах получения и таблицах, представленных далее, при необходимости использованы следующие сокращения.

Rex: Пример получения №, Ex: Пример №, №: Соединение №, Structure: Химическая структурная формула, Data: Физические и химические данные (FAB+: FAB-MС[M+H]⁺, FAB-: FAB-MС[M-H]^-, ESI+: ESI-MС[M+H]⁺, CI+: CI[M+H]⁺, EI: EI[M]⁺, ЯМР-ДМСО-d₆: δ (м.д.) ¹H-ЯМР пики в диметилсульфоксиде-d₆, ЯМР-CDCl₃: δ (м.д.) ¹H-ЯМР пики в хлороформе-d, MP: температура плавления (°C), Amrph: означает, что соединение находится в аморфной форме, Cryst: означает, что соединение находится в кристаллической форме, Соль: соль (если нет указания, рассматриваемое соединение находится в свободной форме), CL1: моногидрохлорид, CL2: дигидрохлорид, CL3: тригидрохлорид, FM: дифумарат, Me: метил, Et: этил, ⁱPr: изопропил, tBu: трет-бутил, nBu: н-бутил. Rsyn и Syn: Способ получения (число указывает способ, которым рассматриваемое соединение получают из соответствующих материалов и тем же способом, который использован для соединения, в котором указанное число является номером примера его получения, или примером №).

Пример получения 1

К смеси пропан-2-тиола (1,5 мл), карбоната калия (3 г) и N,N-диметилформамида (20 мл) добавляют 4-хлор-2-фторнитробензол (2,5 г) и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов. После добавления воды полученную реакционную смесь экстрагируют этилацетатом, и полученный экстракт промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая 4-хлор-2-изопропилсульфанил-1-нитробензол (3,30 г) в виде масла желтого цвета.

Пример получения 2

К смеси изопропилсульфината натрия (3,3 г) и N-метил-2-пирролидинона (20 мл) добавляют 2,3-дихлорнитробензол (4 г) и перемешивают в течение ночи при 70°C. Полученную реакционную смесь разбавляют водой, и выпавший твердый осадок собирают фильтрованием и промывают диэтиловым эфиром, получая 3-хлор-2-изопропилсульфонил-1-нитробензол (3,0 г) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример получения 3

К смеси м-хлорпербензойной кислоты (7,89 г) и хлороформа (100 мл) добавляют смесь соединения примера получения 1 (3,3 г) и хлороформа (50 мл) и перемешивают при 50°C в течение 7 часов. После охлаждения полученную реакционную смесь разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и экстрагируют хлороформом. После того как органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=3:1-2:1), получая 4-хлор-2-изопропилсульфонил-1-нитробензол (3,33 г) в виде твердого вещества желтого цвета.

Пример получения 4

К смеси 2-нитробензолсульфонилхлорида (5,09 г), N-метилэтиламина (1,35 г) и хлороформа (100 мл) добавляют триэтиламин (4,11 мл) при охлаждении льдом, и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов. Полученную реакционную смесь разбавляют водой и экстрагируют хлороформом. Органический слой промывают последовательно 1 M хлористоводородной кислотой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая N-этил-N-метил-2-нитробензолсульфонамид (6,48 г) в виде масла коричневого цвета.

Пример получения 5

К смеси N-циклопропил-2-нитробензолсульфонамида (5,63 г), карбоната калия (4,82 г) и N,N-диметилформамида (60 мл) добавляют метилиодид (2,17 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Полученную реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, и полученный остаток разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат над безводным сульфатом магния, затем отгоняют растворитель при пониженном давлении. Полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:диэтиловый эфир=1:0-1:1), получая N-циклопропил-N-метил-2-нитробензолсульфонамид (5,35 г) в виде твердого вещества коричневого цвета.

Пример получения 6

К смеси соединения примера получения 3 (3,3 г) и уксусной кислоты (30 мл) добавляют порошок железа (2,23 г) и перемешивают при 80°C в течение 3 часов. Нерастворимые материалы из полученной реакционной смеси удаляют, и растворитель отгоняют при пониженном давлении. Полученный остаток разбавляют этилацетатом (100 мл), и нерастворимые материалы удаляют, затем промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия растворитель отгоняют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=3:1-2:1), получая 4-хлор-2-изопропилсульфониланилин (2,79 г) в виде твердого вещества светло-оранжевого цвета.

Пример получения 7

К смеси 2,4-дихлор-6-метокси-1,3,5-триазина (370 мг) и тетрагидрофурана (10 мл) добавляют смесь 2-(изопропилсульфонил)анилина (400 мг), N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,72 мл) и тетрагидрофурана (5 мл) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и затем перемешивают при 70°C в течение 7 часов. Полученную реакционную смесь охлаждают на льду и разбавляют водой (60 мл). Выпавший твердый осадок собирают фильтрованием, очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ) и затем промывают гексаном, получая 4-хлор-N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-6-метокси-1,3,5-триазин-2-амин (200 мг) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример получения 8

К смеси 2-(изопропилсульфонил)анилина (450 мг) и N,N-диметилформамида (10 мл) добавляют 55% гидрид натрия в масле (200 мг) при охлаждении льдом и перемешивают в течение 30 минут с последующим добавлением 2,4-дихлорхиназолина (500 мг). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при охлаждении льдом и затем перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь охлаждают на льду, разбавляют водой и затем экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=5:1-3:1), получая 2-хлор-N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]хиназолин-4-амин (0,67 г) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Пример получения 9

К смеси 2-фторанилина (232 мг), 2,4-дихлорхиназолина (400 мг) и N,N-диметилформамида (4 мл) добавляют карбонат калия (430 мг) и перемешивают при комнатной температуре в течение 8 часов. Полученную реакционную смесь разбавляют водой (40 мл), выпавший твердый осадок собирают фильтрованием и очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=5:1-3:1), получая 2-хлор-N-(2-фторфенил)хиназолин-4-амин (0,22 г) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Пример получения 10

К смеси соединения примера получения 24 (309 мг) и ацетонитрила (5 мл) добавляют азетидингидрохлорид (112 мг) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,42 мл), и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Полученную реакционную смесь разбавляют водой, выпавший твердый осадок собирают фильтрованием и сушат, получая 4-азетидин-1-ил-6-хлор-N-(2-фторфенил)-1,3,5-триазин-2-амин (253 мг) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример получения 11

К смеси трет-бутил 4-гидроксипиперидин-1-карбоксилата (1,49 г) и тетрагидрофурана (30 мл) добавляют трет-бутоксид калия (830 мг) при охлаждении льдом, и перемешивают в течение 30 минут с последующим добавлением смеси 4-фтор-2-метокси-1-нитробензола (1,00 г) и тетрагидрофурана (20 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 3 часов, полученную реакционную смесь экстрагируют, добавляя воду и этилацетат, промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:диэтиловый эфир=4:1), получая трет-бутил 4-(3-метокси-4-нитрофенокси)пиперидин-1-карбоксилат (898 мг).

Пример получения 12

К смеси 4-фтор-2-метокси-1-нитробензола (5 г), карбоната калия (10 г) и N,N-диметилформамида (50 мл) добавляют 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан (5 г) и перемешивают в течение ночи при 70°C. Полученную реакционную смесь разбавляют водой (150 мл), и выпавший твердый осадок собирают фильтрованием и промывают диэтиловым эфиром, получая 8-(3-метокси-4-нитрофенил)-1,4-диокса-8-азаспиро[4,5]декан (7,86 г) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Пример получения 13

К смеси трет-бутил 3-(4-метилпиперазин-1-ил)пирролидин-1-карбоксилата (3,04 г) и хлороформа (30 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (10 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Полученную реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении для удаления растворителя, с последующим добавлением смеси 4-фтор-2-метокси-1-нитробензола (1,93 г), карбоната калия (12,2 г) и N,N-диметилформамида (60 мл). После перемешивания в течение ночи при 80°C полученную реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении для удаления растворителя, полученный остаток разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая 1-[1-(3-метокси-4-нитрофенил)пирролидин-3-ил]-4-метилпиперазин (2,16 г).

Пример получения 14

К смеси соединения примера получения 57 (6,68 г), 1-метилпиперазина (4,17 мл) и дихлорметана (100 мл) добавляют триацетоксиборгидрид натрия (8,04 г) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь разбавляют водой и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, экстрагируют хлороформом и затем промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-20:1), получая 1-[1-(3-этокси-4-нитрофенил)пиперидин-4-ил]-4-метилпиперазин (6,68 г).

Пример получения 15

К смеси 4-фтор-2-метил-1-нитробензола (3,08 г), карбоната калия (6,80 г) и N,N-диметилформамида (30 мл) добавляют пиперидин-4,4-диол гидрохлорид (3,83 г) и перемешивают при 70°C в течение 2 дней. Полученную реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, полученный остаток разбавляют водой и этилацетатом. Выпавший твердый осадок собирают фильтрованием. После сушки добавляют дихлорметан (56 мл), 1-метилпиперазин (3,00 мл) и триацетоксиборгидрид натрия (5,75 г) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь разбавляют водой и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, экстрагируют хлороформом, и затем промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом магния растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-20:1), получая 1-метил-4-[1-(3-метил-4-нитрофенил)пиперидин-4-ил]пиперазин (1,29 г).

Пример получения 16

К смеси концентрированной серной кислоты (40 мл) и уксусной кислоты (60 мл) последовательно добавляют N-[2-(4-хлорфенил)этил]-2,2,2-трифторацетамид (14,2 г) и параформальдегид (2,79 г) и перемешивают в течение ночи в атмосфере аргона. Полученную реакционную смесь добавляют к смеси льда и холодной воды, экстрагируют этилацетатом и затем промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом магния, растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая 7-хлор-2-(трифторацетил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (13,7 г) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Пример получения 17

Соединение примера получения 16 (13,7 г) растворяют в концентрированной серной кислоте (60 мл) и затем охлаждают до 0°C, затем добавляют по каплям раствор нитрата калия (3,3 г) в концентрированной серной кислоте (60 мл) в течение 1 часа. После перемешивания в течение 1 часа при охлаждении льдом полученную реакционную смесь добавляют к смеси льда и холодной воды. После экстрагирования этилацетатом органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат-гексан, получая 7-хлор-6-нитро-2-(трифторацетил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (4,46 г) в виде бесцветного твердого вещества.

Пример получения 18

К смеси трет-бутил 1-окса-4,9-диазаспиро[5.5]ундекан-9-карбоксилата (5,80 г) и диоксана (100 мл) последовательно добавляют 1 M водный гидроксид натрия (24,9 мл) и бензилхлорформиат (3,55 мл) при охлаждении льдом, и перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Полученную реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и затем экстрагируют этилацетатом. Органический слой концентрируют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=9:1-1:1), получая 4-бензил 9-трет-бутил 1-окса-4,9-диазаспиро[5.5]ундекан-4,9-дикарбоксилат (8,06 г) в виде бесцветного сиропа.

Пример получения 19

К смеси соединения примера получения 18 (8,06 г) и этанола (200 мл) добавляют 4 M хлористоводродную кислоту в диоксане (30 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток перекристаллизовывают из смеси диэтиловый эфир-этанол, получая гидрохлорид бензил 1-окса-4,9-диазаспиро[5.5]ундекан-4-карбоксилата (3,86 г) в виде бесцветного твердого вещества.

Пример получения 20

К смеси соединения примера получения 12 (7,83 г) и этанола (100 мл) добавляют 10% палладий-на-угле (содержание воды: 53%, 2,83 г) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере водорода при нормальном давлении. После фильтрования через целит полученный фильтрат выпаривают при пониженном давлении, получая 4-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8-ил)-2-метоксианилин (6,83 г) в виде твердого вещества светло-пурпурного цвета.

Пример получения 21

К смеси соединения примера получения 71 (1,32 г) и уксусной кислоты (30 мл) добавляют порошок железа (0,79 г) и перемешивают при 80°C в течение 3 часов. Нерастворимые материалы удаляют из полученной реакционной смеси, и растворитель отгоняют при пониженном давлении. Полученный остаток разбавляют этилацетатом, и нерастворимые материалы удаляют, затем промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая 2-хлор-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]анилин (290 мг).

В таблицах 8 и 9 представлены химические структуры соединений, полученных в приведенных выше примерах получения. Кроме того, по способу представленных выше примеров получения, дополнительные соединения, представленные в таблицах 10-16, получены также из соответствующих им исходных материалов. В таблицах 17-19 приведены результаты инструментальных анализов указанных соединений, полученных в примерах получения.

(Таблица 8÷19 смотри в конце описания).

Пример 1

К смеси 2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]анилина (230 мг) и этанола (3 мл) добавляют метансульфоновую кислоту (0,11 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут, с последующим добавлением соединения примера получения 8 (200 мг), и затем продолжают перемешивание при 100°C в течение 3 часов. После охлаждения полученную реакционную смесь разбавляют водой (20 мл) и pH доводят до 8, используя насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, с последующим фильтрованием для сбора выпавшего твердого осадка. Полученный твердый продукт очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол:насыщенный водный раствор аммиака=50:1:0,1-30:1:0,1), получая N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамин (0,26 г) в виде аморфного вещества желтого цвета.

Пример 2

К смеси 2-метокси-N⁴-метил-N⁴-(1-метилпиперидин-4-ил)бензол-1,4-диамина (150 мг) и этанола (3 мл) добавляют метансульфоновую кислоту (0,08 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут, с последующим добавлением соединения примера получения 8 (240 мг), и осуществляют дальнейшее перемешивание при 100°C в течение 3 часов. После охлаждения pH полученной реакционной смеси доводят до 8, добавляя воду и насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, и затем экстрагируют этилацетатом. Полученный экстракт промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол:насыщенный водный раствор аммиака=100:1:0,1-50:1:0,1), получая аморфное вещество коричневого цвета. Полученное аморфное вещество растворяют в этаноле (5 мл) и этилацетате (5 мл), с последующим добавлением 4 M хлористого водорода в этилацетате (0,3 мл). После перемешивания в течение 10 минут добавляют этилацетат (20 мл), и выпавший твердый осадок собирают фильтрованием, получая N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[метил(1-метилпиперазин-4-ил)амино]фенил}хиназолин-2,4-диамин тригидрохлорид (0,15 г) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Пример 3

К смеси соединения примера получения 27 (200 мг), 2-метокси-4-(морфолин-4-ил)анилина (158 мг) и ацетонитрила (10 мл) добавляют N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,13 мл) и кипятят с обратным холодильником в течение 12 часов. Полученную реакционную смесь разбавляют водой, выпавший твердый осадок собирают фильтрованием, сушат и затем очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=20:1), получая 2-({4-[(2-метокси-4-морфолин-4-илфенил)амино]-1,3,5-триазин-2-ил}амино)-N-метилбензамид (135 мг) в виде твердого вещества белого цвета.

Пример 4

Смесь соединения примера получения 22 (209 мг), 2-метокси-4-(4-фенилпиперазин-1-ил)анилина (189 мг), N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,12 мл) и N-метил-2-пирролидинона (3 мл) перемешивают при 120°C в течение 20 минут, используя систему микроволнового реактора. Полученную реакционную смесь разбавляют водой, и выпавший твердый осадок собирают фильтрованием, сушат и затем очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-20:1). Полученный продукт растворяют в этилацетате, и к этому добавляют 4 M хлористый водород в этилацетате, с последующим выпариванием при пониженном давлении для удаления растворителя. Полученный остаток кристаллизуют из этанола, получая N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-фенилпиперазин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин тригидрохлорид (273 мг).

Пример 5

К смеси соединения примера получения 34 (850 мг) и ацетонитрила (17 мл) добавляют соединение примера получения 37 (806 мг) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,44 мл) при комнатной температуре и перемешивают в течение 1 часа. Полученную реакционную смесь разбавляют водой, экстрагируют хлороформом, и затем промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом магния растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=1:1). Полученный продукт растворяют в этилацетате, и к этому добавляют 4 M хлористый водород в этилацетате, с последующим выпариванием при пониженном давлении для удаления растворителя. Полученный остаток кристаллизуют из смешанного растворителя, состоящего из этанола и этилацетата, получая 6-хлор-N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(пиперидин-4-илокси)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин гидрохлорид (323 мг).

Пример 6

Осуществляют взаимодействие смеси соединения примера получения 78 (320 мг), соединения примера получения 20 (260 мг), N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,17 мл) и N-метил-2-пирролидинона (1 мл) при 120°C в течение 20 минут, используя систему микроволнового реактора. После охлаждения полученную реакционную смесь выливают в воду (20 мл), выпавший твердый осадок собирают фильтрованием и затем сушат, получая твердое вещество светло-пурпурного цвета. К полученному твердому веществу добавляют уксусную кислоту (2 мл) и воду (1 мл), и перемешивают в течение ночи при 70°C. Полученную реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении, полученный остаток разделяют, добавляя этилацетат (50 мл) и насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (25 мл). Органический слой промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; н-гексан:этилацетат=1:1-1:3), получая N-изопропил-2-[(4-{[2-метокси-4-(4-оксопиперидин-1-ил)фенил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)амино]бензолсульфонамид (0,32 г) в виде аморфного вещества.

Пример 7

Смесь соединения примера 163 (174 мг), уксусной кислоты (2 мл) и воды (1 мл) перемешивают в течение ночи при 70°C. К полученной смеси добавляют этилацетат и насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, и органический слой промывают с насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом магния растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток растворяют в дихлорметане (5 мл), с последующим добавлением 1-метилпиперазина (0,063 мл) и триацетоксиборгидрида натрия (122 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение двух дней полученную реакционную смесь разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, экстрагируют хлороформом и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-20:1), получая 2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамид (42 мг) в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 8

К смеси соединения примера 31 (76 мг) и ацетонитрила (5 мл) добавляют пирролидин (0,041 мл) и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Полученную реакционную смесь разбавляют водой, и выпавший твердый осадок собирают фильтрованием, сушат и затем очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=20:1), получая 2-({4-[(2-метокси-4-морфолин-4-илфенил)амино]-6-пирролидин-1-ил-1,3,5-триазин-2-ил}амино)-N-метилбензамид (46 мг) в виде порошка белого цвета.

Пример 9

К смеси соединения примера 68 (3,15 г) и этилацетата (30 мл) добавляют 4 M хлористый водород в этилацетате (30 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, полученный остаток разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и затем экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол:насыщенный водный раствор аммиака=100:10:1), получая N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(пиперидин-4-илокси)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин (2,1 г) в виде бесцветного аморфного вещества.

Пример 10

К смеси соединения примера 62 (140 мг), морфолина (0,08 мл) и 1,2-дихлорпентана (2 мл) добавляют триацетоксиборгидрид натрия (80 мг) и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов. Полученную реакционную смесь разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и экстрагируют хлороформом, и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=100:0-100:1) и затем промывают диэтиловым эфиром, получая N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-[2-метокси-4-(4-морфолин-4-илпиперидин-1-ил)фенил]хиназолин-2,4-диамин (0,1 г) в виде порошка желтого цвета.

Пример 11

К смеси соединения примера 66 (150 мг), триэтиламина (0,05 мл) и тетрагидрофурана (2 мл) добавляют уксусный ангидрид (0,03 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Полученную реакционную смесь разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и экстрагируют этилацетатом, и органический слой промывают водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия. После сушки над безводным сульфатом натрия растворитель отгоняют при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=100:1-50:1) и затем промывают гексаном, получая N²-[4-(4-ацетилпиперазин-1-ил)-2-метоксифенил]-N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]хиназолин-2,4-диамин (0,11 г) в виде порошка желтого цвета.

Пример 12

К смеси соединения примера 147 (240 мг), формалина (0,18 мл) и 1,2-дихлорэтана (5 мл) добавляют триацетоксиборгидрид натрия (280 мг) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 дней. Полученную реакционную смесь разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и экстрагируют хлороформом, и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. После того как растворитель отгоняют при пониженном давлении, полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол:насыщенный водный раствор аммиака= 50:1:0,1-30:10:1) и затем промывают диэтиловым эфиром, получая N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-диазаспиро[5.5]ундекан-9-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин (135 мг) в виде порошка светло-желтого цвета.

Пример 13

Смесь соединения примера 22 (169 мг) и 6 M хлористоводородной кислоты (4 мл) перемешивают при 50°C в течение 2 часов. После охлаждения полученную реакционную смесь подщелачивают, добавляя воду и 1 M водный раствор гидроксида натрия, и затем экстрагируют хлороформом. Органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении с последующей перекристаллизацией из смеси этанол-диэтиловый эфир, получая 6-{[2-(изопропилсульфонил)фенил]амино}-4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2(1H)-он (27 мг).

Пример 14

Смесь соединения примера 23 (250 мг) и пиридингидрохлорида (1 г) перемешивают при 200°C в течение 10 минут. После охлаждения до комнатной температуры полученную реакционную смесь разбавляют водой и промывают хлороформом. Водный слой выпаривают при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-10:1), получая 2-[(4-{[2-(изопропилсульфонил)фенил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)амино]-5-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенол (45 мг).

Пример 15

К смеси соединения примера 102 (630 мг), этанола (10 мл) и тетрагидрофурана (10 мл) добавляют 10% палладий-на-угле (содержание воды: 53%, 500 мг) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов в атмосфере водорода при нормальном давлении. После фильтрования через целит, полученный фильтрат выпаривают при пониженном давлении, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-20:1), получая N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-окса-4,9-диазаспиро[5.5]ундекан-9-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин (102 мг).

Пример 16

К смеси соединения примера 177 (1,09 г) и этилацетата (10 мл) добавляют 4 M хлористый водород в этилацетате (10 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученную реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении, и полученный остаток промывают этилацетатом, собирают фильтрованием и затем сушат, получая N-(7-фтор-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ил)-N'-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин дигидрохлорид (950 мг) в виде бесцветного твердого вещества.

Пример 17

К смеси соединения примера 178 (1,2 г) и метанола (15 мл) добавляют 2 M хлористоводородную кислоту (15 мл) и кипятят с обратным холодильником в течение ночи. Полученную реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении, разбавляют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, экстрагируют хлороформом и затем промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия. Растворитель отгоняют, и полученный остаток очищают, используя колоночную хроматографию на силикагеле (элюент; хлороформ:метанол=1:0-20:1), получая N-(7-хлор-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ил)-N'-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин (260 мг) в виде бесцветного аморфного вещества.

Пример 18

К смеси соединения примера 62 (13,6 мг), метиламингидрохлорида (2,0 мг), триэтиламина (3,0 мг) и 1,2-дихлорэтана (0,5 мл) добавляют триацетоксиборгидрид натрия (10,5 мг) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь разделяют, добавляя хлороформ и воду, и органический слой выпаривают при пониженном давлении. Полученный остаток выделяют и очищают, используя ВЭЖХ (колонка: SunFire C18 5 мкм 19×100 мм (Waters Inc.), растворитель: MeOH/0,1% HCOOH-H₂O=10/90 (0 мин)-10/90 (1 мин)-95/5 (9 мин)-95/5 (12 мин), скорость потока: 25 мл/мин), получая N⁴-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N²-{2-метокси-4-[4-(метиламино)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамин (12,5 мг).

В примерах 76, 77, 78, 85 и 110 целевые соединения получают, осуществляя реакции таким же способом, и затем удаляют защитные группы, выделяют и очищают.

Пример 19

К смеси соединения примера 72 (9,6 мг), циклогексанона (2,9 мг) и дихлорметана (0,5 мл) добавляют триацетоксиборгидрид натрия (10,5 мг) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь разделяют, добавляя хлороформ и воду, и органический слой выпаривают при пониженном давлении. Полученный остаток выделяют и очищают, используя ВЭЖХ (колонка: SunFire C18 5 мкм 19×100 мм (Waters Inc.), растворитель: MeOH/0,1% HCOOH-H₂O=10/90 (0 мин)-10/90 (1 мин)-95/5 (9 мин)-95/5 (12 мин), скорость потока: 25 мл/мин), получая N-[4-(4-циклогексилпиперазин-1-ил)-2-метоксифенил]-N'-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин (5,1 мг).

В примерах 134 и 141 целевые соединения получают, осуществляя реакции таким же способом, и затем удаляют защитные группы, выделяют и очищают.

Пример 20

К смеси соединения примера 72 (9,6 мг), уксусной кислоты (1,8 мг), 1-гидроксибензотриазола (3,4 мг) и N,N-диметилформамида (0,5 мл) добавляют карбодиимид (PS-Carbodiimide (100 мг, Argonaut Technologies Inc.)) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. После добавления карбоната (MP-Carbonate (50 мг, Argonaut Technologies Inc)) и изоцианата (PS-Isocyanate (50 мг, Argonaut Technologies Inc)) при комнатной температуре, полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов и фильтруют для удаления нерастворимых материалов. Полученный фильтрат концентрируют при пониженном давлении, и полученный остаток выделяют и очищают, используя ВЭЖХ (колонка: SunFire C18 5 мкм 19×100 мм (Waters Inc.), растворитель: MeOH/0,1% HCOOH-H₂O=10/90 (0 мин)-10/90 (1 мин)-95/5 (9 мин)-95/5 (12 мин), скорость потока: 25 мл/мин), получая N-[4-(4-ацетилпиперазин-1-ил)-2-метоксифенил]-N'-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамин (6,8 мг).

В примерах 160, 161 и 162 целевые соединения получают, осуществляя реакции таким же способом, и затем удаляют защитные группы, выделяют и очищают.

В таблицах 20 и 22 представлены химические структуры соединений, полученных в представленных выше примерах. Кроме того, по способу представленных выше примеров, дополнительные соединения, представленные в таблицах 23-42, получены также из соответствующих им исходных материалов. В таблицах 43-50 приведены результаты инструментальных анализов указанных соединений, полученных в представленных выше примерах. (Таблицы 20÷50 смотри в конце описапния).

В таблицах 51-95 представлены химические структуры других соединений, входящих в объем настоящего изобретения. Эти соединения были получены или могут быть получены как описано выше в Примерах или Примерах получения, или любыми методами, известными специалисту в данной области, с или без модификаций.

Следует заметить, что символы в представленных ниже таблицах:

-R^1a', -R^1b', -R^1c', -R^1d', -R^2', -R^3', -R^4', -R^5', -R^6a', -R^6b', -R^6c', -R^6d' и -R^A соответствуют заместителям общей формулы.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Соединения формулы (I) или их соли обладают ингибирующей активностью в отношении киназной активности гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR, а также ингибирующей рост активностью в отношении клеточных линий человеческого немелкоклеточного рака легких NCI-H2228 и HCC827, и их можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения онкологических заболеваний, таких как рак легких в одном варианте, немелкоклеточный рак легких или мелкоклеточный рак легких в другом варианте, EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный рак легких в еще одном варианте, или EML4-ALK гибридный полинуклеотид-позитивный и/или мутантный EGFR полинуклеотид-позитивный немелкоклеточный рак легких в еще одном варианте.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Цифровой заголовок <223> в представленном далее списке последовательностей объясняется как "Искусственная последовательность". Более конкретно, каждая нуклеотидная последовательность, представленная последовательностями SEQ ID NO:9 или 10, в списке последовательностей, является искусственно синтезированной праймерной последовательностью.

Изобретение относится к производным ди(ариламино)арила, которые приведены в формуле изобретения. Соединения обладают ингибирующим эффектом в отношении киназной активности белка EML4-ALK v1 и белка EGFR. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанные соединения, ингибитору киназной активности гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR, применению указанных соединений для получения фармацевтической композиции и к способу профилактики или лечения немелкоклеточного рака легких или EML4-ALK гибридного полинуклеотид-позитивного и/или мутантного EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких. Технический результат - производные ди(ариламино)арила в качестве ингибиторов киназной активности белка EML4-ALK v1 и белка EGFR. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 95 табл., 55 пр., 2 ил.

1. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение выбрано из группы, состоящей из:
N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,
2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамида,
N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,
N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамида,
2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамида,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N⁴-[2-(изoпpoпилcyльфoнил)фeнил]-N²-{2-мeтoкcи-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамина,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-(2-метокси-4-пиперазин-1-илфенил)-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-1,8-диазаспиро[4.5]декан-8-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(1-метил-1,9-диазаспиро[5.5]ундекан-9-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N-циклопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[метил(1-метилпиперидин-4-ил)амино]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
1-(1-{4-[(4-{[2-(изопропилсульфонил)фенил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)амино]-3-метоксифенил}пиперидин-4-ил)пирролидин-3-ола,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-[2-метокси-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-1,3,5-триазин-2,4-диамина и
N⁴-[2-(изoпpoпилcyльфoнил)фeнил]-N²-{2-мeтoкcи-4-[4-(1-метилпиперидин-4-ил)пиперазин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамина.

2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение выбрано из группы, состоящей из:
N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,
2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамида,
N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,
N-изопропил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамида,
2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N-метилбензолсульфонамида,
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)азетидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина,
N⁴-[2-(изoпpoпилcyльфoнил)фeнил]-N²-{2-мeтoкcи-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}хиназолин-2,4-диамина и
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина.

3. Соединение по п.2 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение выбрано из группы, состоящей из:
N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамида,
2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамида и
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамина.

4. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой:
N-этил-2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}бензолсульфонамид.

5. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой:
2-{[4-({2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]амино}-N,N-диметилбензолсульфонамид.

6. Соединение по п.3 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой:
N-[2-(изопропилсульфонил)фенил]-N'-{2-метокси-4-[4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил]фенил}-1,3,5-триазин-2,4-диамин.

7. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении киназной активности белка EML4-ALK v1 и белка EGFR, включающая эффективное количество соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый эксципиент.

8. Ингибитор киназной активности гибридных белков EML4-ALK и мутантных белков EGFR, который включает соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль.

9. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения немелкоклеточного рака легких или EML4-ALK гибридного полинуклеотид-позитивного и/или мутантного EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких, которая включает соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль.

10. Применение соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения немелкоклеточного рака легких или EML4-ALK гибридного полинуклеотид-позитивного и/или мутантного EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких.

11. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, которое используют в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции для профилактики или лечения немелкоклеточного рака легких или EML4-ALK гибридного полинуклеотид-позитивного и/или мутантного EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких.

12. Способ профилактики или лечения немелкоклеточного рака легких или EML4-ALK гибридного полинуклеотид-позитивного и/или мутантного EGFR полинуклеотид-позитивного немелкоклеточного рака легких, который включает введение пациенту эффективного количества соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли.