ШТАММ PSEUDOMONAS PUTIDA 131, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ДЕСТРУКЦИЮ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 C12R1/40 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки сточных вод химических предприятий, содержащих фенольные соединения.

Известен штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens, осуществляющий биологическую деградацию фенола в сточных водах предприятий нефтехимического профиля, а также производства дубильных экстрактов [пат. RU №2077575, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, 1993].

Недостатками данного штамма являются низкая эффективность и длительное время очистки.

Известен штамм бактерий Pseudomonas cepacia ВДК, депонированный под номером ВКПМ В-7559, способный использовать в качестве питательного субстрата одновременно фенол и формальдегид [пат. RU №2144079, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, 1998].

Известен штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204, устойчивый в длительном непрерывном процессе биокаталитической деградации фенола [пат. RU №2201446, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 2001].

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa XP-25, депонированный под номером В-8613, осуществляющий биологическую деградацию ароматических соединений [пат. RU №2270806, МПК C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/385, 2004].

Недостатком данных штаммов является отсутствие адаптации их к средам с повышенным содержанием сульфид- и сульфат-ионов, содержащим фенольные соединения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является штамм Pseudomonas putida GFS-8, депонированный под номером ВКПМ В-5248, разлагающий фенол [АС СССР №1792925 по заявке №4908727 от 08.02.91]. Однако известный штамм разлагает фенол в сточных водах фенольного производства или аналогичных по составу, который резко отличается от состава сульфидно-щелочных стоков нефтехимических и нефтеперерабатывающих производств, имеющих повышенное содержание сульфид- и сульфат-ионов.

Задачей изобретения является получение нового штамма, с высокой эффективностью обеспечивающего деструкцию фенольных соединений, в частности в сульфидно-щелочных стоках нефтехимических и нефтеперерабатывающих производств, и обладающего высокой адаптационной способностью; расширение арсенала штаммов микроорганизмов, применяемых для очистки сточных вод.

Поставленная задача реализуется выделением и использованием нового штамма Pseudomonas putida для деструкции фенольных соединений. Штамм Pseudomonas putida 131 был выделен из загрязненных фенолом почв ОАО «Газпром нефтехим Салават» путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде, содержащей фенол, отбором наиболее активных форм и последующей адаптацией микроорганизмов к модельному стоку. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-10894, осуществляет эффективную деструкцию фенольных соединений и отличается от известных морфологическими, физиологическими и культуральными признаками.

Морфологические признаки. Палочковидные клетки. Грамотрицательны.

Культуральные признаки. На мясопептонном агаре (МПА) и селективном агаре для бактерий рода Pseudomonas растет обильно. МПА имеет состав, г/л:

Отвар мяса - 500 г свежего мяса, отделенного от пленок и жира/литр воды Агар - 20 Пептон - 10 NaCl - 5

На МПА формирует круглые колонии с ровными краями, кремового цвета, выпуклые с возвышением в центре, однородной консистенции, диаметром до 5 мм. На селективной среде для бактерий рода Pseudomonas образует колонии кремового цвета, блестящие, выпуклые, однородной консистенции, с ровными краями и ровной поверхностью, диаметром до 10 мм. Штамм хорошо растет в минеральной среде состава, приведенного в таблице 1.

Таблица 1 Состав минеральной среды для культивирования бактерий Вещество Содержание, г/л КН₂РO₄ - 0,16 Na₂HPO₄ - 0,55 MgSO₄ - 0,20 (NH₄)₂SO₄ - 0,50 FeSO₄ - 0,01 CaCl₂ - 0,01 фенол - 0,5 вода дистиллированная - до 1 л

При этом образуется желтый пигмент с зеленоватым оттенком. Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 25-30°С, отсутствие деструкции фенольных соединений при 15°С.

Биохимические признаки. Культура оксидазоположительна, утилизирует глюкозу, сорбит, маннит, инозит, обладает каталазной и аргининдегидрогеназной активностями, дает положительную реакцию на β-галактозидазу, не утилизирует цитрат, малонат, лактозу, сахарозу, не способна к декарбоксилированию лизина и орнитина, не образует индол и сероводород, не обладает уреазной активностью. Штамм не образует поли-β оксибутират, не способен к денитрификации.

При культивировании в минеральной среде состава, указанного в таблице 1, на шейкере со скоростью 180 об./мин и при температуре 26°С штамм Pseudomonas putida 131 полностью деструктурирует фенол в концентрации 500 мг/л за 12 часов.

Культура может храниться на селективной среде для бактерий рода Pseudomonas и МПА, при рН 7,0 при 4÷8°С 3 месяца.

Культивирование в лабораторных условиях. Для деструкции фенольных соединений культуру смывают с поверхности скошенной агаризованной среды в пробирке небольшим объемом 0,5÷1,0 мл стерильной водопроводной воды или 0,9%-ного раствора хлористого натрия и вводят в 3-5 мл стерильного мясопептонного бульона следующего состава, г/л:

Отвар мяса - 500 г свежего мяса, отделенного от пленок и жира/литр воды Пептон - 10 NaCl - 5

Выращивают в течение 12-18 часов при температуре 25-30°С. Полученной культурой заражают описанную в таблице 1 минеральную среду, в которой при культивировании в колбах на качалках полная деструкция фенола проходит за 12 часов.

Штамм относится к группе невирулентных, нетоксичных и нетоксигенных согласно заключению Уфимского НИИ МТ и ЭЧ Роспотребнадзора.

Приведем примеры использования штамма Pseudomonas putida 131 для деструкции фенольных соединений.

Пример 1. Образец №1 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават» (состав приведен в таблице 2) разбавляли в 2 раза в конической колбе нестерильной водопроводной водой до конечного объема, равного 30%-му объему колбы. Затем добавляли соль К₂НPO₄ в конечной концентрации 300 мг/л и 10% по объему культуры штамма Pseudomonas putida 131, выращенной, как описано выше, на минеральной среде с фенолом. Затем бактерии культивировали на шейкере 12 ч при температуре 25°С и скорости качания 180 об./мин. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 Пример деструкции фенольных соединений в сульфидно-щелочном стоке штаммом Pseudomonas putida 131 Показатели Сульфидно-щелочной сток Исходный После деструкции рН среды 7,5 8,9 Массовая концентрация сульфид-ионов, мг/л 29,8 9,6 Массовая концентрация сульфат-ионов, мг/л 432,0 288,0 Массовая концентрация фенольных соединений, мг/л 204,6 отсутствие

Пример 2. Образец №2 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават», содержащего фенольные соединения в концентрации 1200 мг/л, разбавляли в два раза водопроводной водой и доводили значение рН до 7,5 концентрированной серной кислотой. Затем вносили соль Na₂SO₄ так, что конечная ее концентрация составляла 4650 мг/л (в пересчете на сульфат-ион 3143 мг/л), а общая минерализация - 5400 мг/л. Бактерии штамма Pseudomonas putida 131 культивировали на качалках, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 Деструкция фенольных соединений бактериями Pseudomonas putida 131 в сульфидно-щелочном стоке с высоким содержанием сульфат-ионов Вариант Содержание фенольных соединений, мг/л, через 12 часов 18 часов 24 часа Pseudomonas putida 131 459,0 437,8 0,6 Без бактерий 598,7 563,9 524,8

Пример 3. Для примера деструкции фенольных соединений использовалась минеральная среда состава, указанного в таблице 4. Бактерии штамма Pseudomonas putida 131 культивировали на качалках, как описано в примере 1. После 40 часов культивирования на минеральной среде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии фенольные соединения не определялись.

Таблица 4 Состав минеральной среды, содержащей фенольные соединения Вещество Содержание, мг/л КН₂РO₄ 160 Na₂HPO₄ 550 MgSO₄ 200 (NH₄)₂SO₄ 500 FeSO₄ 010 СаСl₂ 010 Фенол 352 П-крезол 029 O-крезол 017 Вода дистиллированная до 1 л

Эффективная деструкция фенольных соединений в различных средах говорит о возможности быстрой адаптации штамма к изменяющимся условиям среды, т.е. подтверждает высокую адаптационную способность штамма Pseudomonas putida 131.

Таким образом, штамм Pseudomonas putida 131 с высокой эффективностью обеспечивает деструкцию фенольных соединений. Очищенные с помощью штамма сточные воды могут быть использованы для дальнейшей очистки с бытовыми сточными водами.

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки сточных вод химических предприятий, содержащих фенольные соединения. Штамм Pseudomonas putida 131 был выделен из загрязненных фенолом почв ОАО «Газпром нефтехим Салават» путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде с последующим отбором наиболее активных форм и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-10894. Изобретение позволяет повысить эффективность деструкции фенольных соединений. 4 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Pseudomonas putida 131 ВКПМ В-10894, осуществляющий деструкцию фенольных соединений.