Штамм бактерий РSеUDомоNаS рUтIDа - деструктор ароматических соединений и окиси мезитила Советский патент 1993 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 

аг so №

of //

Arunakumarl A. of al. Utilization of omatlc substances by Pseudomonas anacearum. // Ind.I.Exp.Biol., 1984, v.22, 10p.32-36.

Masque C. et al. Selection and adaptation a phenoldegrading strain of Pseudomonas. Blotechn.Lett. 1987, v.9, № 9, p.655-660.

(Л

С

Использование: утилизация ароматических соединений и окиси мезитила в фе- нольных сточных водах. Сущность: штамм бактерий Pseudomonas putlda GFS-8 депонирован под номером ВКПМ В-5248. Штамм обладает высокой деструктивной активностью в отношении ароматических соединений, а также окиси мезитила: полностью утилизирует 1000 мг/л фенола за 96 ч. 1 табл.

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии и заключается в выделении нового бактериального штамма, который может быть использован для очистки сточных вод как фенольного, так и других, имеющих в своем составе анало- ги||ные соединения.

. | В состав сточных вод производства фенола и ацетона кумольным способом входят фенол, ацетофенон, а -метилстирол, окись мезитила,. диметилфенилкарбинол, гидроперекись изопропилбензола (гипериз) и другие компоненты. Экологическая вредоносность данных сточных вод обусловлена высокой токсичностью большинства компонентов и усиливается при их смешении.

Фенол является целевым продуктом указанного производства и поэтому входит в состав сточных вод в качестве основного компонента. Кроме того, он входит в состав стоков производства фенолформальдегид- ных смол, нитро- и хлорфенолов, фенилсуль- фокислот, капролактана салициловой и пикриновой кислот и других ароматических соединений. Предельно допустимая

о ю

sQ hO СЛ

центрация фенола в воде составляет 0,001 мг/л.

Ацетофенон в процессе производства фенола и ацетона образуется при кислотном гидролизе гипериза. Он может встречаться также в сточных водах парфюмерной промышленности, где используется в качестве душистого вещества, и в сточных водах фармацевтических производств. ПДК в воде 0,1 мг/л. Кроме того, при обеззараживании воды путем хлорирования (в частности, на очистных сооружениях) ацетофенон может превращаться в хлорацетофенон - отравляющее вещество - лакриматор с непереносимой концентрацией 0,005 мг/л/ 2 мин.

а-Метилстирол получается при кислотном гидролизе гипериза, при дегидратации диметилфенилкарбинолз, при дегидрирова- нии-изопропилбензола, в процессе производства фенола и ацетона, а -метилстирол входит в состав сточных вод производства бутадиенметилстирольного каучука, предприятий органического синтеза и нефтехимического производства. ПДК в воде 0,1 мг/л.

В процессе производства фенола из ацетона кумольным способом ацетон, получающийся в результате разложения гипериза, в присутствии серной кислоты превращается в окись мезитила. Окись ме- зитила применяется также как растворитель эфиров целлюлозы, поливинилхлорида, природных смол, является инсектицидом.

Штаммы, способные утилизировать фенол, известны. Например французские исследователи селекционировали штамм Nocardla sp. В 87, способный разрушать фенол в концентрации 2000 мг/л. Однако процесс деструкции требовал обязательного присутствия источника азота и углерода.

Известны штаммы, способные кроме фенола, утилизировать и другие ксенобио- тики. Например, штамм Pseudomonas putida CB-173 (300 мг/л фенола, за 48 ч, при 30°С) способен разрушать и неионогенныё поверхностно-активные вещества, но осуществляет эти процессы на полноценной среде.

Известен штамм, разрушающий а -метилстирол (Bacillus cereus Kk 3,2000 мг/л, за 72 ч). Однако данные о его способности использовать другие компоненты фенольных сточных вод в качестве питательных субстратов отсутствуют.

Известны штаммы, способные разрушать многие ароматические соединения. Так, например, штамм Pseudomonas sotanacearum способен использовать в качестве единственного источника углерода 46 ароматических субстратов. Однако ни фенол, ни другие компоненты фенольных сточ- ных вод не входят в спектр его

деструктивной активности.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Pseudomonas sp. QT31, разрушающий фенол в концентрации 1000 мг/л за 36-95 ч в зависимости от времени адаптации. Недостатком всех указанных штаммов является отсутствие у них способности биодеградации широкого спектра субстратов, являющихся компонентами сточных вод

производства фенола.:

Целью изобретения является получение штамма бактерий, способного утилизировать компоненты сточных вод производства фенола и ацетона (такие, как фенол, ацетофенон, а -метилстирол, окись мезитила) и сохраняющего свою деструктивную активность в сточных водах.

Предлагаемый штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных

микроорганизмов ВНИИ генетика под регистрационным номером ВКПМ В-5248.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки штамма представляют собой короткие палочки с тупыми концами, расположенными одиночно и попарно, грамотрицательные, спор и капсул не образуют.

Культуральные свойства. На синтетической минеральной среде М9 следующего состава, мг/л: №2НР04 6000; КН2Р04 3000 мг/л; NaCI 500; NH C11000; агар-агар 15000, содержащей ароматические соединения в

качестве единственного источника углерода и энергии после 72 ч инкубирования при 30°С образует колонии диаметром 1,5-2 мм правильной округлой формы, гладкие, блестящие, края ровные.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб, подвижен, каталазо- и оксидазопо- ложителен, образует аргининдигидролазу и уреазу; желатиназу, амилазу, фенилаланин- дезаминазу не образует. На среде Хью-Лейфсона образует кислоты из L-арабинозы, L-ксилозы, глюкозы, мальтозы, сахарозы и галактозы. На МПА и Кипг В образует ли- монно-желтый флюоресцирующий пигмент.

В качестве единственного источника углерода и энергии способен использовать ацетат, L-арабинозу, сахарозу, малонат, этанол, сорбит, L-аланин, L-глугамин, маннит, сук- цинат, глицерин, L-ксилозу, глюкозу, сахарозу, L-рамнозу и лектозу.

Оптимальные условия культивирования на полноценных питательных средах: рН 7.0 ±0,5; 30 ±1°С.

Условия хранения. Стерильные столбики (среда М9, агар-агар 7500 мг/л, ацетофе- нон или фенол в концен рации 500 мг/л), инкубируют при 30°С 72-96 ч, заливают 1 мл стерильного вазелинового масла и хранят пр и 4°С, пересевают 2 раза в год.

Чувствительность к актибактериальным препаратам. Штамм устойчив к линкомици- ну, ристомицину, бензилпеницилину, оле- андомицину; штамм чувствителен к стрептомицину, полимиксину, рифампици- ну, тетрациклину, левомицитину, эритроми- цйну, карбеницилину, гентамицину.

Патогенные свойства. При внутрибрю- шинном заражении беспородных белых мышей (10 животных на пробу) взвесью суточной культуры штамма в концентрации 1 флрд.микробных тел-мл в объеме 0,5 мл на животное заболевания не обнаружено. Срок наблюдения 7 дней. Это дало основание считать культуру штамма непатогенной.

-: На основании комплекса морфолого- культуральных и физиолого-биохимических свЬйств штамм был идентифицирован как Pseudomonas putida.

П р и м е р 1. Получение штамма GFS8.

f Штамм Pseudomonas putida GFS8 был вь делен из образца почвы, взятого .на территории предприятия, производящего фе- нсл и ацетон, методом прямого высева почвенной суспензии на агазированную

ср

еду

М9 следующего состава, мг/л: М 42ЙР04 6000; КН2РСч 3000; NHUCI 1000; NaCl 500, фенол 500, агар-агар 15000; рН 7,0 ±0,2.

: Выделенную культуру пассировали на плотной среде того же минерального соста- ва, содержащей постепенно повышающиеся концентрации фенола (с 500 до 1125 мг/л), отбирая для дальнейших исследований наиболее крупные колонии.

На среде М9, содержащей 1-125 мг/л фенолав качестве единственного источника углерода, рост данной культуры не наблюдался. Клоны,отобранные с плотной синтетической минеральной среды М9 с содержанием фенола 100 мг/л проверяли на; способность к утилизации этого субстрата1 при культивировании на жидкой среде того же состава в колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды. Изменение содержа- ни|я фенола в среде культивирования контролировалось спектрофотометрически (270 нм). .

Дальнейшие исследования показали,

чти данный штамм способен помимо фено0

5

0

5

0

5

5

0

5

ла метаболизироватьтакже а-метистирол, окись мезитила (500 мг/л), 4-хлор-бензой- ную кислоту (750 мг/л) и бензямид (500 мг/л) в качестве единственного источника углерода при культивировании на минеральной среде М9 при 30°С. В результате пассирова- ния по плотным минеральным средам, как описано выше, удалось получить клоны, способные утилизировать более высокие концентрации, ацетофенона 1250 мг/л, окись мезитила 1000 мг/л.

П р и м е р 2. Использование штамма GFS8 в качестве единственного деструктора фенола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Суточную культуру штамма GFS8, выращенную на агаризованнсй полноценной питательной среде, отмывали трехкратным центрифугированием при 6000 об/мин в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. 1 мл суспензии (10 клеток/мл) вносили в колбу на 250 мл, содержащую 100 мл неагаризс- ванной среды |И9 (состав среды см.пример 1) и 1000 мг/л фенола в качестве единственного источника углерода м энергии, Культивирование проводили на круговой качалке (120-135 об/мин) при 28-30°С, Изменение содержания фенола в среде культивирования контролировалось методом УФ-спект- рофотометрии (максимум поглощения данного вещества 270 нм) и фотоколориметрии (реакция с 4-аминоантипирином).

Через 96 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях фенол в среде культивирования названным методом не обнаруживался.

П р и м е р 3. Использование штамма GFS-8 в качестве деструктора ацетофенона в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение процесса утилизации ацето1 фенона заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2 с-тем отличием, что вместо фенола использовался- ацетофенон в концентрации 1250 мг/л. Изменение содержания ацетофенона в среде культивирования контролировалось методами УФ-спектрофотометрии (максимум поглощения 245 нм) и газовой хроматог- рафии.

Через 96 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях ацетофенон в среде названными методами не определялся.

П р и м е р 4. Использование штамма GFS-8 в качестве деструктора а-метилст- - рола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение процесса утилизации а-ме- тилстирола заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода вместо фенола использовался а -метилстирол в концентрации 500 мг/л, Изменение содержания а-метилстирола вереде культивирования контролировалось методами УФ-спектрометрии (максимум поглощения 244 нм) и газовой хроматографии.

Через 24 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях а-метил- стирол в среде названными методами ад определялся,.

П р и м е р 5. Использование штамма GFS-8 в качестве деструктора окиси мезити- ла в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение процесса утилизации окиси мезитила заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода вместо фенола использовалась окись-мезитила в концентрации 1000 мг/л. Изменение содержания окиси мезитила в среде культивирования контролировалось методами УФ-спектро- фотометрии (максимум поглощения 243 нм) и газовой хроматографии.

Через 96 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях окись мезитила названными методами в среде не определялась..

П р и м е р 6. Использование штамма GFS-8 в качестве деструктора фенола и аце- тофенона при их совместном содержании в среде в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение процесса утилизации фенола и ацетофенона при их совместном содержании в среде культивирования проводилось по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что помимо фенола 150 мг/л неагаризованная минеральная синтетическая среда М9 (состав см. пример 1) содержала ацетофенон в такой же концентрации 150 мг/л, Изменение содерхония обоих субстратов в среде культивирования

Формула изобретения Штамм бактерий Pseudomonas putida GFS-8 ВКПМ-В-5248 - деструктор аромаконтролировалось методами УФ-спектро- фотометрии (максимум поглощения; фенол 270 нм, ацетофенон 245 нм) и газовой хроматографии,

Через 15 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях ацетофенон названными методами не определялся, Через 19 ч пнализ показал отсутствие в среде фенола.

Результаты испытания биодеструктивной активности заявляемого штамма, а также штамма-прототипа приведены в таблице.

Сравнение биодеструктивных характеристик заявляемого штамма с прототипом

показывает, что штамм Pseudomonas sp QT

31 после длительной адаптации способен

полностью утилизировать 1000 мг/л фенола

за ч, а заявляемый штамм разрушает

ту же концентрацию фенола за 96 ч. Однако от прототипа его выгодно отличает способность деградации ацетофенона (1250 мг/л за 96 ч), а-метилстирола (500 мг/л за 24 ч), окиси мезитила (1000 мг/л за 96 ч), являющихся компонентами фенольных сточных вод.

Испытание штамма в пробах реальных сточных вод, содержащих фенол ацетофенон, окись мезитила, 2-метилстирол показали его жизнеспособность и деструктивную активность по отношению к указанным компонентам. Присутствие достаточно высоких (350 мг/л) концентраций диметилфенилкарбинола и незначительных

примесей гипериз а, ацетона не снижает биодеструктивной активности заявляемого штамма по отношению к основным компонентам сточных вод.

Таким образом, предлагаемый штамм

.обладает высокой деструктивной активностью, прошел испытания в образцах реальных промышленных сточных вод и может быть рекомендован для локальной очистки фенольных сточных вод от таким компонентов, как фенол, ацетофенон, а-метилстирол, окись мезитила, как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сточных водах,

50

тических соединений тил а.

и окиси мези