Способ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и предназначено для цитохимического определения активности дегидрогеназ лимфоцитов.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет более полного выявления активности дегидрогеназ при одновременном ускорении способа путем исключения фиксации мазков крови перед инкубацией за счет того, что инкубация проводится в среде, содержащей альбумин который способствует удержанию клеток на предметном стекле и сохранению их формы, а также связыванию жирных кислот, ингибирующих де- гидрогенази.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежеприготовленные и высушенные при комнатной температуре в течение 30 мин мазки крови инкубируют во влажной камере при 37°С в течение 60 мин со средой следующего состава: п-нит- ротетразолиевый фиолетовый 0,25 мг/мл, субстрат соответствующей дегидрогена-- зы 0,1 моль/л с коферментом (1 мг/мл), если он необходим для окисления субстрата, фосфатный буфер 0,07 моль/л (рН 7,2), этилендиаминтетраацетат 0,5 ммоль/л, сывороточный альбумин 5 мг/мл. После инкубации мазок крови сушат при комнатной температуре, фиксируют в парах формалина 30 мин, ополаскивают дистиллированной водой и докрашивают краской Романовского (1 капля на 2 мл дистиллированной восл in

ее & о

00

to

20

2.5

315539

ы) в течение 10-15 мин. Микроскопи- ование проводят с масляной иммерсионной средой. Подсчитывают в клетках крови образовавшиеся гранулы формазана, по количеству которых судят об активности дегидрогеназ.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в расширении диапазона выявления активности фермента (что позволяет отметить более тонкие граации метаболического состояния клеток крови в условиях нормы и патологии) , существенном уменьшении доли клеток с нулевой активностью фермен- та и сокращении общего времени приготовления препарата до 3-3,5 ч.

При определении активности сукци- натдегидрогеназы лимфоцитов периферической крови предложенным способом встречаются клетки, содержащие от 1 до 60 и более гранул, формазана, причем активность ферментов выявляется в 97-99% лимфоцитов, в отличие от известного способа, по которому содер- жа ние лимфоцитов с нулевой активностью значительно (около 40%) .

Пример . Определение актив- сукцинатдегидрогеназы.

Испытания проведены на 20 белых беспородных крысах массой 200-230 г. Кровь получали путем пункции хвостовой вены. Готовили по 4 мазка крови от каждой крысы, один из которых обрабатывали предложенным способом, второй - без субстрата окисления в среде инкубации (контроль), третий - по способу-прототипу, четвертый - по прототипу, но без субстрата окисления в среде инкубации (контроль).

Приготовление препарата предложенным способом производилось в следующей последовательности.

Свежеприготовленные мазки крови сушили при комнатной температуре 30 мин.д Далее предметные стекла с мазками помещали во влажную камеру, поверх мазка наливали 0,8 мл инкубационной среды следующего состава: п-нитротетразо- лиевый фиолетовый 0,25 мг/мп сукци- нат натрия 0,1 моль/л, фосфатный буфер 0,07 моль/л (рН 7,2), этилендиамин- тетраацетат 0,5 ммоль/л. Контрольное исследование проводили с инкубационной средой того же состава, но без сукцината

30

35

40

55

Инкубацию проводили в термостате при 37 С 60 мин. Затем мазки извлекали из термостата, высушивали при комнатной температуре под струей

o

0

.5

39

д-

0

5

40

55

034

воздуха от вентилятора, проводили фиксацию мазков в парах.формалина 30 мин, ополаскивали дистилпированной водой, сушили и докрашивали разведенной краской Романовского (1 капля на 2 мл дистиллированной воды) 10 мин.

Приготовление препарата по методике прототипа проводили следующим образом.

Свежеприготовленные мазки крови сушили при комнатной температуре 2 ч. Далее мазки фиксировали в холодном 60%-ном ацетоне, насыщенном этилен- диаминтетраацетатом, в течение 30 с, промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе и инкубировали во влажной камере при 37°С 60 мин со средой следующего состава: п-нит- ротетразолиевый фиолетовый 0,25мг/мл, сукцинат натрия 0,1 моль/л, фосфатный буфер 0,07 моль/л (рН 7,2), этилен- диаминтетраацетат 0,5 моль/л. После инкубации мазок промывали дистиллированной водой, проводили дополнительную фиксацию в парах формалина 30 мин9 промывали дистиллированной водой, сушили и докрашивали 0,5%-ным раствором метиленового зеленого на ацетатном буфере (рН 5,0) в течение 10. мин.

Микроскопировали высушенные мазки под масляной иммерсией при увеличении 12x1,25x100. Подсчитывали количество образовавшихся гранул формазана в 50 лимфоцитах.

Результаты испытаний показали, что в обеих контрольных пробах (без субстрата окисления) гранулы формаэана в клетках, как правило, не образовывались, редко - одна-две.

Статическая обработка результатов проведена при помощи парного критерия Билкокеона.

Результаты испытаний представлены

в таблице.

Формула изобретения

Спрсоб определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах путем приготовления мазков крови, инкубации их в среде, содержащей буферный раствор, субстрат окисления, этилеидиаминтет- раацетат и п-нитротетразолиевый фиолетовый с последующим высушиванием мазков и подсчетом гранул формазана в лимфоцитах под микроскопом, отличающийся тем, что, с це515539036

лью повышения точности способа за счет нии способа, в среду инкубации допол.- более полного выявления активности нительно вводят сывороточный альбумий дегидрогеназ при одновременном ускоре- в концентрации 5 мг/мл.

Способ определения активности дегидрогеназ в лимороцитах относится к области медицины, а именно гематологии. Целью изобретения является повышение точности способа за счет более полного выявления активности дегидрогеназ. Активность дегидрогеназ определяется цитохимическим методом с использованием инкубационной среды, содержащей п-нитротетразолиевый фиолетовый, субстрат окисления, фосфатный буфер, этилендиаминтетраацетат и сывороточный альбумин, конечная концентрация альбумина 5%. Использование сывороточного альбумина как компонента инкубационной среды способствует удержанию клеток на предметном стекле и сохранению их формы без предварительной фиксации мазка, а также связывает жирные кислоты крови, ингибирующие дегидрогеназы. Одновременно обеспечивается ускорение способа.

Среднее количество гранул формаза- на на 1 лимфоцит Содержание лимфоцитов с нулевой активностью фермента, %

Продолжительность приготовления препарата, ч

13

0,001

38

2,5

0,001

4,5