БИОКОНЪЮГАТЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ КИСЛОТ ЛУПАНОВОГО РЯДА С ГИДРАЗИДОМ КИСЛОТЫ "ТРОЛОКС", СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОТРОПНЫХ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2012 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61P29/00 A61P37/00 

Предлагаемое изобретение относится к области биоорганической химии и медицины новых биологически активных производных тритерпеноидов лупанового ряда (бетулин, бетулиновая, бетулоновая кислоты), конкретно изобретение относится к новым химическим соединениям 6-гидрокси-N′-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбогидразида (1) и 6-гидрокси-N′-[3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбогидразида (2), проявившим противовоспалительную и иммунотропную активность, и способу их получения. Соединения 1 и 2 представляют собой гибридные молекулы, комбинированные из фрагментов бетулоновой (3) или бетулиновой кислоты (4) и 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбоновой кислоты (кислота «Тролокс») (5), связанных гидразидным мостиком:

Нативный терпеноид бетулин 6 и его доступные полусинтетические производные бетулоновая 3 и бетулиновая кислоты 4 составляют очень важный для медицинской химии класс соединений с широким спектром биологического и фармакологического действия. Особый интерес к соединениям ряда лупана вызван их противоопухолевыми и противовирусными (анти-ВИЧ) свойствами [Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Химия в интересах устойчивого развития. 2005, т.13, с.1-30; Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. // Биоорг. хим. 2006, т.32, №1, с.42-55; Yogeeswari P., Sriram D. // Curren Med. Chem. 2005, v.12, p.657-666].

На сегодняшний день наряду с бетулином и лупановыми кислотами 3, 4 все большее применение получают их производные, синтезированные трансформацией функциональных групп (оксо-, гидрокси-, карбокси- и экзо-метиленовая группы), связанных с терпеноидным остовом при углеродных атомах С-3, С-17 и С-20.

Синтезирована обширная библиотека новых представителей лупановых тритерпеноидов, а систематические исследования этих соединений по взаимосвязи структура-активность позволили выявить высокоактивные вещества, превосходящие по своей фармакологической значимости бетулин, бетулоновую и бетулиновую кислоты [Mukherjee R., Kumar V., Srivastava S.K., Agarwal S.K., Burman A.C. Anti-Cancer agents in Med. Chem. 2006, v.6, p.271-279; Genet C., Strehle A., Schmidt C., Boudjelal G., Lobstein A., Schoonjans K., Souchet M., Auwerx J., Saladin R., Wagner A // J. Med. Chem., 2010, v.53, p.178-190; Pohjiala L., Alakurtti S., Ahola T, Yli-Kauhaluoma J., Tammela P. // J. Nat. Prod. 2009, v.72, p.1917-1926; Wen X., Sun H., Liu J., Cheng K., Zhang Pu, Zhang L., Hao J., Zhang L., Ni P., Zographos S.E., Leonidas D.D., Alexacou K-M., Gimisis Т., Hayes J.M., Oikonomakos N.G. // J. Med. Chem. 2008, v.51, p.3540-3554].

В серии работ в качестве высокоактивных противовоспалительных агентов ингибиторов продукции оксида азота (NO) в активированных макрофагах мышей описаны новые синтетические тритерпеноиды олеанового ряда. Биологическая активность этих соединений обусловлена синтетическими трансформациями кольца А, направленными на формирование 2-циано-1,3-енонового фрагмента [Honda Т., Rounds B.V., Gribble G.W., Suh N., Wang Y., Sporn M.B. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, v.8, p.2711-2714; Honda Т., Rounds B.V., Bore L., Favaloro F.G., Gribble G.W., Suh N., Wang Y., Sporn M.B. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, v.9, p.3429-3434; Honda Т., Honda Y., Favaloro F.G., Gribble G.W. Suh N., Place A.E., Rendi M.H., Sporn M.B. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, v.12, p.1027-1030; Honda Т., Gribble G.W., Suh N., Finlay H.J., Rounds B.V., Bore L., Favaloro F.G., Wang Y., Sporn M.B. // J. Med. Chem., 2000, v.43, p.1866-1877].

Позднее авторы использовали успешно разработанную ими синтетическую стратегию в синтезе новых аналогов бетулиновой кислоты, содержащих еноновую функцию в кольце А. [Honda Т., Liby K.T., Su X., Sundararajan Ch., Honda Y., Suh N., Risingsong R., Williams Ch.R., Royce D.B., Sporn M.B., Gribble G.W. // Bioorg. Med. Chem. Lett, 2006, v.15, №16(24), p.6306-6309]. Биотестирование новых терпеноидов лупанового ряда выявило их высокую эффективность как ингибиторов продукции оксида азота в RAW-клетках, стимулированных γ-интерфероном. В ряду этих соединений особый интерес представлял конъюгат модифицированной бетулиновой кислоты с имидазолом (1-(2-циано-3-оксолуп-1,20(29)-диен-28-оил)имидазол), который проявил высокую активность in vivo в стимулировании противовоспалительного и цитопротекторного фермента гем-оксигеназы-1.

В настоящее время при создании новых полифункциональных лекарственных средств, предназначенных для профилактики и комплексного лечения заболеваний, связанных с интенсификацией перекисного окисления липидов (онкологические, сердечно-сосудистые, воспалительные, нейродегенеративные и другие заболевания), в качестве лидеров наиболее часто используются гибридные соединения, в которых фармакофоры различных биологически активных веществ комбинированы с молекулой-антиоксидантом. Обнадеживающие результаты в этом направлении получены при вовлечении в комбинации с другими молекулами коммерчески доступного гидрофильного аналога α-токоферола - кислоты «Тролокс». Сочетанием кислоты «Тролокс» с N,N′-диэтилэтилендиамином осуществлен синтез соединений проявивших антиоксидантные и антиаритмические свойства, эффективных в предотвращении реперфузионной аритмии [Koufaki M., Calogeropoulou Т., Rekka E., Chryselis М., Раpazafiri P., Gaitanaki С., Makriyannis J. // Bioorg. Med. Chem. 2003. V.11. P.5209-5219].

На основе кислоты «Тролокс» и аминов с церебропротекторными свойствами получены гибридные молекулы, проявившие нейрозащитные эффекты при ишемических и травматических нарушениях центральной нервной системы [Jon Jacobsen Е., VanDoornik F.J., Ayer D.E., Belonga K.L., Braughler J.M., Hall E.D., Houser D.J. // J. Med. Chem. 1992. V.35. P.4464-4472].

Осуществлена комбинация короткоцепочечного аналога α-токоферола с эфирными производными аскорбиновой кислоты. Полученные гибридные соединения превосходили по своей антиоксидантной активности α-токоферол и аскорбиновую кислоту и проявили высокую активность в предотвращении реперфузионно-ишемических нарушений [S.Manfredini, S.Vertuani, В.Manfredi, G.Rossoni, G.Calviello, P.Palozza // Bioorg. Med. Chem. 2000. V.8, P.2791-2801].

О синтезе конъюгатов кислоты «Тролокс» или ее производных с пентациклическими тритерпеноидами ряда лупана в литературе не сообщалось, тогда как наличие метилированного хроманового фрагмента с высоким антиокислительным действием может привести к проявлению гибридным соединением новой ценной биологической активности.

Известен способ синтеза гидразида бетулиновой кислоты действием гидразингидрата на хлорангидрид бетулиновой кислоты в эфире [Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматуллин Л.Р., Павлова Н.И., Николаева С.Н., Савинова О.В., Еремин В.Ф., Балтина Л.А., Галин Ф.З., Толстиков Г.А. // Биоорг. химия, 2003, т.29, №3, с.326-332]. Однако об использовании этого соединения в каких-либо химических трансформациях, в том числе и в синтезе гибридных молекул, не сообщалось. Известен способ получения гидразида кислоты «Тролокс» под действием N,N′-карбонилдиимидазола (CDI) в ТГФ [Lopez G.V., Blanco F., Hernandez P., Ferreira A., Piro O.E., Battyany C., Gonzalez M., Rubbo H., Cerecetto H. // Bioorg. Med. Chem. 2007. v.15, p.6262]. Однако в реакции конденсации с пентациклическими тритерпеноидами это соединение не исследовалось.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала высокоактивных противовоспалительных и иммунотропных агентов. Решение этой задачи достигается получением новых фармакологически перспективных гибридных соединений конденсацией остатков терпеновых кислот и кислоты «Тролокс», связанных гидразидным мостиком путем взаимодействия предварительно синтезированных хлорангидридов бетулоновой (7) и бетулиновой кислот (8) с гидразидным производным кислоты «Тролокс» (9).

Предлагаемый способ получения соединений 1 и 2 заключается в проведении реакции кислоты «Тролокс» с моногидратом гидразина в абсолютном тетрагидрофуране (ТГФ) в присутствии N,N′-карбонилдиимидазола (CDI) и вовлечении гидразидного производного (9) в конденсацию с хлорангидридами бетулоновой или бетулиновой кислот (7) и (8), полученными непосредственно перед реакцией действием оксалилхлорида по известному методу [Шон Л.Б., Каплун А.П., Шпилевский А.А., Андия-Правдивый Ю.Э., Алексеева С.Г., Григорьев В.Б., Швец В.И. Биоорган. химия. 1998, т.24, с.787; Hiroya К., Takahashi Т., Miura N., Naganuma A., Sakamoto Т. Bioorg. Med. Chem. 2002, т.10, с.3229].

Реагенты и условия: а). CDI, NH₂NH₂·H₂O, ТГФ; b). (СОСl)₂, бензол; с). EDC, CH₂Cl₂, кипячение, 12 ч.

Реакцию конденсации проводят в абсолютном CH₂Cl₂ при комнатной температуре или при кипячении в течение 7-12 ч (преимущественно кипячение в течение 12 ч) с использованием в качестве конденсирующего агента N-этил-N′-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) (1.2-2 ммоль, предпочтительно 2-кратный мольный избыток на хлорангидрид кислоты) при мольном соотношении гидразида 9 и хлорангидрида 7 или 8-1.1:1.0. Продукты реакции 1 или 2 выделяют колоночной хроматографией на силикагеле. Выход гидразидов 1 или 2 составляет 65%.

Влияние гибридных молекул 1, 2 и бетулиновой кислоты (4) на активность макрофагов оценивалось по их действию in vitro на продукцию оксида азота макрофагов, активированных липополисахаридами (ЛПС), а также на активность макрофагальной аргиназы. Исследуемые вещества применяли в концентрациях 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 10 мкг/мл, 25 мкг/мл и 50 мкг/мл.

Для изучения влияния исследуемых веществ на продукцию оксида азота ЛПС-активированными макрофагами и активность макрофагальной аргиназы перитонеальные макрофаги мышей линии С57В 1/6 инкубировались в присутствии ЛПС с указанными концентрациями веществ в течение 2-х суток. По окончании инкубации оценивали продукцию оксида азота (по содержанию нитритов) в супернатантах клеточных культур и активность аргиназы в гомогенатах клеток.

Проведенные исследования показали, что бетулиновая кислота подавляла как продукцию оксида азота (признак M1), так и активность аргиназы (признак М2). Гибридные молекулы 1 и 2 в отличие от бетулиновой кислоты обладали селективным действием на макрофаги (позволяли получать макрофаги с фенотипом М2 с сохранением продукции таких противовоспалительных цитокинов, как ИЛ-10 и TGF-β). Кроме того, соединения 1 и 2 проявили иммунорегулирующую активность, поскольку подавляли Th1 тип иммунного ответа. Применение таких соединений эффективно при различных аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, диабет I типа).

В работе использованы мыши линии С57В 1/6 массой 18-20 г в возрасте 1,5-2 мес, полученные из питомника НИИ фармакологии СО РАМН. Мыши конвенциональные 1-й категории (сертификат Научного центра биомедицинских технологий РАМН №188-05). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Мыши размещались по 4-5 особей в пластиковых клетках фирмы VELAZ на подстилке из мелкой древесной стружки. Температура воздуха в виварии 20-22°С, влажность не более 50%, объем воздухообмена (вытяжка/приток) 8:10, световой режим (день/ночь) 1:1. Кормление животных - дважды в день. Корм - специальные гранулы с минеральными и витаминными добавками и каша из круп. Регламентирующий документ на содержание животных: «Лабораторные животные». - М., 2003. Содержание животных соответствует правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Перитонеальные мышиные макрофаги выделяли из суспензии клеток, полученной при промывке брюшной полости холодным изотоническим раствором хлорида натрия, путем прилипания к пластику. В дальнейшем были использованы только адгезирующие клетки, которые помещали (2,5-3,0×10⁶ клеток/мл) в 96-луночные плоскодонные планшеты в культуральной среде и культивировали в атмосфере 5% СО² и абсолютной влажности. В качестве активатора макрофагов использовали липополисахарид (ЛПС, серотип О111-В4, «Sigma») в концентрации 1 мкг/мл. Исследуемые соединения вносили в диапазоне концентраций от 0,1 мкг/мл до 50 мкг/мл. Через 48 ч от начала культивирования из лунок был собран надосадок для определения продукции оксида азота, а в клетках определена активность аргиназы.

Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J., Skipper P.L., Wishnok J.S., Tannembaum S.R. // Anal. Biochem. 1982, v.126, p.131-143]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием спектрофотометра при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Активность аргиназы определяли по модифицированной методике [Munder M., Eichmann К., Modolell M. // J. Immunol. 1998, v.160, p.5347-5354]. Для этого прилипшие к пластику клетки помещали в 96-луночные плоскододонные планшеты, культивировали в указанных выше условиях, через 24 и 48 ч от начала культивирования удаляли надосадок из лунок, клетки лизировали 0,1 мл 0,1% раствором тритона Х-100, инкубировали при постоянном встряхивании 10 мин при комнатной температуре. Затем для активации аргиназы в лунки вносили 0,1 мл 25 мМ раствора Трис-НСl и 0,05 мл 10 мМ раствора хлорида марганца и инкубировали при 56°С 10 мин. После этого к 0,05 мл лизата добавляли 0,05 мл 0,5 М раствора L-аргинина («Sigma», США) с рН 9,7, инкубировали при 37°С 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,4 мл смеси концентрированных кислот (серной и фосфорной) с водой (в соотношении 1/3/7 по объему). Концентрацию мочевины в полученном растворе определяли с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному протоколу с использованием спектрофотометра (540 нм). За 1 единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение 6-гидрокси-N′-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбогидразида(1).

К раствору 0.06 г (0.23 ммоль) соединения (9) и 0.06 г (0.42 ммоль) EDC в 5 мл абсолютного CH₂Cl₂ при перемешивании прибавили 0.10 г (0.21 ммоль) свежеприготовленного хлорангидрида бетулоновой кислоты (7). Реакционную массу кипятили 12 ч (контроль ТСХ в системе СНСl₃-МеОН, 20:1), после охлаждения разбавили 5 мл СН₂Сl₂, промыли водой (10 мл), сушили MgSO₄ и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (SiO₂, элюент-СНСl₃). Выход 0.09 г (65%), аморфный порошок, [α]_D ²⁰+12.70°(c 0.45, СНСl₃). ИК-спектр, ν, см^-1: 1740 (CONH), 1700 (C=O), 3390 (CONH). УФ-спектр, λ_макс, нм (ε): 293 (2920). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 0.92, 0.96, 0.98, 1.02, 1.07 все с (по 3Н, Н^23′, Н^24′, Н^25′, Н^26′, Н^27′), 1.17-2.50 м (29Н, CH₂, СН в остатке бетулоновой кислоты, 2-Ме и Н³ в остатке хроманола), 1.68 с (3Н, Н^30′), 2.11, 2.19, 2.23 все с (по 3Н, Ме-Ar), 2.64 м (3Н, Н⁴, Н^13′), 3.06 м (1Н, Н^19′), 4.61 и 4.74 оба с (по 1Н, Н^29′), 7.91 и 8.60 оба д (по 0.5Н, CONH, J 4.8 Гц, J 5.6 Гц), 8.00 и 8.72 оба д (по 0.5Н, CONH, J 4.8 Гц, J 5.2 Гц). Спектр ЯМР ¹³С, δ, м.д.: 11.34, 12.20, 12.28 (Me-Ar), 14.56 (С^27′), 15.73 (С^25′), 15.94 (С^26′), 19.47 (С^6′), 19.62 (С^30′), 20.19 (С⁴), 21.01 (С^11′), 21.35 (С^24′), 23.70 (Ме-С²), 25.55 (С^12′), 26.61 (С^23′), 29.45 (С^15′), 29.60 (С³), 30.73 (С^21′), 33.11 (С^16′), 33.60 (С^7′), 34.13 (С^2′), 36.91 (С^10′), 37.76 (С^22′), 38.06 (С^13′), 39.62 (С^1′), 40.67 (С^8′), 42.44 (С^14′), 46.49 (С^19′), 47.33 (С^4′), 49.94 (С^18′), 50.22 (С^9′), 54.99 (С^5′), 55.29 (С^17′), 77.96 и 78.11 (С²), 109.62 (С^29′), 117.56 (С⁵), 118.87, 121.61, 122.34 (С^4a, С⁷, С⁸), 143.99 (С^8a), 145.81 (С⁶), 150.45 (С^20′), 171.59 и 172.02 (С⁹), 173.90 и 174.11 (С^28′), 218.25 (С^3′). Найдено, %: С 75.47; Н 9.18; N 4.07. C₄₄H₆₄N₂O₅. Вычислено, %: С 75.39; Н 9.20; N 4.00.

Пример 2. Получение 6-гидрокси-N′-[3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбогидразида (2).

К раствору 0.09 г (0.35 ммоль) соединения (9) и 0.10 г (0.64 ммоль) EDC в 6 мл абсолютного CH₂Cl₂ при перемешивании прибавили 0.15 г (0.32 ммоль) свежеприготовленного хлорангидрида бетулиновой кислоты (8). Реакционную массу кипятили 12 ч (контроль ТСХ в системе СНСl₃-МеОН, 20:1), после охлаждения разбавили 6 мл CH₂Cl₂, промыли водой (10 мл), сушили MgSO₄ и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (SiO₂, элюент-СНСl₃). Выход 0.14 г (65%), аморфный порошок, [α]_D ²⁰+5.26°(c 0.76, СНСl₃). ИК-спектр, ν, см^-1: 1740 (CONH), 3390 (CONH). УФ-спектр, λ_макс, нм (ε): 294 (2462). Спектр ЯМР ¹H, δ, м.д.: 0.75, 0.85, 0.89, 0.93, 0.96 все с (по 3Н, Н^23′, H^24′, Н^25′, Н^26′, Н^27′), 1.18-2.50 м (29Н, СН₂, СН в остатке бетулиновой кислоты, 2-Ме и Н³ в остатке хроманола), 1.68 с (3Н, Н^30′), 2.11, 2.18, 2.22 все с (по 3Н, Me-Ar), 2.63 м (3Н, Н⁴, Н^13′), 3.06 м (1Н, Н^19′), 3.17 дд (1Н, Н^3′, J 8.8 Гц, J 4.5 Гц), 4.60 и 4.74 оба с (по 1Н, Н^29′), 7.94 и 8.63 оба д (по 0.5Н, CONH, J 5.2 Гц), 8.00 и 8.73 оба д (по 0.5Н, CONH, J 5.6 Гц). Спектр ЯМР ¹³С, δ, м.д.: 11.36, 12.20, 12.30 (Me-Ar), 14.65 (С^27′), 15.37 (С^24′), 15.92 (С^25′), 16.13 (С^26′), 18.28 (С^6′), 19.44 (С^30′), 20.19 (С⁴), 20.83 (С^11′), 24.02 (Ме-С²), 25.56 (С^12′), 27.37 (С^2′), 27.98 (С^23′), 29.48 (С³), 29.69 (С^21′), 30.76 (С^15′), 33.11 (С^16′), 34.32 (С^7′), 37.19 (С^10′), 37.70 (С^22′), 38.11 (С^13′), 38.72 (С^4′), 38.85 (С^1′), 40.73 (С^8′), 42.39 (С^14′), 46.64 (С^18′), 50.35 (С^19′), 50.59 (С^9′), 55.25 (С^5′), 55.37 (С^17′), 77.95 и 78.08 (С²), 79.99 (С^3′); 109.55 (С^29′), 117.54 (С⁵), 118.94, 121.68, 122.33 (С^4a, С⁷, С⁸), 143.92 (С^8a), 145.82 (С⁶), 150.51 (С^20′), 171.54 и 171.89 (С⁹), 173.91 и 174.06 (С^28′). Найдено, %: С 74.98; Н 9.87; N 4.01. C₄₄H₆₆N₂O₅. Вычислено, %: С 75.17; Н 9.46; N 3.98.

Пример 3. Получение 6-гидрокси-N′-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбогидразида (1) в присутствии 1.2 ммоль EDC.

К раствору 0.06 г (0.23 ммоль) соединения (9) и 0.04 г (0.25 ммоль) EDC в 5 мл абсолютного CH₂Cl₂ при перемешивании прибавили 0.10 г (0.21 ммоль) свежеприготовленного хлорангидрида бетулоновой кислоты (7). Реакционную массу кипятили 12 ч (контроль ТСХ в системе СНСl₃-МеОН, 20:1). Обработку и выделение продукта 1 проводили, как описано в примере 1. Выход 0.05 г (36%).

Пример 4. Получение 6-гидрокси-N′-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2H-хромен-2-карбогидразида (1) при комнатной температуре.

К раствору 0.06 г (0.23 ммоль) соединения (9) и 0.06 г (0.42 ммоль) EDC в 5 мл абсолютного CH₂Cl₂ при перемешивании прибавили 0.10 г (0.21 ммоль) свежеприготовленного хлорангидрида бетулоновой кислоты (7). Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 12 ч (контроль ТСХ в системе СНСl₃-МеОН, 20:1), после разбавили 5 мл CH₂Cl₂, промыли водой (10 мл), сушили MgSO₄ и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (SiO₂, элюент-СНСl₃). Выход 0.03 г (21%).

Пример 5. Влияние соединений 1, 2 и 4 на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами.

Результаты, полученные при изучении влияния исследуемых веществ на продукцию оксида азота ЛПС-стимулированными макрофагами, представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, бетулиновая кислота (4) дозозависимо снижала продукцию оксида азота в диапазоне концентраций с 0,1 по 50 мкг/мл. Гибридные молекулы 1 и 2 дозозависимо снижали продукцию оксида азота в концентрациях 10, 25 и 50 мкг/мл.

Таблица 1 Влияние соединений 1, 2 и 4 на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами Наличие ЛПС Конц. веществ (мкг/мл) Продукция оксида азота (конц. нитритов мкг/мл) в присутствии: 1 2 4 - - 7,46±1,84 + (контроль) - 47,76±1,03^a + 0,01 46,58±1,01 47,34±1,65 45,83±0,32 + 0,1 45,03±1,40 47,69±0,71 44,76±0,28* + 1 47,65±0,83 47,76±0,41 41,24±0,90* + 10 44,07±1,68 42,83±1,42* 29,21±1,19* + 25 40,62±2,07* 34,38±1,06* 5,91±0,51* + 50 19,77±1,15* 13,08±1,33* 1,36±0,80* Примечание:^а- различия с культурой без ЛПС, р<0,05.
* - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Пример 6. Влияние соединений 1, 2 и 4 на активность аргиназы.

При изучении влияния соединений 1, 2 и 4 на активность аргиназы (табл.2) было выявлено, что бетулиновая кислота (4) в концентрациях 10, 25 и 50 мкг/мл снижала активность аргиназы. Гибридная молекула 1 снижала активность аргиназы в высокой концентрации (50 мкг/мл), а соединение 2 практически не влияло на активность аргиназы.

Таблица 2 Влияние соединений 1, 2 и 4 на активность аргиназы Наличие ЛПС Конц. веществ (мкг/мл) Активность аргиназы (единицы активности) в присутствии: 1 2 4 - - 29,7±1,2 + (контроль) - 31,2±1,6 + 1 32,1±1,6 31,8±2,7 32,0±1,0 + 10 30,2±1,0 31,3±0,7 21,7±1,2* + 25 27,9±1,2 31,3±1,1 2,4±0,8* + 50 13,5±0,7* 29,5±0,7 0,3±0,3* Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что бетулиновая кислота (4) подавляет как продукцию оксида азота (признак M1), так и активность аргиназы (признак М2). Гибридные молекулы 1 и 2 в отличие от бетулиновой кислоты обладают селективным действием на макрофаги (т.к. подавляют продукцию оксида азота, не влияя на активность аргиназы, за исключением 1, который в самой высокой концентрации ингибировал ее активность), что может свидетельствовать о наличии у них противовоспалительных свойств, и способностью подавлять Тh1 тип иммунного ответа.

Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины, а именно к новым биологически активным производным тритерпеноидов лупанового ряда (бетулин, бетулиновая, бетулоновая кислоты), конкретно 6-гидрокси-N'-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2Н-хромен-2-карбогидразиду (1) и 6-гидрокси-N'-[3β-гидроксилуп-20(29)-ен-28-оил]-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2Н-хромен-2-карбогидразиду (2), проявившим противовоспалительную активность. Соединения 1 и 2 представляют собой гибридные молекулы, комбинированные из фрагментов бетулоновой (3) или бетулиновой кислоты (4) и 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2Н-хромен-2-карбоновой кислоты (кислота «Тролокс») (5), связанные гидразидным мостиком. Соединения получают путем проведения реакции кислоты «Тролокс» с моногидратом гидразина в абсолютном тетрагидрофуране в присутствии CDI и вовлечении гидразидного производного (9) в конденсацию с хлорангидридами бетулоновой и бетулиновой кислот (7) и (8), полученными непосредственно перед реакцией, действием на кислоты (7) и (8) оксалилхлорида. Реакцию конденсации проводят в абсолютном CH₂Cl₂ при кипячении в течение 12 ч с использованием в качестве конденсирующего агента N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) (предпочтительно 2-кратный мольный избыток) при мольном соотношении гидразида 9 и хлорангидрида 7 или 8-1.1:1.0. Продукты реакции 1 или 2 выделяют колоночной хроматографией на силикагеле. Выход гибридных соединений составляет 65%. Проведенные in vitro испытания гибридных молекул 1, 2 и бетулиновой кислоты (4) по их влиянию на продукцию оксида азота и активность макрофагальной аргиназы в макрофагах, активированных липополисахаридами (ЛПС), показали, что бетулиновая кислота подавляла как продукцию оксида азота (признак M1), так и активность аргиназы (признак М2). Гибридные молекулы 1 и 2 в отличие от бетулиновой кислоты обладали селективным действием на макрофаги (позволяли получать макрофаги с фенотипом М2 с сохранением продукции таких противовоспалительных цитокинов, как ИЛ-10 и TGF-B). Кроме того, соединения 1 и 2 проявили иммунорегулирующую активность, поскольку подавляли Тh1 тип иммунного ответа. Применение таких соединений эффективно при различных аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, диабет I типа). 3 н.п. ф-лы, 6 пр., 2 табл.

1. Биоконъюгаты тритерпеновых кислот лупанового ряда с гидразидом 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-3,4-дигидро-2Н-хромен-2-карбоновой кислоты (кислота «Тролокс») формулы 1 и 2:

2. Способ получения биоконъюгатов тритерпеновых кислот лупанового ряда с кислотой «Тролокс», отличающийся тем, что гидразидное производное кислоты (гидразид), полученное взаимодействием кислоты «Тролокс» с моногидратом гидразина в абсолютном ТГФ в присутствии N,N'-карбонилдиимидазола (CDI), вовлекают в конденсацию с хлорангидридами бетулоновой или бетулиновой кислоты, полученными непосредственно перед реакцией действием оксалилхлорида, конденсацию проводят в абсолютном CH₂Cl₂ с использованием конденсирующего агента N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) при мольном соотношении гидразид:хлорангидрид кислоты:EDC (1,1:1,0:1,2-2,0), при комнатной температуре (~20°С) или кипячении в течение 7-12 ч.

3. Применение биоконъюгатов тритерпеновых кислот лупанового ряда с кислотой «Тролокс» в качестве иммунотропных и противовоспалительных веществ.