Штамм Streptococcus pneumoniae серотип 19F Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Выделенные штаммы Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2 серотип 19F, 158 1-J-1 серотип 19F, 438 2-J-8 серотип 19F, используются для получения полисахаридного антигена, который играет основную роль в вирулентности штамма. На основании этого полисахаридного антигена возможно производство вакцинных и иммунобиологических препаратов.

Описание уровня техники

Streptococcus pneumoniae (стрептококки пневмонийные) представляет собой бактериальную культуру, являющуюся возбудителем группы инфекционных заболеваний человека. Тяжелыми формами развития пневмококковой инфекции являются пневмония, менингит и сепсис. Частота развития тяжелых форм достаточно высока. Среди населения наиболее часто пневмококковой инфекцией болеют дети от шести месяцев до шести лет, смертность составляет около 5%. Streptococcus pneumoniae является вторым (после Haemophilus influenzae) по распространенности и важности пневмотропным микроорганизмом в микробном спектре при хронических бронхолегочных заболеваниях у детей в периоде обострения.

Для снижения заболеваемости рекомендованы вакцины на основе пневмококкового антигена. Как правило, в таких вакцинах в качестве антигена используется капсульный полисахарид штаммов пневмококка. В зависимости от химического строения капсульного полисахарида пневмококки подразделяют на серологические типы, кроме того, химический состав капсулы определяет вирулентность и патогенность микроорганизма. Вирулентность колеблется в пределах серологических типов из-за генетического разнообразия. В настоящее время известно более 90 серотипов, из них идентифицированы следующие серогруппы/серотипы пневмококка, которые могут входит в состав вакцины: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17, 18C, 19F, 19F, 20, 22F, 23F, 33F. В состав вакцины, как правило, входят капсулярные полисахариды, полученные от разных серотипов диких или рекомбинантных штаммов пневмококка. Дикие типы выделяют из природных источников или доступных источников (например, смывы со слизистых ротоглотки/носоглотки пациентов). Для повышения выходов полисахарида, снижения примесей или повышения вирулентности штаммы Streptococcus pneumoniae модифицируют рекомбинантными методами.

Так, известно несколько штаммов Streptococcus pneumoniae. Например, в патенте RU 2601158 (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, дата подачи 12.05.2012) раскрыты штаммы Streptococcus pneumoniae серотипов 6В, 10 А и 19F. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296, 297 и 298, соответственно. Штаммы предназначены для получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью. При этом не изучалась продуктивность штаммов в отношении полисахаридов, и штаммы позволяют получать белковые фракции пневмококка. Однако, для конструирования полисахаридной конъюгированной вакцины необходимы штаммы, синтезирующие достаточное количество полисахаридов. Штамм S. pneumoniae серотипа 6В выделен от больного в г. Москве в 2005 г. в ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России под регистрационным номером 296.

Таким образом, необходимо получение штаммов Streptococcus pneumoniae различных серотипов с повышенной продуктивностью капсулярного сахарида для производства антигена для вакцины, при этом желательно, чтобы данный штамм культивировался на твердых и жидких питательных средах, с высоким выходом капсульного полисахарида. Также при работе со штаммом необходимо, чтобы получаемый штамм при получении посевной культуры можно было хранить в лиофилизированном виде без потери его технологических свойств.

Описание изобретения

Согласно изобретению, предложены бактериальные штаммы Streptococcus pneumoniae серотип 19F. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В-9847, 9848 и 9850 и предназначены для получения полисахарида, используемого в качестве антигена.

Данные штаммы могут быть использованы или храниться в форме биологически чистой культуры, в форме жизнеспособных клеток или в форме лиофилизата. Данные штаммы были выделены из смыва или мазка с носоглотки или горла.

Описание фигур

Фиг. 1. Идентификационная таблица тест-системы STREPTOtest 24.

Подробное описание изобретения

Согласно изобретению, предложены бактериальные штаммы Streptococcus pneumoniae серотип 19F. Данные штаммы могут быть использованы или храниться в форме биологически чистой культуры, в форме жизнеспособных клеток или в форме лиофилизата. Кроме того, данные штаммы были выделены из смыва или мазка с носоглотки или горла, в частности, от больного ребенка ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней», ФМБА России, г. Санкт-Петербург.

Штаммы депонированы в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В- 9847, 9848, и 9850 и предназначены для получения полисахарида, используемого в качестве антигена, дата депонирования 28.03.2022 г. Данные штаммы являются высокоактивным продуцентом капсульного полисахарида пневмококка, используемый в качестве промышленного при изготовлении вакцин.

Примеры

Пример 1

Получение и выделение Streptococcus pneumoniae серотип 19F

Штамм был выделен из смыва с носоглотки инфицированного пациента, в стационаре ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней», ФМБА России, г. Санкт-Петербург.

Все микробиологические работы проводили в соответствии с требованиями санитарных правил СП 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Культуры Streptococcus pneumoniae выращивали в CO₂-инкубаторе (5% CO₂) при 37°C в течение двух суток на плотных питательных средах: Blood Agar Base с добавлением 5% бараньей крови и №1 ГРМ с добавлением 5% сыворотки крови крупного рогатого скота. Рост наблюдался слабый. Колонии культур 144 1-I-2 серотип 19F, 158 1-J-1 серотип 19F, 438 2-J-8 серотип 19F (по отдельности) - мелкие (1-2 мм в диаметре), округлые, блестящие, полупрозрачные с ровным краем, мягкой консистенции. Среди мелких (1-2 мм в диаметре), округлых, блестящих, полупрозрачных с ровным краем, мягкой консистенции колоний культуры серотипа 19F встречались еще очень мелкие (крошечные) колонии (от 0,2 до 1 мм в диаметре) округлые, блестящие и полупрозрачные.

Пример 2

Идентификация выделенного штамма

Выросшие на плотной питательной среде колонии были исследованы с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF Biotyper (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Для этого проводили экстракцию белков последовательной обработкой микробной взвеси этиловым спиртом, муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. В качестве вещества, обеспечивающего процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения, использовали MALDI-матрицу (насыщенный водный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, содержащий 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Анализ проводили в автоматическом режиме. Результат идентификации представлен в таблице 1.

Таблица 1 - Идентификация с использованием системы MALDI Biotyper Название штамма Идентификация Показатель подобия степень достоверности 144 1-I-2 серотип 19F Streptococcus pneumoniae 1,746 + 158 1-J-1 серотип 3 Streptococcus pneumoniae 1,595 -⁴ 438 2-J-8 серотип 19F Streptococcus pneumoniae 2,415 +++ ¹+++ высокая достоверность идентификации вида;
²++ достоверная идентификация рода, вероятная идентификация вида;
³+ вероятная идентификация рода;
⁴- ненадежная идентификация.

Культура Streptococcus pneumoniae 438 2-j-8 идентифицирована как streptococcus pneumoniae с высокой достоверностью идентификации видов.

Культура Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2 - предположительная идентификация до рода Streptococcus. Для одной культуры Streptococcus pneumoniae 158 1-J-1 не получен результат надежной степени достоверности.

Далее, изучение культур проводили с помощью тест-системы STREPTOtest 24 (Erba LaChema s.r.o., Karasek, Brno, CZ) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты биохимических тестов культур Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2 и Streptococcus pneumoniae 438 2-J-8 оказались идентичными, также, как и у культуры Streptococcus pneumoniae 158 1-J-1. Различие между этими двумя группами состояло в разной реакции на α-галактозидазу. Полученные результаты биохимических тестов представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 - Результаты идентификации культуры Streptococcus pneumoniae 158 1-J-1 Условное обозначение ТЕСТ Реакция NAG Ацетилглюкозаминидаза + LAP Лейцинаминопептидаза + bMN β-маннозидаза - GLR β-глюкуронидаза - bGL β-глюкуронидаза - bGA β-галактозидаза + aGA α-галактозидаза - PHS Фосфатаза - ESL Эскулин - INU Инулин + MAN Маннитол - SOR Сорбитол - MLB Мелибиоза - RIB Рибоза - LAC Лактоза + PUL Пуллулан + ARG Аргининдигидролаза - NCL Рост с 6,5% NaCl - aMG α-метилглюкозидаза - TGT Тагатоза - MLT Мальтоза + RAF Раффиноза + TRE Трегалоза + SOE Сорбоза -

Таблица 3 - Результаты идентификации культуры Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2, Streptococcus pneumoniae 438 2-J-8 Условное обозначение ТЕСТ Реакция NAG Ацетилглюкозаминидаза + LAP Лейцинаминопептидаза + bMN β-маннозидаза - GLR β-глюкуронидаза - bGL β-глюкуронидаза - bGA β-галактозидаза + aGA α-галактозидаза - PHS Фосфатаза - ESL Эскулин - INU Инулин + MAN Маннитол - SOR Сорбитол - MLB Мелибиоза - RIB Рибоза - LAC Лактоза + PUL Пуллулан + ARG Аргининдигидролаза - NCL Рост с 6,5% NaCl - aMG α-метилглюкозидаза - TGT Тагатоза - MLT Мальтоза + RAF Раффиноза + TRE Трегалоза + SOE Сорбоза -

Биохимические свойства культур Streptococcus pneumoniae 158 1-J-1, Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2, Streptococcus pneumoniae 438 2-J-8, соответствуют идентификационной таблице Streptococcus pneumoniae для тест-системы STREPTOtest 24 (Фиг. 1).

Выделение тотальной ДНК из бактериальной культуры

Для выделения ДНК 2-3 петли бактериальной культуры переносили в микроцентрифужную пробирку «Eppendorf» с 400 мкл буферного раствора 1×ТЕ (10 mM Tris, pH 8,0 и 1 mM EDTA). Затем в пробирку добавляли 50 мкл лизоцима (10мг/мл) и инкубировали в течение двух часов при 37°C. К полученной суспензии добавляли 75 мкл раствора SDS/протеиназа К (70 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы К), 100 мкл 5M NaCl и 100 мкл раствора CTAB/NaCl (4,1 г NaCl, 10 г CTAB, 80 мл дистиллированной воды). Полученную смесь трясли до молочно-белой консистенции и инкубировали в течение 10 минут при 65°C. После инкубации в пробирку добавляли 750 мкл хлороформ/изоамиловый спирта (24:1), трясли 10 секунд и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут. Затем надосадочную жидкость, содержащую ДНК, отбирали в новую пробирку, добавляли 450 мкл изопропилового спирта и инкубировали в течение 10 минут на льду. Далее пробирку центрифугировали 15 минут при комнатной температуре при 14000 об/мин и супернатант удаляли при помощи автоматической пипетки. Далее к осадку добавляли 1 мл 70% перегнанного этанола и центрифугировали в течение 15 минут при +4°C при 12000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок высушивали при комнатной температуре и растворяли в 20 мкл дистиллированной воды.

Эту процедуру проводили для каждого из исследуемых штаммов.

Полногеномное секвенирование

Полногеномное секвенирование Streptococcus pneumoniae осуществлено на платформе MGI (MGI Tech Co., Ltd), Lt, с использованием наборов MGIEasy FS DNA Library Prep Kit и MGI-Seq 2000RS High-throughput sequencing kit PE150, согласно рекомендациям производителя. В результате сформировано три архива сырых ридов.

Также был проведен биоинформационный анализ (метагеномный анализ).

Для обработки данных полногеномного секвенирования образцов использовали программное обеспечение для анализа метагеномных образцов: Kraken Metagenomics version 2. Полученные результаты подтвердили видовую идентификацию 3 культур Streptococcus pneumoniae: Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2, 158 1-J-1, 438 2-J-8. Общая длина полученных контигов (пар нуклеотидов - п.н.) и GC состав образцов соответствуют значениям размеров геномов и GC составу референсных штаммов Streptococcus pneumoniae, находящихся в базе данных NCBI Genome.

Таблица 4 - Данные полногеномного секвенирования штаммов Streptococcus sp. Название штамма 144 1-I-2 158 1-J-1 438 2-J-8 Кол-во ридов 38184245 34096991 40412535 Кол-во нуклео-тидов 5680020062 5080935566 6030710167 Кол-во контигов 89 124 111 Общая длина 2079934 2121464 2032598 Размер наибольшего контига 140652 192564 152961 GC % 39.69 39.39 39.69 Покрытие 2730,9 2395,0 2967,0 Идентификация с помощью Kraken2 91% Streptococcus pneumoniae 92% Streptococcus pneumoniae 92% Streptococcus pneumoniae

Таким образом, данные штаммы можно достоверного отнести к Streptococcus pneumoniae, серотип 19F.

Пример 3

Лиофильное высушивание

Лиофилизацию культуры Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2, 158 1-J-1, 438 2-J-8, серотипы 19F осуществляли с помощью лиофильной сушки EPSILON 1-4 LSC, Германия. В качестве защитной среды использовали сахарозо-желатиновую среду (10% сахароза, 1,5% желатин). С целью проведения контроля жизнеспособности после лиофилизации один флакон с высушенной культурой вскрывали, добавляли 0,5 мл физиологического раствора, готовили серию десятикратных разведений и высевали на чашки Петри со средой Blood Agar Base с добавлением 5% бараньей крови. После инкубации 48 часов, подсчитывали выросшие колонии. Концентрация бактериальных клеток во флаконе составляет не менее 10⁶ кл/мл.

Пример 4

Получение капсульного полисахарида

Штаммы клеток Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2, 158 1-J-1, 438 2-J-8, серотипы 19F (по отдельности) культивировали в жидкой среде, содержащей соевый пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу моногидрат, аминокислоты, хлорид холина, соли металлов. Полученный Рабочий посевной материал путем двух пассажей в колбах в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С, 5% СО₂, засевали в лабораторный ферментер (BIOSTAT® A MO UniVessel® Glass 2L, Sartorius), содержащий жидкую питательную среду. Культивирование проводили при температуре (37±2)°C; рН - (7,2±0,2); скорость перемешивания - (70-100)±10 об/мин; автоматический режим поддержания параметров до достижения стационарной фазы роста культуры (от 4 до 14 ч). Далее полученную культуру инактивировали добавлением формалина до концентрации 0,20-0,25% в промежуточном продукте при температуре (25±1)°С в течение (4±0,5) ч. Далее инактивированную культуру подвергали лизису добавлением раствора дезоксихолата натрия до концентрации 0,13% в промежуточном продукте при температуре (37±2)°С в течение 2 ч.

Далее в полученной лизированной культуре определяли выход полисахарида измерением содержания метилпентоз.

Для этого предварительно отделяли клетки культуры центрифугированием при 8900±500 g, в течение 60 мин. Супернатант сливали и готовили разбавление испытуемого образца в воде очищенной таким образом, чтобы концентрация метилпентоз составила от 5 до 80 мкг/мл. Содержание метилпентоз в испытуемых образцах определяли путем сравнения разницы оптических плотностей, полученных при построении калибровочного графика с известной концентрацией рамнозы (метилпентозы) с разницей оптических плотностей при 396 нм и 430 нм.

В качестве стандартного раствора использовали растворы L-рамнозы (концентрация 5; 10; 20; 40; 80 мкг/мл) для построения калибровочной кривой.

В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную. Пробирки со стандартными растворами, испытуемыми образцами и раствором сравнения инкубировали на водяной бане. В каждую пробирку со стандартными растворами, испытуемыми образцами и раствором сравнения по каплям с постоянным перемешиванием добавляли по 2,25 мл 15,7 М раствора серной кислоты. После перемешивания и достижения комнатной температуры, пробирки помещали на водяную баню при температуре 90°С в течение 7 минут. В каждую пробирку добавляли 50 мкл 0,2 М раствора L-цистеина гидрохлорида и перемешивали. Пробирки выдерживали в темной камере при комнатной температуре в течение 2 часов. Оценивали окрашивание растворов в пробирках: должно наблюдаться желто-зеленое окрашивание различной интенсивности в зависимости от концентрации метилпентоз. Измеряли оптическую плотность каждого раствора при двух длинах волн. Содержание метилпентоз (продуктивность штамма клеток Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2, 158 1-J-1, 438 2-J-8, серотипы 19F) составило не менее 150 мкг/мл, но в среднем (при нескольких культивированиях) продуктивность составляла 300-500 мкг/мл.

На всех технологических этапах подлинность полисахарида подтверждали методом латексной агглютинации при помощи набора Wellcogen™ Streptococcus pneumoniae Rapid Latex Agglutination Test, Wellcogen S. pneumoniae Kit (Thermo Scientific™).

Полученные штаммы были депонированы в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В- 9847 (144 1-I-2), под № В-9848 (158 1-J-1), и под № В-9850 (438 2-J-8).

Изобретение относится к области биотехнологии. Выделенные штаммы Streptococcus pneumoniae 144 1-I-2 серотип 19F, 158 1-J-1 серотип 19F, 438 2-J-8 серотип 19F используются для получения полисахаридного антигена, который играет основную роль в вирулентности штамма. На основании этого полисахаридного антигена возможно производство вакцинных и иммунобиологических препаратов. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под номерами № В-9847, В-9848, В-9850 и предназначены для получения полисахарида, используемого в качестве антигена. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.

1. Бактериальный штамм Streptococcus pneumoniae серотип 19F, депонированный в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В-9847, предназначенный для получения полисахарида, используемого в качестве антигена.

2. Бактериальный штамм Streptococcus pneumoniae серотип 19F, депонированный в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В-9848, предназначенный для получения полисахарида, используемого в качестве антигена.

3. Бактериальный штамм Streptococcus pneumoniae серотип 19F, депонированный в Государственную коллекцию патогенных организмов и клеточных культур «ГПКМ-Оболенск» под № В-9850, предназначенный для получения полисахарида, используемого в качестве антигена.

4. Штамм Streptococcus pneumoniae по пп. 1-3, который находится в форме биологически чистой культуры.

5. Штамм Streptococcus pneumoniae по пп. 1-3 в форме жизнеспособных клеток.

6. Штамм Streptococcus pneumoniae по пп. 1-3, который находится в форме лиофилизата.