Штамм бактерий NeISSeRIa меNINGIтIDIS серогруппы В - продуцент капсульного полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса Советский патент 1992 года по МПК C12N15/01 C12P19/04 

ча), активно продуцирующего В-полисахарид.

Штамм получен путем селекции из музейного штамма N.menlngitldis ВС-5, хранящегося также в коллекции ГИСК им, Л.А.Тарасевича.

Для этого из отдельно выросших на чашках Петри с 20%-ным сывороточным агаром Хоттингера колоний отбирали колонии в S-форме. При изучении их в косопроводящем свете и с использованием бинокулярной лупы колонии должны быть яркие радужные с переходом цвета от оранжевого в зелено-голубой с узким оранжевым или зеленым наружным краем.

8 том случае, когда колонии отвечают описанным требованиям, проводят второй пассаж. Для этого типичные колонии в Sформе (по одной) пересевают в пробирки со скошенным сывороточным агаром Хоттиненгера и инкубируют при +37°С в течение 18-20 ч. Проверяют чистоту и морфологию выросших культур в мазках, окрашенных по Грамму в модификации Калины, а также путем посева культур в среды Гисса, серологические свойства - в реакции агглютинации на стекле с гомологичными и гетерологичнымн агглютинирующими менингококковыми сыворотками.

Отобранный штамм, типичный по всем показателям, смывают с косяка сахарозо-желатиновой средой и лиофильно высушивают. Штамм хранят в лиофильновысушенном со.стоянии с сахарозо-желатиноаым стабилизатором в ампулах в холодильнике при +4-6°С.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культура л ьно-морфологические признаки. Мелкие грамотрицательные парные или одиночные кокки одинакового размера. При изучении под электронным микроскопом отмечены закономерные изменения ультраструктуры клеток в процессе периодического культивирования в ферментере. В экспоненциальной фазе клетки имеют сохранную ультраструктуру, в том числе полисахаридную микрокапсулу, представляющую соб.ой мелковетвистый гранулярный компонент, определяемый ультрацитохимической реакцией с рутениевым красным, В фазе максимальной концентрации появляются лизированные особи, Q большинстве клеток происходят деструктивные изменения.

При визуальном изучении выросших колон лй на плотной среде (1,5% агара Хоттингера с 20% сыворотки крупного рогатого

скота; рост в атмосфере С02 в термостате

при 37°С) и при использовании бинокулярной лупы в естественном освещении колонии в S-форме не более 2 мм в диаметре, прозрачные с голубоватым оттенком, ровными краями и голубоватой поверхностью. При изучении колоний в косопроходящем свете (угол наклона светового луча 30) с использованием бинокулярной лупы колонии обладают ярко-оранжевым свечением. Рост штамма возможен на следующих 0 питательных средах: А. Среда Козн-Веллер в модицикации Э.К.Фаньковской, г/л: Кислотный гидролизат казеина18-22

Крахмал растворимый0,5-1,0

5 Однозамещенный

фосфат калия0,3-0,6

Хлорид магния0,2-0,5

Сульфат меди0,0005-0,002

Глутаминовая кислота0,5-1,0

0 Цистеин.0,02-0,05

Диализат дрожжей80-100 мл

рН среды6,6-6,8

Б. Синтетическая среда,г/л: Хлорид калия0,08-0,010

5 Хлорид натрия5-7

Хлорид аммония1,24-1,26

Водный сульфат

магния0,05-0,07

Двузамещенный

0 фосфат.натрия 2,3-2,7

Цитрат натрия0,4-0,6

L-Моноглутамат натрия1,2-1,4

L-цистеин гидрохлорид0,02-0,04 6 Сульфат железа0,001 рН среды 7,2-7,4 устанавливают с помощью 1N HCI. Непосредственно перед употреблением добавляют 40%-ный раствор глюкозы из расчета 1,5-1,6 г/л среды. 0 Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: при выращивании на среде Гисса с глюкозой или лактозой, или маннитом, или сахарозой или мальтозой сбраживает только глюкоза и 5 мальтоза с образованием кислоты без газа. Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот.

Генетической особенностью штамма является его ауксотрофность по цистеину. 0 Не нуждается в витаминах.

Оптимальная температура роста 3637°С, Рост возможен при рН среды от 6,2 до 7,2, оптимум 7,0.

Аэроб, оптимальный для роста является 5 концентрация растворенного в среде кислорода 5-20%.

Штамм синтезирует группоспецифический В-полисахарид и большой набор белков с различной молекулярной массой, среди которых преобладает белок с молекулярной массой 41 кд, относящийся ксеротипу 2, является продуцентом полисахаридбелкового комплекса.

При испытании на белых мышах весом 12-14 г по тесту острой токсичности штамм токсичен. LDso составляет 4-13 млрд. клеток.

Групповая специфичность штамма. Штамм дает положительную реакцию агглютинации на стекле (3-4 креста) с менингококковой гомологичной серогруппы В сывороткой и не агглютинируется с сыворотками других серогрупп: А. С, D. X, Y, Z, 29Е, W - 135. На основе культуры менингококка серогруппы В предложенного штамма получают кроличьи иммунные сыворотки, группоспецифический полисахарид.

Антигенную активность культур изучают через груяпоспецифич.ескую активность сывороток. В табл.1 представлены данные реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) титрования сывороток менингококковых серогруппы В, полученных при иммунизации кроликов культурами менингококка предлагаемого штамма, в сравнеНИИ с аналогичными данными на известных Штаммах. Из таблицы видно, что в зтом тесте наблюдается высокая специфичность и активность сывороток. Кроме этого, можно отметить значительную разницу з титрах антител между сыворотками, полученными при иммунизации культурами менингококка предложенного штамма, и сыворотками, полученными к известным штаммам.

Результаты реакции агглютинации на стекле и по Ноблю полученных нами сывороток с 46 штаммами различных серогрупп также свидетельствуют о высокой активности и строгой групповой специфичности.

Из культуры менингококка предложенного штамма известным методом выделяли препараты полисахаридно-белкового комплекса.

В указанных препаратах определяли пептидный состав с помощью злектрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия. При анализе денситограмм указанных комплексов выявлено, что во всех препаратах присутствует основной пептид с молекулярной массой 41 КД.

Результаты изучения молекулярных параметров и антигенной активности В-полисахарида и полисахаридно-белкового комплекса, выделенных из биомассы менингококка предложенного штамма, выращенного в синтетической питательной среде, приведены в табл.2 и 3.

Из табл.2 видно, что полисахарид, выделенный из предложенного штамма, содержит в 1,5 раза больше высокрмолекулярного вещества, чем полисахарид из известного штамма. В-полисахариды из биомассы менингококка серогруппы В предложенного штамма были использованы для получения зритроцитарного диагностикума, который характеризовался высокой специфичностью и активностью. Это еще раз подтверждает, что предлагаемый штамм является продуцентом активного в антигенном отношении группоспецифического В-полисахарида.

Пример. Модифицированную среду Козн-Веллер (см.выше) в обьеме 6 л в ферментере засевают 100 мл инокулята, содержащего 6 X 10 кл/мл. Инокулят получают смыванием с 5 чашек Петри 18-часовой культуры, выросшей на 20%-ном сывороточном агаре Хоттингера.

Культивирование проводят при ,37°С, рН 7,0-7,2 до конца экспоненциальной фазы роста, которую затем поддерживают непрерывно-синхронным способом в течение 72ч.

Последнее осуществляют следующим образом.

Выращивание штамма ведут при постепенном увеличении частоты вращения мешалки от (70 об/мин в начале процесса до 450 об/мин в конце экспоненциальной фазы роста). Растворенный в среде кислород от первоначального насыщения 50-60% снижается к 1-2 ч роста до значений, близких к 10%. В дальнейшем процесс до 5-6 ч роста ведут в данных условиях. К 5-6 ч роста (оптическая плотность (ОД) достигает значений, равных 2±0,2. В этот момент из ферментера сливают половину объема культуры (3 л) и доливают свежую питательную среду до прежнего объема (6 л). После долива питательной среды ОД становится равной 1 ± 0,1. Через 1 ч ОД культуры достигает уровня, существовавшего до первого слива культуры, т.е. 2 ±0,2. Время генерации 1 ч. В дальнейшем такие сливы культуры с последующими доливами свежей питательной среды производят периодически через 1 ч до получения необходимого объема культуры.

В момент долива питательной среды, т.е. в начале каждого цикла уровень растворенного в среде кислорода поднимается до 20% от полного насыщения, затем через 1 ч в момент слива уровень растворенного в среде кислорода падает до 10%.

Для получения 1 г полуочищенндго полисахарида менигококка серогруппы В при

культивировании предложенного штамма в указанных выше условиях необходимо 20 л культуры септической плотностью не менее 2 ± 0,2, которую можно получить за 10 - 12 ч культивирования в ферментере.

Использование предложенного штамма N.menlngltldls позволяет получить наиболее качественную в антигенном отношении биомассу менингококка и в большем количестве в сравнении с биомассой менингококка известного штамма, так как выход наиболее крупных молекул В-полисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в 1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Кроме того, уровень антител к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных, полученных к полисахаридно-белковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза

превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахариднобелковому комплексу штамма известного. Следовательно, процессы получения на основе предлагаемого штамма сывороток, Вполисахарида, необходимого для производства эритроцитарного диагностикума, и иммуноферментных тест-систем, а также В-полисахаридно-белкового комплекса, идущего на приготовление менингококковой В-вакцины, будут в 2-3 раза более экономичными.

Формула изобретения Штамм бактерий Nelsseria menlngltldis

серогруппы В N2 125 (коллекция ГИСК им.

Л.А.Тарасевича) - продуцент капсульного

полисахарида и полисахаридно-белкового

комплекса.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехноло- '"ии и касается получения нового штамма бактерий Neisserla meningitidfs-продуцента капсульного В-полисахарида и полисаха-' ридно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менингокок- ковых препаратов. Целью изобретения яв- лйвтся получение штамма бактерий N.meningitidls серогруппы В № 125 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича), активно продуцирующего В-полисахарид. Выход наиболее крупных молекул В-полисахарида, выделенного из биомассы предлагаемого штамма, в 1,5 раза выше, чем при использовании известных штаммов. Уровень антител к полисахариду менингококка серогруппы В в сыворотках животных, полученных к пол- исахаридно-ббелковому комплексу предлагаемого штамма менингококка, в 3 раза превосходит уровень аналогичных антител в сыворотках, полученных к полисахаридно- белковому комплексу известного штамма. 3 табл.Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Neisserla menlngltldis - продуцента капсульного! В-полисахарида и полиса- харидно-белкового комплекса и может быть использовано в производстве менин- гококковых препаратов.Большинство диких штаммов менингококка серогруппы В продуцирует группос- пецифический капсульный полисахарид (В-полисахарид)-сиаловую кислоту в незначительных количествах, что не позволяет ис- пользовать эти штаммы в качествепродуцентов В-полисахарида и полисаха- ридно-белкового комплекса.Известны штаммы бактерий Neisserla meningltidls серогруппы В - продуценты капсульного полисахарида.Недостатком этих штаммов является небольшой выход В-полисахарида, что выражается в низком уровне антител к В-пол- исахариду у мышей, иммунизированных 10 мкг полисахаридно-белкового антигена внутрибрюшинно.Цель изобретения - получение штамма бактерий Neisserla menlngltidis серогруппы В NS 125 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасеви-XIО 0000Ь. о

Таблица 2

9

Титр антител к В-полисахариду в РПГА в сыворотках крови мышей линии СВА, иммурепарат, Nfe низированных препаратом в дозе 2 мкг на мышь (по сиаловой кислоте)

129 142 143 146 147

1708846

10 Таблица 3

Уровень антител к В-полисахариду в пересчете на мкг иммуноглобулина мл сыворотки

1/320

16 16 16 64 32 1/320 1/320 1/1280 1/640