СПОСОБ РАННЕЙ (ДОНОЗОЛОГИЧЕСКОЙ) ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К АЛЛЕРГЕНАМ ВОЗДУХА РАБОЧЕЙ ЗОНЫ ПТИЦЕВОДЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, аллергологии и профпатологиии, и может быть использовано для ранней диагностики развития сенсибилизации на пух и перо птицы у работников птицеводческой отрасли как у отдельных больных при установлении этиологического диагноза, так и при массовых обследованиях.

В настоящее время, особенно в условиях массовых обследований, сложно получить материал для прямой оценки реакций органов-мишеней с использованием инвазивных методов, поэтому усилия исследователей направлены на разработку и верификацию неинвазивных методов в доступных биологических жидкостях, в том числе слюны.

По данным современной литературы [Артамонова В.Г. Факторы риска и их роль в развитии заболеваний органов дыхания у рабочих современных птицефабрик / В.Г.Артамонова, Э.И.Баянов // Медицина труда и промышленная экология. - 2005. - №4. - С.6-12] специфика ведения технологических процессов в промышленном птицеводстве не исключает неблагоприятного влияния на организм работающих комплекса производственных факторов: пера и пуха птицы, компонентов кормов, формальдегида, хлорамина и др.

Совокупность длительного воздействия неблагоприятных факторов воздуха рабочей зоны, даже на уровне предельно-допустимых концентраций, повышает риск формирования статуса поливалентной сенсибилизации.

Хемилюминесценцией (ХЛ) называется свечение, сопровождающее некоторые биохимические реакции. Это собственное свечение клеток и тканей обусловлено в основном реакциями с участием свободных радикалов, и его измерение используется в научных исследованиях и в целях лабораторного клинического анализа в тех случаях, когда важно обнаружить и изучить появление свободных радикалов в живых системах. Некоторые клетки организма: гранулоциты и моноциты в крови и тканевые макрофаги - в целях борьбы с чужеродными клетками генерируют активные формы кислорода. При этом наблюдается очень слабая хемилюминесценция, которая усиливается в тысячи раз в присутствии люминола. Любое повышение проницаемости клеточных мембран стимулирует формирование защитной функции, т.е. выделение клетками активных форм кислорода.

Традиционно, для установления этиологической роли промышленного аллергена в развитии повышенной чувствительности используются различные реакции in vitro. Наибольшее распространение из них получили различные модификации клеточных диагностических реакций [О.Г.Алексеева, Л.А.Дуева «Аллергия к промышленным химическим соединениям». М., Медицина, 1978]. Это:

РСАЛ - реакция специфической агломерации лейкоцитов. Суть метода основана на специфическом склеивании (агломерации) лейкоцитов при добавлении к крови сенсибилизированного индивидуума in vitro аллергена, вызвавшего сенсибилизацию. Феномен агломерации является первой фазой аллергической реакции клеток.

Тест повреждения нейтрофилов (тест ППН) регистрирует усиление амебоидной подвижности нейтрофилов in vitro под влиянием специфического аллергена, служит для оценки ранней фазы аллергической реакции клеток.

Тест альтерации нейтрофилов, определяемый степенью аллергической дегенерации клетки и ее внутриклеточных органелл, выявляет дальнейшие изменения клеток-мишеней под влиянием аллергена.

Однако данные методы трудоемкие, трудно поддаются объективному анализу. Отсутствует возможность независимой регистрации полученных данных с целью исключения человеческого фактора и соблюдении позиций доказательной медицины.

Прототипом изобретения является способ диагностики специфической сенсибилизации промышленным аллергеном организма рабочих гидролизно-дрожжевого производства, который основан на способности различных концентраций антигена при инкубации с сывороткой образовывать иммунные комплексы различной конфигурации и специфически активировать фагоциты, что сопровождается вспышкой хемилюминисценции. Наличие сенсибилизации организма определяют ходом результирующей кривой зависимости кратности прироста хемилюминесцентного ответа гранулоцитов от концентрации антигена. При снижении кратности прироста хемилюминесцентного ответа гранулоцитов констатируют отсутствие сенсибилизации организма, при снижении концентрации антигена и увеличении кратности прироста хемилюминесцентного ответа гранулоцитов относительно исходного уровня диагностируют сенсибилизацию организма [Заявка: RU 94024336/14, 29.06.1994, опубликовано: 27.02.2000]. Однако данный метод трудоемок, многоступенчат, требует для выполнения большого количества реактивов и главное - инвазивен. Забор крови из локтевой вены практически затруднителен в условиях проведения периодических медицинских осмотров на предприятиях промышленного птицеводства.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой достоверностью проводить оценку развития сенсибилизации к аллергенам воздуха рабочей зоны птицеводческого комплекса (пух, перо птицы).

Достигаемый технический результат - упрощение и сокращение времени исследования, неинвазивность способа.

Предлагаемый способ ранней диагностики развития сенсибилизации к аллергенам воздуха рабочей зоны птицеводческого комплекса осуществляется следующим образом. Проводят люминолзависимую хемилюминесценцию с измерением светосуммы свечения и определяют содержание иммуноглобулина Е (IgE) в пробе с нестимулированной слюной и в пробе, дополнительно содержащей аллерген пера птицы. При повышении светосуммы свечения в 2 и более раза при параллельном снижении уровня IgE в 2 и более раза в пробе с аллергеном диагностируют наличие сенсибилизации организма работающих.

Проведено исследование 84 работающих птицеводческого комплекса. Использовали нестимулированную слюну, как наиболее доступную биологическую среду организма. Исследование процессов свободно-радикального окисления и определение уровня иммуноглобулинов в слюне проводили в модельной системе с аллергеном воздуха рабочей зоны - пера птицы.

Отбор слюны осуществляется в одноразовые пластмассовые емкости утром, натощак, после ополаскивания полости рта физиологическим раствором комнатной температуры.

Полученную пробу нестимулированной слюны центрифугируют при 1500 об/мин, в течение 20 мин.

Для проведения реакции использованы:

1. Анализатор биожидкостей люминисцентно-фотометрический «Флюорат-02-АБЛФ-Т»

2. 100 мкл клеточного осадка разводят в соотношении 1:2 фосфатным буфером (0,02М р-р KH₂PO₄ и Na₂HPO₄)

3. Стандартный аллереген пера птицы 10000 PNU/мг производства ОАО «Биомед», г.Ставрополь. Данный препарат используется в кабинетах аллергодиагностики для постановки кожных проб. Преимуществом его является стандартизация, доступность приобретения, достаточный срок хранения.

4. Тест-контрольная жидкость, входящая в состав набора производства ОАО «Биомед», г.Ставрополь

5. Люминол. Сухой порошок (C₈H₇N₃O₂, м.в. 177) разводится согласно инструкции к прибору. Готовят на диметил сульфоксиде (DMSO) из расчета 10^-4 и хранят в холодильнике при 4°C. Рабочий раствор готовится путем введения 0,5 мл маточного раствора в 500 мл флакон стерильного фабричного физиологического раствора pH 7,0-7,2 ед, который далее хранят в холодильнике при 4°C.

6. Иммуноферментный анализатор-автомат «Лазурит»

7. Коммерческие наборы для определения различных классов иммуноглобулинов производства ЗАО «Вектор-Бест».

Ход исследования.

Определение уровня иммуноглобулинов в слюне проводят в надосадочной жидкости, с использованием коммерческих наборов ЗАО «Вектор-Бест», методом иммуноферментного анализа. Для проведения исследования использованы три пробы сыворотки:

1. 100 мкл слюны

2. 100 мкл слюны + физиологический раствор

3. 100 мкл слюны + аллерген пера птицы. Инкубация 20 минут при 37°C

Для проведения хемилюминисценции клеток использован клеточный осадок.

Из разведенного клеточного осадка готовятся три пробы.

1. 100 мкл клеточного осадка слюны + люминол

2. 100 мкл клеточного осадка слюны + люминол + тест контрольная жидкость

3. 100 мкл клеточного осадка слюны + люминол + аллерген пера птицы. Инкубация 20 минут при 37°C.

Регистрация процессов свободнорадикального окисления проводится на анализаторе биожидкостей люминисцентно-фотометрическом «Флюорат-02-АБЛФ-Т», исследуются следующие параметры:

∑ - светосумма излучения за 5 минут исследования.

Весь процесс измерения ХЛ и обработку результатов проводят в автоматическом режиме, что позволяет повысить точность и объективность получаемой информации.

Установлено, что наибольшую диагностическую значимость имеют изменения Σ (светосуммы) и уровня IgE, изменяющиеся в пробе с аллергеном.

Повышение хемилюминисцентного ответа в 2 и более раза при параллельном снижении уровня иммуноглобулинов Е (в результате их связывания аллергеном) также в 2 и более раза свидетельствуют о наличии сенсибилизации организма работающих.

Достоинствами предлагаемого способа являются возможность использования в условиях массовых осмотров, соответствие требованиям безопасности, неинвазивности, общедоступности и воспроизводимости при высокой степени значимости и достоверности полученных результатов. В то же время предлагаемый нами способ хемилюминесценции является одним из ранних маркеров в патогенезе развития сенсибилизации организма.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен тождественный способ диагностики сенсибилизации к аллергенам воздуха рабочей зоны птицеводческого комплекса. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Исследованиями авторов впервые было установлено и доказано, что выявленные изменения показателей являются информативным и достоверным критерием диагностики наличия сенсибилизации организма к аллергену воздуха рабочей зоны - пера птицы. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример №1. В.Н. - работница ОАО «Благоварская птицефабрика», оператор-птицевод. Стаж работы 4 года. Предъявляет жалобы на чихание, насморк, слезотечение, усиливающиеся в процессе производственной деятельности.

Проведены скарификационные кожные пробы с аллергеном пух и перо - полож +++.

Анализ слюны:

∑ спонтанн - 367 усл. ед., ∑ с добавлением аллергена пух, перо - 6360 усл. ед.

Уровень IgE слюны спонтанн - 0,713 мг/мл, IgE с добавлением аллергена пух, перо - 0,08 мг/мл.

Заключение: сенсибилизация к аллергенам воздуха рабочей зоны.

Пример №2. Г.В. - рабочий убойного цеха ОАО «Благоварская птицефабрика», стаж работы 10 лет. Анализ слюны:

∑ спонтанн 5882 усл. ед., ∑ с добавлением аллергена пух, перо - 135 усл. ед,

Уровень IgE слюны спонтанн - 0,03 мг/мл, IgE с добавлением аллергена пух, перо - 0,035 мг/мл.

Заключение: сенсибилизации к аллергенам воздуха рабочей зоны не выявлено.

Чувствительность метода составила 85%, специфичность - 89%, прогностическая ценность положительных тестов - 71,1%.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, аллергологии и профпатологиии, и может быть использовано для ранней диагностики развития сенсибилизации на пух и перо птицы как у работников птицеводческой отрасли, так и у отдельных больных при установлении этиологического диагноза, а также при массовых обследованиях. Для этого проводят люминолзависимую хемилюминесценцию с измерением светосуммы свечения и определяют содержание IgE в пробе с нестимулированной слюной и в пробе, дополнительно содержащей аллерген пера птицы. При повышении светосуммы свечения в 2 и более раза при параллельном снижении уровня иммуноглобулина Е в 2 и более раза в пробе с аллергеном диагностируют наличие сенсибилизации организма работающих. Способ позволяет на ранних сроках диагностировать сенсибилизацию организма к аллергенам воздуха рабочей зоны птицеводческого комплекса за счет его неинвазивности, общедоступности при высокой степени значимости и достоверности. 2 пр.

Способ ранней диагностики развития сенсибилизации к аллергенам воздуха рабочей зоны птицеводческого комплекса, характеризующийся тем, что проводят люминолзависимую хемилюминесценцию с измерением светосуммы свечения и определяют содержание иммуноглобулина Е (IgE) в пробе с нестимулированной слюной и в пробе, дополнительно содержащей аллерген пера птицы, и при повышении светосуммы свечения в 2 и более раза при параллельном снижении уровня IgE в 2 и более раза в пробе с аллергеном диагностируют наличие сенсибилизации организма работающих.