СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ВОДОРАСТВОРИМЫМ ПРОМЫШЛЕННЫМ АЛЛЕРГЕНАМ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/52 G01N33/543 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, аллергологии, и может быть использовано для диагностики аллергических поражений, вызванных промышленными химическими аллергенами, как у отдельных больных при установлении этиологического диагноза, так и при массовых обследованиях лиц, контактирующих с данным продуктом.

В ответ на поступление аллергена развиваются обе формы иммунного ответа - гуморальная и клеточная. Смешанный тип иммунного ответа особенно характерен для аллергозов, вызванных воздействием промышленных аллергенов. (О.Г.Алексеева, Л.А.Дуева. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М., Медицина, 1978, с.20.)

Доказательства опасности промышленного аллергена для человека предусматривает установление его этиологической роли в развитии аллергического заболевания. Специфическими маркерами воздействия промышленного аллергена на организм человека и развития к нему повышенной чувствительности являются антигаптенные антитела, выявляемые в реакциях in vitro.

Необходимо отметить, что существует несколько методов специфической лабораторной диагностики аллергических заболеваний, вызванных воздействием промышленных химических соединений. Однако в большинстве случаев в них учитывается реакция клеток-мишеней на иммунный комплекс. Это широко известные: реакция специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ), тест повреждения нейтрофилов (ППН) и другие. Из серологических реакций наибольшее распространение в клинике профессиональных болезней получила реакция специфической микропреципитации по Уанье. (О.Г.Алексеева, Л.А.Дуева. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М.: Медицина, 1978, 272 с.)

Реакция основана на инструментальном выявлении преципитата, образующегося при оптимальных концентрациях антител и гаптена и растворимого в избытке обоих ингредиентов реагирующей системы.

Однако на сегодняшний день доказано участие в аллергическом процессе как IgE, так и IgG. У человека IgG составляют 75% от общего количества антител. (Spiegelberg H.L. // Adv. Immunol. l974. V/19. P 259-294.) В зависимости от строения тяжелых цепей IgG подразделяются на 4 подкласса: IgG1-IgG4. (Schur Р.Н. // Ann. Allergy 1987. V.58. №2. Р.89-96.) При многих аллергических заболеваниях антитела, специфические к аллергенам, представлены у больных IgE, IgG1 и IgG4 (Офицеров В.И. Подклассы иммуноглобулина G: возможности использования в диагностической практике. - Кольцово - 2004. - 36 с.)

Известен способ количественного определения аллергенспецифических иммуноглобулинов Е (IgE), предложенный Л.А.Дуевой (см. Дуева Л.А., Мизерницкий Ю.Л. Сенсибилизация к промышленным химическим аллергенам при бронхиальной астме у детей в условиях загрязнения окружающей среды. Журнал "Медицина труда и промышленная экология", №2. - 1997. - С.41-44). Суть данного метода заключается в определении исходного уровня общего IgE с последующим введением в пробу раствора тестируемого аллергена и определение в этой же пробе количества оставшегося IgE (т.е. не связанного с тестируемым аллергеном). Отношение количества IgE в каждой опытной пробе (с соответствующим аллергеном) к контрольной пробе (разведение физиологическим раствором 1:1) позволяет судить об эффекте специфического связывания (коэффициент менее 0,90) или диссоциации (коэффициент более 0,10) специфических IgE.

Близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности (прототипом) является способ определения специфических иммуноглбулинов G (Wide L., Bennich H., Johansson SGO., Diagnosis of allergy by an in vitro test for allergen antibodies. Lancet 11, 1105-107. 1967) к различным видам профессиональных аллергенов производства Dr. Fooke Laboratorien GmbH, ФРГ. (Принцип метода заключается в определении уровня циркулирующих аллерген-специфических IgG с использованием аллергенов, ковалентно связанных с твердофазным носителем. Специфические IgG-антитела, присутствующие в сыворотке пациента, присоединяются к антигенной детерминанте аллергена, ковалентно связанного с бумажным диском. Неспецифические IgG-антитела удаляются при промывке. Ферментативно меченные анти- IgG добавляются в систему, образуя комплекс аллерген - IgG-анти-IgG-щелочная фосфатаза. После вторичной промывки добавляется хромогенный субстрат (раствор п-нитрофенилфосфата), что приводит к развитию желтой окраски в образцах, интенсивность которой измеряется фотометрически (405 нм). Если оптическая плотность раствора с аллергодиском больше порогового значения, результат считается положительным по отношению к интересующим IgG. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков:

1. Значительные материальные затраты. Стоимость только реактивов для исследования одного пациента на один аллерген составляет порядка 100 долларов США.

2. Длительность проведения анализа. На инкубацию с анти IgG - по методике требуется от 18 до 24 часов.

3. Данным способом определяется количество общего IgG, тогда как в развитии различных типов аллергического процесса принимают участие различные подклассы IgG.

В связи с вышеизложенным проблема разработки информативных, безопасных для организма обследуемого и экономически доступных тестов для диагностики и доказательств этиологической роли водорастворимых промышленных аллергенов остается весьма актуальной.

Из научной и патентной литературы нам не известны способы определения аллергенспецифических иммуноглобулинов различных подклассов IgG, что позволяет сделать вывод о новизне предлагаемого технического решения.

Техническим результатом изобретения является повышение точности диагностики аллергических поражений, вызванных промышленными химическими аллергенами, за счет раздельного определения подклассов специфических IgG.

Технический результат достигается тем, что определяют уровни иммуноглобулинов подклассов IgGI и IgG4, затем рассчитывают коэффициент специфической аллергизации (КоСАЛЛ) и при его значении меньше 2,5 диагностируют наличие сенсибилизации к конкретному промышленному аллергену.

Способ осуществляется следующим образом. Определение концентрации иммуноглобулинов подклассов IgGI и IgG4 проводится при помощи коммерческих наборов для иммуноферментного анализа фирмы «Вектор-Бест» - Подклассы IgG - ИФА-Бест (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия).

Нами предложено принципиально новое использование данного набора с целью определения аллергенспецифических иммуноглобулинов различных подклассов IgG для диагностики сенсибилизации к водорастворимым промышленным аллергенам, тогда как в известной методике определяется уровень общих сывороточных иммуноглобулинов различных подклассов IgGI IgG2 IgG3 IgG4.

Для исследования используется венозная кровь, забор производится в день исследования. После центрифугирования при 3 тыс.оборотах в течение 5 минут производится отбор сыворотки.

Рабочие разведения химических аллергенов, соответствуют 0,001% на физиологическом растворе (согласно рекомендациям О.Г.Алексеева, Л.А.Дуева. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М.: Медицина, 1978. - С.181). Завышение дозы химических аллергенов могут давать ложноположительные результаты вследствие цитотоксического действия химических соединений.

Соотношение исследуемой сыворотки и разведения химического аллергена при постановке ИФА составляет 1:1.

Оценка уровня каждого подкласса IgG в пробе сыворотки крови с использованием конкретного аллергена осуществляется следующим образом.

1. Нитроцеллюлозный диск (фильтр «белая лента» ТУ 6-09-1678-86) инкубируется в растворе аллергена 120 минут в термостатируемом шейкере при 37°С, после чего трижды промывается фосфатным буфером (0,02 М р-р КН₂РО₄ и NaHPO₄).

2. Три пробы исследуемой сыворотки вносятся в лунки ИФА планшета, при этом первая проба представляет собой интактную сыворотку (нитроцеллюлозный диск в образце отсутствует), вторая проба - контрольная, в которой присутствует чистый нитроцеллюлозный диск без аллергена; третья проба представляет собой сыворотку с помещенным в нее нитроцеллюлозным диском, проинкубированным в растворе аллергена.

3. Все три пробы сыворотки инкубируют в течение 90 минут.

4. Нитроцеллюлозные диски из второй и третьей проб извлекают.

5. Производят инструментальный учет реакции на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны, рекомендованной производителем.

6. Подсчитывают КоСАЛЛ, выраженный в условных единицах (усл. ед.) - коэффициент специфической аллергизации по формуле: КоСАЛЛ = (исходная (G4И+G1И)-контрольная проба (G4K+G1K)).

(исходная (G4И+G1И)-проба с аллергеном (G4И+G1A)),

где G1И, G4И - уровень исходных показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G в пробе без нитроцеллюлозного диска;

G1A, G4A - уровень показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G в пробе, проинкубированной с аллергеном на нитроцеллюлозном диске;

G4K, G1K - уровень показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G в пробе, проинкубированной с чистым нитроцеллюлозным диском - контрольной пробе.

7. при значении КоСАЛЛ менее 2,5 усл. ед. делают вывод о наличии IgG зависимой сенсибилизации к конкретному промышленному аллергену.

По разнице между контрольной и опытной сывороткой с аллергеном, оценить содержание подклассов IgG специфических по каждому аллергену.

Учитывая высокую диагностическую значимость уровня аллергенспецифических иммуноглобулинов G (и особенно - его подклассов IgG1 и IgG4), нами для более точной диагностики сенсибилизации к промышленным аллергенам, в особенности при выдаче заключений о связи заболевания с профессией, предложен коэффициент специфической аллергизации - КоСАЛЛ

где G1И, G4И - уровень исходных показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G;

G1A, G4A - уровень соответствующих подклассов иммуноглобулинов G при добавлении аллергена;

G4K+G1K - уровень соответствующих подклассов иммуноглобулинов G без добавления аллергена.

И при КоСАЛЛ меньше 2,5 делается вывод о наличии IgG зависимой сенсибилизации к конкретному промышленному воздействию и необходимости проведения профилактических мероприятий.

Пример 1.

Больная С. Диагноз: Бронхиальная астма, смешанная форма, тяжелое персистирующее течение.

Из данных анамнеза, санитарно-эпидемиологического заключения об условиях труда и профессионального маршрута установлено, что в процессе производственной деятельности пациентка контактирует с хлорамином. Развитие и прогрессирование бронхиальной астмы связывает с условиями профессиональной деятельности. Поступила в клинику на обследование, лечение и решения экспертных вопросов связи заболевания с профессией.

Результаты специфической диагностики.

Для доказательства этиологической роли хлорамина в развитие обострений бронхиальной астмы в план обследования решено включить специфические методы диагностики. Как известно, специфическими маркерами воздействия промышленного аллергена на организм человека и развития к нему повышенной чувствительности являются антигаптенные антитела, выявляемые в реакциях in vitro:

1. Реакция специфической микропреципитации по Уанье (с хлорамином) - результат - отрицательный.

2. Специфические IgE с хлорамином / Dr. Fooke Laboratorien GmbH, ФРГ - результат - отрицательный.

Для определения уровня КоСАЛЛ с хлорамином произвели забор крови из локтевой вены пациента натощак. После центрифугирования при 3 тыс. оборотах в течение 5 минут произвели отбор сыворотки. Подготовили ex temporae 0,001% разведение хлорамина на физиологическом растворе. Затем нитроцеллюлозные диски (фильтр «белая лента») разложили в лунки плоскодонного микропланшета для иммунологических исследований и залили подготовленным раствором аллергена. Инкубировали в течение 120 мин в термостатируемом шейкере 37°С. Далее провели 3-кратную промывку фосфатным буфером. После чего добавили исследуемую сыворотку в количестве 50 мкл по схеме: «бланк (интактная сыворотка) - контроль (с нитроцеллюлозным диском - НЦД без аллергена) - опыт (НЦД с искомым аллергеном) для каждого подкласса иммуноглобулина и провели повторную инкубацию в термостатируемом шейкере 37°С 90 мин. Произвели инструментальный учет реакции на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волне 492 нм. По разнице между контрольной и опытной сывороткой с аллергеном оценили содержание подклассов IgG специфических для хлорамина у конкретного пациента.

Полученные результаты:

G1И - 24,3G4K - 0,78G4И - 3,23G1A - 21,7G1K - 10,4G4A - 0,98

Ввели данные для расчета предложенного нами коэффициента специфической аллергизации:

КоСАЛЛ получили больше 2,5. Следовательно, КоСАЛЛ с хлорамином - результат - отрицательный. Данных за этиологическую роль хлорамина в развитии бронхиальной астмы в конкретном случае нет. Заключение подтверждается и другими методами диагностики - реакцией Уанье и определением специфических IgE с хлорамином (Dr. Fooke Laboratorien GmbH, ФРГ).

Заключение клинико-экспертной комиссии: заболевание общее.

Пример 2.

Больная Г. Диагноз: Бронхиальная астма, легкое персистирующее течение. Аллергический ринит. Хроническая рецидивирующая крапивница. Отек Квинке. Больная экспертная.

Из данных анамнеза, санитарно-эпидемиологическое заключения об условиях труда и профессионального маршрута установлено, что в процессе производственной деятельности пациентка контактирует с хлорамином. Развитие и прогрессирование бронхиальной астмы связывает с условиями профессиональной деятельности. Поступила в клинику на обследование, лечение и решения экспертных вопросов связи заболевания с профессией.

Результаты специфической диагностики.

Для доказательства этиологической роли хлорамина в развитие обострений бронхиальной астмы в план обследования решено включить специфические методы диагностики. Как известно, специфическими маркерами воздействия промышленного аллергена на организм человека и развития к нему повышенной чувствительности являются антигаптенные антитела, выявляемые в реакциях in vitro:

1. Реакция специфической микропреципитации по Уанье (с хлорамином) - результат положительный.

2. Специфические IgE с хлорамином / Dr. Fooke Laboratorien GmbH, ФРГ - результат положительный.

Для определения уровня КоСАЛЛ с хлорамином произвели забор крови из локтевой вены пациента натощак. После центрифугирования при 3 тыс. оборотах в течение 5 минут, произвели отбор сыворотки. Подготовили ex temporae 0,001% разведение хлорамина на физиологическом растворе. Затем нитроцеллюлозные диски (фильтр «белая лента») разложили в лунки плоскодонного микропланшета для иммунологических исследований и залили подготовленным раствором аллергена. Инкубировали в течение 120 мин в термостатируемом шейкере 37°С. Далее провели 3-кратную промывку фосфатным буфером. После чего добавили исследуемую сыворотку в количестве 50 мкл по схеме: «бланк (интактная сыв-ка) - контроль (с нитроцеллюлозным диском - НЦД без аллергена) - опыт (НЦД с искомым аллергеном) для каждого подкласса иммуноглобулина, и провели повторную инкубацию в термостатируемом шейкере 37°С 90 мин. Произвели инструментальный учет реакции на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волне 492 нм. По разнице между контрольной и опытной сывороткой с аллергеном оценили содержание подклассов IgG специфических для хлорамина у конкретного пациента.

Полученные результаты:

G1И - 33,01 G1K - 22,35G1A - 21,51G4H - 1,9 G4K - 0,95G4A - 2,27

Ввели данные для расчета предложенного нами коэффициента специфической алергизации:

Результат менее 2,5, КоСАЛЛ с хлорамином - положительный. Свидетельствует об участии хлорамина в развитии аллергических механизмов организма пациента. Подтверждается и другими методами специфической диагностики.

Реакция специфической микропреципитации по Уанье (с хлорамином) положительная.

Специфические IgE с хлорамином (Dr. Fooke Laboratorien GmbH, ФРГ) - результат отрицательный.

Заключение клинико-экспертной комиссии: заболевание вызвано воздействием профессиональных факторов (в данном случае контакт с хлорамином). Пациентке рекомендован перевод на работу (в соответствии с законодательством - с сохранением средней заработной платы), исключающей контакт с химическими веществами раздражающего и сенсибилизирующего действия (хлорамином).

Способ диагностики сенсибилизации к промышленным аллергенам использован у 11 пациентов. Разработка критерия диагностики позволила более точно диагностировать профессиональные заболевания, а также сократить время и стоимость исследования.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и аллергологии, и может быть использовано для диагностики профессиональных заболеваний. Для осуществления способа определяют уровни аллергенспецифических антител - иммуноглобулинов подклассов IgG1 и IgG4 в сыворотке крови с использованием конкретного аллергена. Рассчитывают коэффициент специфической аллергизации (КоСАЛЛ) по формуле:

где G1И, G4И - уровень исходных показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G; G1A, G4A - уровень соответствующих подклассов иммуноглобулинов G при добавлении аллергена; G4K+G1K - уровень соответствующих подклассов иммуноглобулинов G без добавления аллергена. При КоСАЛЛ меньше 2,5 делают вывод о наличии IgG зависимой сенсибилизации к конкретному промышленному аллергену. Способ позволяет повысить точность диагностики наличия сенсибилизации к аллергену и сократить время исследования.

Способ диагностики сенсибилизации к водорастворимым промышленным аллергенам путем определения в сыворотке крови уровня специфических иммуноглобулинов G, отличающийся тем, что перед определением в пробе уровня подклассов иммуноглобулинов G (специфических антител) пробу инкубируют с конкретным аллергеном, иммобилизованным на нитроцеллюлозном диске, и рассчитывают коэффициент специфической аллергизации (КоСАЛЛ) по формуле

где G1И, G4И - уровень исходных показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G в пробе без нитроцеллюлозного диска;

G1A, G4A - уровень показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G в пробе, проинкубированной с аллергеном на нитроцеллюлозном диске;

G4K, G1K - уровень показателей соответствующих подклассов иммуноглобулинов G в пробе, проинкубированной с чистым нитроцеллюлозным диском - контрольной пробе;

и при значении КоСАЛЛ менее 2,5 делают вывод о наличии IgG зависимой сенсибилизации к конкретному промышленному аллергену.