СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ АРАБИНОГАЛАКТОУРОНАНОВ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2025 года по МПК A61K31/715 A61K36/28 A61P37/04 

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно - клинической иммунологии и может быть использовано для разработки новых безопасных и эффективных средств, обладающих иммуномодулирующей активностью, для фармакологической коррекции нарушений системы иммунитета при хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционных, а также онкологических заболеваниях.

Широкое распространение иммунодефицитных состояний человека, вызванных инфекционными и хроническими соматическими заболеваниями, неблагоприятным влиянием экологических и социальных (нерациональное питание, стресс) факторов, различных медицинских вмешательств (прием лекарственных препаратов, хирургические манипуляции и пр.), приводит к тому, что поиск и разработка иммуномодуляторов, устраняющих дисбаланс различных звеньев иммунной системы, по-прежнему, остается актуальным и востребованным. Доказано, что применение иммуномодуляторов и иммуностимуляторов способствует повышению эффективности этиотропной терапии инфекционных заболеваний, нормализации показателей иммунного статуса, снижению частоты обострений, увеличению периода ремиссии и предупреждению развития осложнений [1].

В настоящее время иммунотропных лекарственных средств растительного происхождения, официально использующихся на рынке фармацевтических препаратов Российской Федерации крайне мало. Это официнальные растительные препараты, выпускаемые на основе эхинацеи и других лекарственных растений (алтей лекарственный, ромашка аптечная, хвощ полевой, грецкий орех, тысячелистник обыкновенный, дуб черешчатый, одуванчик лекарственный, рябина сибирская, календула лекарственная и пр.), а также растений-адаптогенов (женьшень, аралия маньчжурская, родиола розовая, левзея сафлоровидная, элеутерококк колючий и др.), которые используются отдельно или в сборах [2]. Более того все иммунотропные фитопрепараты различного состава, отнесены к лекарственным средствам с неопределенным сложным комплексным составом, направленным на неспецифическую стимуляцию иммунной системы, действующим на метаболизм иммунокомпетентных клеток с невыясненным механизмом действия и эффективной мишени.

В последние годы внимание многих исследователей привлекают работы по изучению иммунотропных свойств индивидуальных веществ, выделенных из лекарственных растений, в частности полисахаридов, обладающих мягким действием и способных воздействовать только на измененные звенья иммунной системы. По сравнению с бактериальными и синтетическими препаратами полисахариды растений не имеют побочных эффектов и характеризуются низкой токсичностью, что дает им значительные преимущества при разработке иммуномодулирующих, противоопухолевых и ранозаживляющих средств [3].

С этой точки зрения интерес представляет многолетнее травянистое растение с толстым, деревянистым корнем, многочисленными войлочными стеблями и розово-фиолетовыми цветками Соссюрея иволистная (Saussurea salicifolia (L.) DC), которая не является фармакопейным и не числится в Государственном Реестре лекарственных средств, но разрешена для использования в качестве сырья при производстве биологически активных добавок. Она входит в состав препаратов противопаразитарного действия (Тригельм, Паразинол, Версулямбин и др.), как эффективное средство для лечения лямблиоза, описторхоза и микс-инвазий [4]. Кроме этого Соссюрея иволистная оказывает противовоспалительное, антитоксическое, желчегонное, кровоостанавливающее, иммуномодулирующее, противоопухолевое действие, способствует активации обменных процессов [5, 6, 7].

В предыдущих исследованиях авторами показано, что водорастворимые полисахариды, выделенные из надземной части соссюреи иволистной (Saussurea salicifolia (L.) DC) и очищенные от белка и примеси эндотоксина, эффективно стимулировали продукцию оксида азота макрофагами мышей [8, 9].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств растительного происхождения, обладающих способностью избирательной стимуляции иммунокомпетентных клеток продуцировать противовоспалительные цитокины интерлейкин-12, фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-1 бета и активировать показатели гуморального и клеточного ответа системы иммунитета.

Поставленная задача решается путем применения арабиногалактоуронанов соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC.) в качестве стимулятора показателей Th1-зависимого типа иммунного ответа, способного стимулировать продукцию ИЛ-12, ФНО-α, ИЛ-1β антигенпрезентирующими клетками, а активировать образование антителообразующих клеток и усиливать реакцию гиперчувствительности замедленного типа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства арабиногалактоуронанов соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC).

Новое свойство арабиногалактоуронанов, полученных из надземной части соссюреи иволистной, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, а описание этих свойств не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно -«новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Арабиногалактоуронаны (выход 1,17±0,31%) выделяли из высушенной надземной части соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC.) - AGU SS с содержанием влаги не более 6.0% [8]. Компонентный состав представлен доминирующими фрагментами - галактозой (34,62%), арабинозой (21,76%), уроновыми кислотами (21,23±0,71%) и второстепенными фрагментами - глюкозой (9,28%), рамнозой (5,86%), ксилозой (4,79%) и маннозой (2,43%) в молярном соотношении 11,5:7,3:7,1:3:2:1,6:0,8. Белок в полученной фракции не обнаружен.

Оценку биологической активности AGU SS проводили на лабораторных мышах, полученных из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ РАН (протокол биоэтического комитета НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга №171052020 от 18.05.2020 г.) согласно Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств [10]. Содержание, умерщвление животных, введение исследуемых веществ, осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216-2014.

Развитие Th1-зависимого иммунного ответа моделировали на мышах линии СВА (51 голова, возраст 7-8 недель) однократным введением в брюшную полость 1×10⁸ трижды отмытых эритроцитов барана (БЭР, «ЭКОлаб», РФ) в 0,2 мл физиологического раствора (ФР). AGU SS в дозе 10 мг/кг или препарат положительного контроля ликопид («Пептек», РФ) в дозе 2 мг/кг вводили ежедневно внутрибрюшинной инъекцией в объеме 0,1 мл, начиная за 7 дней до иммунизации БЭР и далее 3 дня. Контрольная группа мышей аналогично получала 0,1 мл ФР. На 4-е сутки после иммунизации БЭР у 21 мыши выделяли селезенки для оценки количества антителообразующих клеток (АОК) и сыворотку крови для определения титра антител в реакции гемагглютинации (РГА) [10]. Для определения гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) 30 мышам подкожно в подушечку задней лапы (опытная лапа - Мо) в 50 мкл вводили 10⁸ БЭР, а в контралатеральную лапу (контрольная лапа - Мк) 50 мкл ФР. Воспалительную реакцию оценивали через 24 часа, для чего животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Величину реакции (разница массы Мо и Мк) выражали в мг.

Концентрацию цитокинов определяли в зрелых макрофагах (МФ) и лимфоцитах мышей линии C57BL/6 (45 голов, возраст 8-10 недель) или мононуклеарах (МНК) человека. МФ выделяли из клеток перитонеального экссудата мышей, используя набор EasySep™ Biotin Positive Selection Kit и антитела специфические к макрофагальным рецепторам Anti-Mouse F4/80 Antibody («Stem Cell», США), лимфоциты получали двукратной отмывкой физиологическим раствором (ФР) гомогената селезенки. Для выделения МНК цельную кровь здоровых доноров с добавлением гепарина (10 ЕД/мл) наслаивали на жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077, центрифугировали и собирали клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности. МФ, лимфоциты и МНК (3×10⁶) культивировали 24 часа (37°С, 5% СО₂, 100% влажность) в 96-луночных планшетах в присутствии 20 мкг/мл ВРПС SS, 30 мкг/мл препарата сравнения N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамил (МДП, «Calbiochem», США) или митогенов 0,1 мкг/мл ЛПС («Sigma», США) и 4 мкг/мл Кон А в полной культуральной среде (RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина (Sigma», США) и 2 мМ L-глютамина («Sigma», США). Собирали супернатанты, в которых измеряли концентрацию цитокинов, используя согласно прилагаемым протоколам коммерческие тест-системы «Stemcell», Австрия (ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-12) и «InvitroGen», США (ИЛ-10, ИФН-γ, ИЛ-2).

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 13.3, используя критерий Шапиро-Уилка для проверки нормальности распределения, однофакторный дисперсионный анализ и критерий Даннета. Результаты представлены в виде Х±m, где X - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего. Уровень статистической значимости различий р<0,05, объем зависит от вида эксперимента.

Пример 1

Курсовое введение арабиногалактоуронанов соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC.) приводило к увеличению клеточности селезенок мышей в 1,5 раза, что было сравнимо с использованием иммунотропного препарата сравнения - ликопида. При этом AGU SS в 1,8 раза усиливали образование антителообразующих клеток, что в 1,3 раза превышало показатель при введении ликопида. На реакцию геммагглютинации эритроцитов AGU SS не влияли, хотя ликопид снижал РГА в 1,5 раза.

Введение AGU SS усиливало также гиперчувствительность замедленного типа на 20%, на уровне препарата сравнения.

Таким образом, курсовое использование AGU SS приводило к стимуляции показателей как гуморального, так и клеточного иммунного ответа.

Пример 2

Арабиногалактоуронаны соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) значительно усиливали продукцию основных Th1-специфичных цитокинов мононуклеаров человека в культуре клеток: в 3,6 (ИЛ-12), 250 (ФНО-α) и в 11,2 (ИЛ-1β) раза (табл. 2). При этом цитокин-активирующие свойства на 75% (ИЛ-12), 92% (ФНО-α) и 75% (ИЛ-1β) были эффектнее показателей препарата сравнения - МДП. В культуре МФ мышей концентрация цитокинов также весомо увеличивалась при обработке клеток AGU SS в 104 (ФНО-α) и 9,9 (ИЛ-1β) раз (табл. 3), превышая значения МДП на 97 и 56%, соответственно ФНО-α и ИЛ-1β.

На фоне выявленного существенного роста секретирующих свойств антигенпрезентирующих клеток AGU SS практически не влияли на продукцию альтернативного ключевого Th2-цитокина - ИЛ-10 (табл. 4). Его концентрация не отличалась от ЛПС-стимулированного показателя как в культуре МНК, так и МФ, при этом эффекты МДП значимо превышали значения митогена.

Кроме того, в экспериментальной модели воспаления, вызванной конканавлином A, AGU SS усиливали на 82% выработку ИФН-γ лимфоцитами мышей однако не влияли в этих условиях на концентрацию ИЛ-2 (табл. 5).

Таким образом, авторами установлено, что арабиногалактоуронаны, выделенные из соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC), при курсовом введении усиливают реакцию гиперчувствительности замедленного типа и образование антителообразующих клеток в селезенке мышей, стимулируя таким образом показатели как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. В культуре клеток арабиногалактоуронаны значимо усиливают продукцию провоспалительных Th1-цитокинов ИЛ-12, ФНО-α, ИЛ-1β и ИФН-γ, практически не влияя на синтез альтернативного ключевого Th2-цитокина - ИЛ-10. Полученные данные позволяют рассматривать арабиногалактоуронаны соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC.) в качестве активаторов Th1-зависимого типа иммунного ответа, а также синтеза противовоспалительных свойств макрофагов, что позволит расширить арсенал безопасных и эффективных средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при терапии инфекционно-воспалительных и онкологических заболеваний.

Изобретение относится к области клинической иммунологии, а именно к применению арабиногалактоуронанов соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC.) в качестве средства для стимуляции показателей гуморального и клеточного Th1-типа иммунного ответа, активации продукции Th1 специфических цитокинов интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа, интерлейкина-1 бета. Изобретение позволяет расширить арсенал иммуномодулирующих средств растительного происхождения, обладающих способностью избирательной стимуляции иммунокомпетентных клеток продуцировать провоспалительные цитокины интерлейкин-12, фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-1 бета и активировать показатели гуморального и клеточного ответа системы иммунитета. 5 табл., 2 пр.

Применение арабиногалактоуронанов соссюреи иволистной (S. salicifolia (L.) DC.) в качестве средства для стимуляции показателей гуморального и клеточного Th1-типа иммунного ответа, активации продукции Th1 специфических цитокинов интерлейкина-12, фактора некроза опухоли-альфа, интерлейкина-1 бета.