ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOMYCES VIOLASCENS - ПРОДУЦЕНТ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C08B37/08 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для применения в качестве продуцента гиалуроновой кислоты.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий Streptomyces violascens, синтезирующего гиалуроновую кислоту. Штамм Streptomyces violascens 58-17-19 (RCAM 05118) является мутантом, селекционированным из популяции коллекционного штамма Streptomyces violascens ВКМ Ас-1458.

Изобретение относится к биологически чистой культуре штамма бактерий Streptomyces violascens RCAM 05118, которая может быть использована в качестве продуцента гиалуроновой кислоты.

Гиалуроновая кислота (ГК) – натуральный полисахарид, биологически активное вещество, применяемое в различных сферах медицины и косметологии, входит в состав лекарственных, косметических препаратов и биологически активных добавок. Гиалуроновая кислота является обязательным компонентом дермы, соединительной ткани (хрящевой ткани), мышечной ткани, сердца, нервной ткани, стекловидного теле глаза и синовиальной жидкости всех позвоночных организмов, выполняя одновременно структурные и регуляторные функции. Кроме того, ГК в организме поддерживает эластичность и вязкость жидкостей соединительных тканей, таких как синовиальная жидкость и жидкость стекловидного тела глаза. В межсуставной жидкости ГК уменьшает трение между суставными поверхностями, играет роль смазывающего вещества, контролирует гидратацию тканей и транспорт воды, выполняет посреднические функции вместе с рецепторами при митозе, миграции, а также при воспалении. Важным является то, что ГК не обладает антигенной специфичностью и не приводит к развитию аллергических и иммунных реакций, проявляет выраженное противовирусное действие.

В настоящее время известны физико-химический и биотехнологический способы получения гиалуроновой кислоты (ГК) различного фракционного состава (общего веса от 5000 до 20000 кДа).

Физико-химические способы основаны на экстракции биополимера из различных органов млекопитающих и птиц, в которых биополимер находится в комплексе с белками, что затрудняет его выделение в чистом виде и делает необходимым введение в технологический процесс трудозатратных и дорогостоящих методов по очистке полупродукта от сопутствующих примесных соединений.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты из петушиных гребней. К недостаткам способа следует отнести малую степень очистки препарата от белков и нуклеиновых кислот, аллергогенность, недостаточно высокие органолептические показатели, низкий выход целевого продукта, зависимость от поставок животного сырья; затратность, многооперативность и длительность процесса. (Патент РФ № 2501812, опубл. 20.08.2013).

Известен способ получения ГК и коллагена в процессе переработки шкур рыб. Недостатками способа являются многооперационность и длительность процесса; применение агрессивных реагентов, необходимость растворения коллагена в органической кислоте, присутствие в сырье родственных гликозаминогликанов и белковых включений; аллергогенность; зависимость от поставок животного сырья; затратность, многооперативность процесса (Патент РФ № 2186786, опубл. 10.08.2002).

В настоящее время разработаны и активно внедряются в промышленность методы биотехнологии на основе условно-патогенных штаммов гемолитического стрептококка Streptococcus zooepidеmiсus, Corynebacterium glutamicum, Pichia pastoris, генно-модифицированных штаммов Bacillus subtilis и Escherichia coli, молочнокислых кокков Streptococcus lactis, Lactococcus lactis.

Предложен способ получения гиалуронана, предусматривающий культивирование клетки-хозяина Bacillus в условиях, подходящих для получения гиалуроновой кислоты, и извлечение целевого продукта из культуральной среды. Недостаток: генномодифицированный штамм продуцента и продукт ГМО запрещен к производству и реализации на территории РФ в соответствии с Постановлением Правительства №839 от 23.09.2013 (Патент РФ №2346049, опубл. 10.02.2009).

Предлагаемый штамм бактерии Streptomyces violascens RCAM 05118 новый, в научной и патентной литературе не описан. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются штаммы продуцента гиалуроновой кислоты Streptococcus zooepidemicus В-8014 и КБ-04. Однако по сравнению с прототипом предлагаемый штамм является непатогенным и биобезопасным и характеризуется достаточно высокими показателями (табл. 1).

Таблица 1

Биосинтетическая активность (продуктивность) нового штамма в сравнении с прототипом

Продуцент
Показатель Streptococcus zooepidemicus (В-8014, КБ-04) Streptomyces violascens RCAM 05118 Содержание ГК в культуральной жидкости 500– 600 мг/л 312-480 мг/л Экономический коэффициент по продукту (ГК) 77-200 мг/г 192-360 мг/г

Выход целевого продукта, полученного путем культивирования штамма Streptomyces violascens RCAM 05118, превышает аналоговые (табл. 2).

Таблица 2

Выход целевого продукта из биотехнологического сырья предлагаемого штамма в сравнении с существующими аналогами

Биосырье Культуральная жидкость Streptomyces violascens RCAM 05118 Петушиные гребни Стекловидное тело быка Культуральная жидкость патогена Streptococcus pneumoniae Выход ГК, % 3,8-19,2 2,0 0,6 0,5

Техническая задача изобретения заключается в селекции нового продуцента ГК на основе непатогенных бактерий вида Streptomyces violascens.

Для решения технической задачи изобретения предложен селекционированный штамм Streptomyces violascens 58-17-19, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов под номером RCAM 05118. Идентификацию штамма RCAM 05118 (58-17-19) проводили по культурально-морфологическим и микроскопическим признакам, физиолого-биохимическим свойствам согласно Определителю актиномицетов Гаузе и Определителю бактерий Берджи.

Морфология. Штамм образует хорошо развитый ветвящийся псевдомицелий белого (овсяной агар, сусло-агар, агар Сабуро, среда Красильникова 6; мальт-экстракт-агар) и сиреневого цвета (овсяной агар), который подразделяется на субстратный и воздушный. Колонии небольшие, до 3-8 мм в диаметре, чаще слившиеся, плотные. Поверхность колоний кожистая (глюкозо-пептонный агар, агар для посчета на чашках, Agar extracto de Levadura, среда Красильникова 6), бархатистая (сусло-агар, агар Сабуро, мальт-экстракт-агар; овсяной агар). Прямые цепочки спор (короткие – 3-5 и длинные – 15-30) образуются на специальных спороносящих гифах воздушного псевдомицелия. Поверхность спор гладкая. Окрашивание по Граму микропрепаратов штамма подтвердило его принадлежность к грамположительным бактериям.

Физиолого-биохимические свойства. Аэробная культура с хемоорганотрофным типом питания. Оптимальный рН — 6,5-7,5. Температурный оптимум 28-30°С. В качестве единственных источников углерода и энергии утилизирует полисахариды: крахмал, декстрин; дисахариды: сахарозу и мальтозу, моносахариды: глюкозу и фруктозу; многоатомные спирты: глицерин и маннит. В качестве источника азота использует пептон и не использует триптон; среди неорганических соединений положительное влияние на рост штамма оказывает аммония хлорид. Нитраты калия и натрия, сульфат аммония влияния на рост не оказывают. Интенсификации роста способствуют экстракты: картофельный, кукурузный, солодовый. Штамм продуцирует водорастворимые желто-коричневый и коричневый пигменты (на сусло-агаре, агаре Сабуро; мальт-экстракт-агаре), гиалуроновую кислоту (на крахмально-казеиновой среде и среде Гаузе).

Условия хранения штамма.

На полускошенном агаре до 1 года при комнатной температуре 20±1°С, до 5 лет в холодильнике (3±1°С).

Среды хранения:

овсяная, г/л: овсяная мука – 65,0; агар – 20,0; вода водопроводная – 1000 мл;

сусло-агар, г/л: солодовый экстракт - 15,0; пептоны - 0,75; мальтоза - 12,75; декстрин - 2,75; глицерин - 2,35; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,4; хлорид аммония - 1,0; агар-агар - 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл.

Использование штамма иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Посевной материал выращивали глубинным способом при непрерывном встряхивании 200 оборотов в минуту при 30°С в течение 120 часов на среде Красильникова №1 следующего состава (г/л): глюкоза – 20,0, KNO₃ – 1,0, K₂HPO₄ – 0,5, MgSO₄*7H₂O – 0,5, NaCl – 0,5, CaCO₃ – 1,0, воды водопроводной до 1 л; pH 7,0 – 7,2.

Инокулят вносили в количестве 10 % (по объему) в среду Гаузе следующего состава (г/л): крахмал растворимый – 20,0, KNO₃ – 1,0, K₂HPO₄ – 0,5, MgSO₄*7H₂O – 0,5, NaCl – 0,5, воды водопроводной до 1 л; pH 7,2–7,4.

Через 48 часов культивирования содержание гиалуроновой кислоты составило 312 мг/л.

Пример 2. Посевной материал выращивали глубинным способом при непрерывном встряхивании 200 оборотов в минуту при 30°С в течение 112 часов на картофельно-декстрозной среде следующего состава (г/л): картофель — 200,0; декстроза — 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл; рН 5,6±0,2.

Инокулят вносили в количестве 3 % (по объему) в модифицированную крахмально-казеиновую среду следующего состава (г/л): крахмал – 10,0; глицерин – 10,0; казеин – 0,3; KNO₃ – 2,0; MgSO₄ ∙ 7H₂O – 0,05; K₂HPO₄ – 2,0; CaCO₃ – 0,02; FeSO₄ ∙ 7H₂O – 0,01; NaCl – 2,0; вода дистиллированная – 1000 мл; pH°= 7,0±0,2.

Через 54 часа культивирования содержание гиалуроновой кислоты в культуральной жидкости продуцента составило 480 мг/л.

Список литературы

1. Агабалаева К.О., Полякова А.А., Грибкова Е.А., Савоськин О.В., Елистратова А.А., Пищаева Е.А., Семёнова Е.Ф., Моисеева И.Я. Сравнительное исследование влияния питательных сред на рост и развитие продуцента гиалуроновой кислоты // Актуальные проблемы медицинской науки и образования (АПМНО-2017): сб. ст. VI Междунар. науч. конф. (г. Пенза, 14–15 сентября2017 г.) / под ред. А. Н. Митрошина, С. М. Геращенко. – Пенза: Изд-воПГУ, 2017. – 206 с.

2. Белодед А. В. Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями р. Streptococcus: Автореф. дис. канд. биол. наук: МГУПБ — М., 2008. — 23 с.

3. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. Определитель актиномицетов. - М.: Наука, 1983. - 248 с.

4. Грибкова Е. А., Агабалаева К.О., Полякова А.А., Савоськин О.В., Семенова Е.Ф. Фармакогностический анализ биотехнологического сырья Streptomyces violascens // Сб. ст. VI Mеждунар. науч. конф. «Актуальные проблемы медицинской науки и образования» АПМНО-2017 (г. Пенза,14-15 сентября 2017 г.) – Пенза: Изд-во ПГУ, 2017 – С.129-132

5. Мыльникова Ю.В., Юдина А.М., Семенова Е.Ф. 2013. О возможности получения гиалуроновой кислоты на основе биотехнологического сырья // В кн.: Материалы I Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы науки XXI века» (Смоленск, 25 апреля 2013 г.). Вестник Смоленской медицинской академии. Спецвыпуск: 164.

6. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир, 1997. - 432 с.

7. Савоськин О. В., Семенова Е. Ф., Рашевская Е. Ю., Полякова А.А., Грибкова Е.А., Агабалаева К.О., Моисеева И. Я. Характеристика различных методов получения гиалуроновой кислоты // Научное обозрение. Биологические науки, – 2017. – № 2. – С. 125-135.

8. Цепилов, Р. Н. Оптимизация процесса культивирования Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus продуцента гилауроновой кислоты / Р. Н. Цепилов, А. В. Белодед, И. И. Самойленко // Журнал микробиологии, эпидемиологии ииммунобиологии. - 2013. - № 2. - с. 12-20.

9. Шахова Н.В. Выявление фазы максимального накопления гиалуроновой кислоты при культивировании молочнокислых стрептококков / Шахова Н.В., Горькова И.В. // Сетевой научный журнал Орел ГАУ. - Вып. 3 (155). – С. 51–58.

10. Badle S.S. Ratio of intracellular precursors concentration and their flux influences hyaluronic acid molecular weight in Streptococcus zooepidemicus and recombinant Lactococcus lactis / S.S. Badle, G. Jayaraman, K.B. Ramachandran // Bioresour. Technol. – 2014. - Vol.163. - P. 222-227.

11. Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (has) genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in Lactococcus lactis / R.V. Hmar, S.B. Prasad, G. Jayaraman, K.B. Ramachandran // Biotechnology Journal. – 2014. - Vol. 9. - P. 1554-1564.

12. Hoffmann J. Hyaluronic acid production with Corynebacterium glutamicum: effect of media composition on yield and molecular weight / J. Hoffmann, J. Altenbuchner // Journal of the Society for applied microbiology. – 2014. - Vol. 117. - P. 663-678.

13. Hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus in marine by-products media from mussel processing wastewaters and tuna peptone viscera / J.A. Vázquez, M.I. Montemayor, J. Fraguas, M.A. Murado // Journal of Microb Cell Fact. - 2010. - № 9. – Р. 46.

14. Mao Z. Recombinant E. coli bioprocess for hyaluronan synthesis / Z. Mao, H.D. Shin., R.A. Chen // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – Vol. 84. - P. 63-69.

15. Prasad S.B. Hyaluronic acid production is enhanced by the additional co-expression of UDP-glucose pyrophosphorylase in Lactococcus lactis Appl / S.B. Prasad, G. Jayaraman, K.B. Ramachandran // Microbiol. Biotechnol. – 2010. – Vol. 86. - P. 273-283.

16. Production of hyaluronic acid by Streptococcus zooepidemicus on protein substrates obtained from Scyliorhinus canicula discards. / J.A. Vázquez, L. Pastrana, C. Piñeiro, J.A. Teixeira,  R.I. Pérez-Martín, I.R. Amado // Journal of Mar Drugs. - 2015. - № 13 (10). - P. 6537–6549.

17. Use of induction promoters to regulate hyaluronan synthase and UDP-glucose-6-dehydrogenase of Streptococcus zooepidemicus expression in Lactococcus lactis: a case study of the regulation mechanism of hyaluronic acid polymer J. / J.Z. Sheng, P.X. Ling, X.Q. Zhu, X.P. Guo // Appl. Microbiol.- 2009. – Vol. 107. - P. 136-144.

18. Woo E.J. Metabolic engineering of Pichia pastoris for production of hyaluronic acid with high molecular weight / E.J. Woo, Y.S. Jung, H. Kim // Journal of Biotechnology. – 2014. – Vol. 185. – P. 28-36.

19. Yu H. Metabolic engineering of Escherichia coli for biosynthesis of hyaluronic acid / H. Yu, G. Stephanopoulos // Metab. Eng. – 2008. – Vol. 10. - P. 24-32.

Изобретение относится к биотехнологии Штамм бактерий Streptomyces violascens 58-17-19, обладающий способностью синтезировать гиалуроновую кислоту, депонирован в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05118. Штамм бактерий Streptomyces violascens RCAM 05118 может быть использован для получения гиалуроновой кислоты. Изобретение позволяет расширить ассортимент продуцентов гиалуроновой кислоты. 2 табл., 2 пр.

Штамм бактерий Streptomyces violascens RCAM 05118 – продуцент гиалуроновой кислоты.