ПРОБИОТИК ЛАКТОМИКРОЦИКОЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ И ОТКОРМА БРОЙЛЕРНОЙ ПТИЦЫ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/19 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве пробиотика лактомикроцикола и в птицеводстве с целью повышения продуктивности и улучшения качества мяса цыплят-бройлеров.

В последние годы все большее применение в птицеводстве находят пробиотики - кормовые добавки, которые оказывают полезное действие на животных и птицу путем улучшения кишечного микробного баланса. Использование пробиотика позволяет ускорить рост молодняка и уменьшить его отход. Они применяются при дисбактериозах, для регулирования микробиологических процессов в пищеварительном тракте, профилактики и лечения некоторых расстройств пищеварения инфекционной и алиментарной этиологии, как заменители антибиотиков и т.д. По эффективности действия пробиотики не уступают некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам, но они не оказывают губительного действия на микрофлору пищеварительного тракта, не загрязняют продукты животноводства и окружающую среду, то есть являются экологически чистыми.

В России на птице испытаны и неплохо зарекомендовали себя консорциум бактерий ВНИИСХМ №1-32 (авт. св. СССР №1398796, А 23 K 1/165, C 12 N 1/00, 1988), препарат биосан (авт. св. СССР №1777772, А 23 К 1/165, 1992), пробиотики лактин (Птицеводство, 1992. №12. С.9-10), галлиферм и энтерацид (Птицеводство. 1996. №1. С.25), биопрепарат "Анта-1" (патент РФ №2110927, А 23 К 1/165, А 61 К 35/74, С 12 N 1/20, 1998), препараты СТФ 1/56 и бифинорм (Птицеводство. 2002. №4. С.23-25), бифидумбактерин и другие препараты.

Сравнение основных характеристик указанных выше препаратов свидетельствует о том, что все они, как правило, предназначены для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, повышения сохранности и прироста живой массы молодняка.

Основными недостатками этих бактерийных препаратов являются: варьирующая эффективность применения, относительно невысокая стимуляция роста и большинство из них не оказывает влияния на качество получаемой продукции.

Наиболее близким аналогом является пробиотик лактоамиловорин (Патент РФ №2054478, C 12 N 1/20, 1996). Отличительными особенностями используемого для его приготовления штамма Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (ВКПМ-В6253) являются: способность к ферментации крахмала, которой другие лактобациллы, используемые для приготовления пробиотиков, не обладают; устойчивость к хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину, канамицину, рифампицину и полимиксину, а также к 1%-ной концентрации байтрила (энрофлоксацина); продукция антибиотических веществ широкого спектра действия; высокая толерантность к неблагоприятным факторам кишечника (желчи, этанолу, фенолу); отсутствие патогенности, токсичности, токсигенности, аллергенности.

Применение лактоамиловорина при выращивании цыплят-бройлеров обеспечивает следующие биологические эффекты: ингибирование в кишечнике эшерихий, сальмонелл и гемолитических бактерий; увеличение сохранности бройлеров с 88,9% до 90% в возрасте 49 дней; повышение живой массы бройлеров на 120 г или на 7,8%; улучшение аппетита и увеличение потребления корма на 3,25%; снижение затрат корма на 1 кг прироста живой массы на 5,4%; повышение выхода тушек 1-ой категории с 66,9% до 69,5% (Птицеводство. 1999. №6. С.32-33).

Однако, несмотря на достаточно высокие параметры эффективности выращивания бройлеров с использованием лактоамиловорина, пока еще не представляется возможным заключить, что потенциал пробиотиков в бройлерном производстве исчерпан полностью. Поэтому поиск новых высокоэффективных штаммов бактерий и их ассоциаций, обеспечивающих хорошее здоровье, высокую продуктивность и качество продукции, остается необходимым.

Задачей изобретения является получение биопрепарата (пробиотика) для бройлерного птицеводства с усиленной антагонистической активностью против потенциальных кишечных патогенов бактерий родов Escherichia и Salmonella, способного обеспечивать повышение сохранности и продуктивности птицы, а также увеличение выхода продукции 1-ой категории.

Технический результат изобретения состоит в создании нового пробиотика с усиленной антагонистической активностью и высоким потенциалом повышения продуктивности птицы.

Сущность изобретения - новый пробиотик лактомикроцикол для выращивания и откорма бройлерной птицы содержит композицию из штаммов Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 и Escherichia coli S 5/98, взятых в соотношении 1:1 при концентрации колонии образующих единиц каждого штамма в пределах 5×10⁸-5×10⁹ в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата.

Штамм Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 выделен с использованием традиционных микробиологических приемов из химуса слепой кишки здорового поросенка. Штамм депонирован во ВКПМ под N В-6253 и характеризуется следующими признаками;

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма представлены средней длины с закругленными концами палочками, располагающимися в мазках единично попарно и в коротких цепочках. Неподвижны, спор не образуют. По Граму окрашиваются положительно.

Колонии на МПА с глюкозой и триптозном агаре (39°С, 72 ч) мелкие, округлые, выпуклые, гладкие, прозрачные.

На плотной среде с бактофоком и молочной сывороткой образуются округлые, выпуклые, белые, непрозрачные колонии диаметром 0,5-1 мм.

В жидкой модифицированной среде Рогозы с капустным отваром образуются взвешенные в бульоне и фиксированные на стенках пробирки, но легко отпадающие хлопья и серо-белый осадок, легко взмучивающийся при встряхивании.

На глюкозном МПБ легкое помутнение, мелкие хлопья, фиксированные на стенке пробирки, серо-белый осадок.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб.

Оптимум температуры 37-39°С. Растет при 45°С, но не при 15°С. Остается жизнеспособным после полуторачасового прогревания при 60°С и 65°С.

Хорошо растет в интервале рН 5-7.

Газа из глюкозы не образует.

Каталазоотрицателен.

Нитраты не редуцирует.

Молоко свертывает.

Метиленовую синь (0,01 и 0,1%) восстанавливает.

Растет в средах с 2, 4 и 6% хлористого натрия; 20 и 40% желчи; 2, 4 и 6% этанола; 0,2 и 0,4% фенола.

Обладает амилолитической активностью.

Кислоту продуцирует из глюкозы, целлобиозы, галактозы, лактозы, мальтозы, маннозы, салицина, трегалозы, эскулина, туранозы и крахмала. Арабиноза, глюконат, маннит, мелецитоза, мелибиоза, раффиноза, рамноза, рибоза, сорбит, сахароза, ксилоза, инулин, сорбоза, нутроза и пектин не ферментируются.

Конечными продуктами сбраживания глюкозы являются молочная и уксусная кислоты, а также этанол.

Штамм продуцирует антибиотические вещества широкого спектра действия, ингибирующие бактерии родов Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella и некоторых видов Lactobacillus.

Штамм проявляет устойчивость к хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину, канамицину, рифампицину и полимиксину.

Штамм непатогенен, токсичных и токсигенных свойств не проявляет.

Новый штамм Escherichia coli S 5/98 - продуцент микроцина В5/98, выделен с использованием традиционных микробиологических методов из фекалий взрослой свиньи. Штамм депонирован во ВКПМ под №В 8564 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма представлены палочками с закругленными концами, отрицательно окрашивающимися по Граму. В мазках располагаются в виде отдельных клеток и беспорядочными скоплениями. Спор и капсул не образуют.

На среде Эндо формируются темно-красные с характерным металлическим блеском колонии.

На четвертном триптозном агаре (1/4 часть питательных ингредиентов от официальной прописи) вырастают округлые, выпуклые, с ровным краем, до 2 мм в диаметре, блестящие, полупрозрачные, серо-белые колонии.

На питательном бульоне с глюкозой помутнение и серо-белый осадок на дне пробирки.

Физиолого-биохимические признаки.

Оптимум температуры 37-39°С. Растет при 15°С и 45°С. Погибает после 30 мин экспозиции при 60°С.

Штамм толерантен к фенолу (0,6%), этанолу (2%), хорошо растет в среде с 20% желчи. Продуцирует газ из глюкозы, не образует сероводорода, дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фогеса-Проскауера. Растет на цитратном агаре Симмонса, но не использует ацетат и малонат в качестве источника энергии; фенилаланин и мочевину не гидролизует.

Сбраживает с образованием кислоты арабинозу, лактозу, мальтозу, маннит, глюкозу, ксилозу, трегалозу, сорбит и не ферментирует сахарозу, инозит, дульцит и салицин.

Штамм чувствителен к оксациллину, левомицетину, стрептомицину, гентамицину, рифампицину, неомицину, эритромицину, тетрациклину, канамицину, ванкомицину, клиндамицину, кларитромицину, ампикацину, а также к налидиксовой кислоте и фузидину.

Штамм продуцирует микроцин В 5/98.

Микроцин В 5/98 имеет молекулярную массу менее 10 кДа. Его продукция снижается или отсутствует при культивировании продуцента на богатых питательных средах и возрастает на обедненных (минимальных) питательных средах. Он инактивируется субтилизином Е, металлопротеиназой из Вас. mesentericus, протолихетремом и проназой, но устойчив к термолизину и трипсину.

Плазмиды у штамма не обнаружены, т.е. гены, детерминирующие продукцию микроцина и иммунность к нему, локализованы на бактериальной хромосоме.

Штамм обладает широким спектром антагонистической активности и подавляет 69-100% эшерихий и 42,6-80% сальмонелл дикого типа, изолированных из кишечника скота, свиней, цыплят и кошек. Активен против колициногенных штаммов кишечной палочки. Среди сальмонелл ингибирует виды Salmonella give, S.bovis morbipicans 988, S.dublin 42, S.london 1446, S.gaminare, S.derby, S.amager 2399, S.rostock, S.readiry, S.enteritidis 41997. Проявляет антагонизм против бактерий рода Klebsiella.

Входящие в состав пробиотика штаммы выращиваются отдельно. Препарат может использоваться в жидкой и сухой формах. Жидкие культуры составляющих лактомикроцикол штаммов целесообразно смешивать перед применением, сухую биомассу L.amylovorus БТ-24/88 и Е.coli S5/98 соединяют в препарат сразу после приготовления. Жидкие и сухие препараты лактомикроцикола хранят при температуре +4-6°С.

Пример 1. Для выращивания штамма L.amylovorus БТ-24/88 готовят молочную среду. С этой целью к водопроводной воде добавляют 10% сухого обезжиренного молока и после его растворения среду разливают в бутыли из термостойкого стекла или закачивают в ферментер и стерилизуют при 1 атм (120±1°С) в течение 30 мин. Готовую среду охлаждают до 35-38°С и инокулируют суточной культурой штамма L. amylovorus БТ-24/88 в молочной среде из расчета 5-10% к объему среды. Посевы инкубируют при 38±1°С в течение 24 ч и полученный продукт используют для скармливания птице или приготовления сухого препарата.

Жидкую культуру выпускают в герметически укупоренных стеклянных флаконах или полиэтиленовых канистрах.

Сухой препарат получают путем лиофилизации молочной культуры совместно с защитной средой, стабилизаторами и наполнителями.

Пример 2. Для выращивания штамма Е.coli S 5/98 готовят питательный бульон или МПБ, к которому добавляют 0,2% глюкозы. рН среды доводят до 6,8-7,2, разливают по пробиркам, колбам, термостойким бутылям или закачивают в ферментер и стерилизуют при 0,5 атм - 30 мин.

В качестве посевного материала используют суточную культуру Е.coli S 5/98, которую добавляют из расчета 5-10% к объему среды. Посевы инкубируют при 38±1°С в течение 24 ч. Выросшую жидкую культуру либо фасуют в подходящие емкости (флаконы, полиэтиленовые канистры), либо используют для приготовления сухой биомассы.

Для приготовления сухого препарата микробную биомассу отделяют от культуральной жидкости (сепарирование, фильтрование) и суспензируют ее в защитной среде (1/20 часть от первоначального объема), содержащей фосфаты, сахарозу и обезжиренное молоко, доводят суспензию биомассы в защитной среде до сметанообразной консистенции добавлением сухого обезжиренного обрата, тщательно перемешивают, охлаждают до +2-4°С и проводят L-высушивание в вакуумной сушилке непосредственно из жидкого состояния.

Высушенную массу измельчают, стандартизируют добавлением наполнителей (крахмал, сахароза, лактоза, сухой обрат) и фасуют в полиэтиленовые пакеты.

Пример 3. Полученный по примерам 1 и 2 пробиотик лактомикроцикол используют при выращивании цыплят-бройлеров в качестве добавки к основному рациону.

В научно-производственном опыте было сформировано 4 группы цыплят по 20 голов в каждой. Птица контрольной группы получала только основной рацион, а цыплятам 2-ой и 3-ей групп на 1 кг комбикорма добавляли 0,1 г и 0,2 г сухого лактомикроцикола соответственно. Бройлеры 4-ой группы получали пробиотик с питьевой водой из расчета 0,2 г/л. Опыт продолжался 49 дней.

Исследования показали, что лактомикроцикол не оказывает неблагоприятных воздействий на организм птицы и при ее убое каких-либо патологических изменений не обнаружено. Применение препарата оказало стимулирующее влияние на рост бройлеров. Так, живая масса 49-дневных бройлеров 3-ей и 4-ой групп составила 1767 г и 1963 г и превосходила контроль (1690 г) на 4,6% и 16,2% соответственно. При этом наблюдалось существенное улучшение качества продукции, а выход тушек 1-ой категории с 74% в контроле увеличивался до 78,3; 91,3 и 91,9% во 2-ой, 3-ей и 4-ой группах соответственно (таблица). Из полученных данных очевидно, что дача лактомикроцикола с питьевой водой обеспечивает максимальный продуктивный эффект.

Производственные испытания лактомикроцикола при выращивании цыплят-бройлеров, проведенные в ЗАО птицефабрика "Оренбургская" на поголовье 13360 голов, показали, что дача эффективной дозы препарата увеличивала сохранность молодняка на 5% и среднюю живую массу одной головы на 0,27 кг. Экономический эффект составил 78,4 тыс. руб.

Таким образом, предлагаемый для выращивания бройлерной птицы пробиотик лактомикроцикол позволяет повысить сохранность молодняка, увеличить его продуктивность и выход продукции 1-ой категории.

ТаблицаПоказательГруппы1234Количество животных, гол на начало опыта20202020на конец опыта19201919Сохранность, %951009595Живая масса одной головы в 49-дневном возрасте, г1690169717671963%100100,4104,6116,2Общая живая масса группы, кг32,1133,9433,5737,30Масса тушки, кг1,181,191,241,40Убойный выход, %69,870,170,271,3Выход мяса, кг всего22,4223,8023,5626,60в т.ч. 1-ой категории16,6018,6321,5024,45%7478,391,391,92-ой категории5,823,171,062,15%2613,34,58,1нестандартного-21-

Изобретение относится к биотехнологии. Пробиотик лактомикроцикол содержит микробную биомассу штаммов бактерий Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (ВКПМ, В-6253) и Escherichia coli S 5/98 (ВКПМ, В-8564), взятых в соотношении 1:1 при концентрации колонии образующих единиц (к.о.е.) каждого штамма в пределах 5×10⁸-5×10⁹ в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата. Лактобацилярный штамм обладает широким спектром антагонистической активности и множественной антибиотикорезистентностью, а кишечная палочка продуцирует микроцин В 5/98, подавляющий условно-патогенные и патогенные бактерии родов Escherichia и Salmonella. Применение пробиотика в кормлении цыплят-бройлеров из расчета 0,2 г на 1 кг сухого корма или 1 л питьевой воды обеспечивает повышение их сохранности, прироста живой массы и выход продукции 1-ой категории. 1 табл.

Пробиотик, используемый для выращивания и откорма бройлерной птицы, характеризующийся тем, что он содержит микробную биомассу штаммов Lactobacillus amylovorus ВКПМ В-6253 и Escherichia coli ВКПМ В-8564, взятых в соотношении 1:1, при концентрации колонии образующих единиц каждого штамма в пределах 5×10⁸-5×10⁹ в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата.