СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМОЙ АНТИГЕННОЙ НАГРУЗКИ, СТИМУЛИРУЮЩЕЙ ПРОДУКЦИЮ ГУМОРАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/00 C12N1/00 

Изобретение относится к медицине и касается разработки принципиальной схемы иммунизации экспериментальных животных антигенами с неизвестными показателями иммуногенности в части эффективной стимуляции выработки гуморальных антител, позволяющей определить предельно допустимую антигенную нагрузку, превышение которой приводит к снижению антителопродуцирующей функции макроорганизма.

Известны разнообразные способы получения высокоактивных сывороток против бактериальных антигенов различных возбудителей, реализуемых при иммунизации экспериментальных животных. Как правило, схемы их иммунизации подбирают эмпирически, ориентируясь на показатели титров гуморальных антител после завершения этапов введения соответствующих антигенных препаратов. При этом не всегда достигается требуемый уровень антител к отдельным антигенам, возникает необходимость проведения повторных циклов иммунизации. На осуществление подобных методических приемов у исследователей затрачивается большое количество времени, животных и дорогостоящих препаратов.

Например, в работе (авторское свидетельство 1069819) рассматривается способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки против колибактериоза. Данная работа основывается на схеме, в которой с целью сокращения сроков иммунизации животным-продуцентам вводят тетравит, а введение антигена проводят пятикратно с 4-дневными интервалами между инъекциями с постепенно увеличивающейся антигенной нагрузкой.

В тех случаях, когда в работе используют антигены, сведения об иммуногенности которых ограничены, и существует опасность неэффективной стимуляции гуморального звена иммунитета, например, при иммунизации линейных мышей-доноров В-лимфоцитов на этапе подготовки к последующему воспроизведению гибридомной технологии, важно не допустить неконтролируемого угнетения функции антителообразования вследствие передозировки использованного антигена.

Наиболее близким аналогом является работа о способе получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к возбудителю мелиоидоза (Некоторые особенности получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к возбудителю мелиоидоза / Новицкая И.В., Рыбкин B.C., Тихонов Н.Г. и др.// Сб. науч. работ ВолгНИПЧИ. - Волгоград, 1989. - Вып.4. - С.242-245). В основе этой работы лежит использование трех различных схем иммунизации мышей антигенами возбудителя Burkholderia pseudomallei, отличающихся сроками иммунизации и интервалами между инъекциями. Однако данные методики оказались недостаточно эффективны, трудоемки и процент антителпродуцирующих клонов в результате был не всегда достаточно высок.

Целью изобретения является разработка унифицированного способа определения иммуногенности антигенов сложного состава для мышей линии BALB/c, позволяющего в относительно короткие сроки определить предельно допустимую нагрузку антигена, стимулирующую эффективную продукцию гуморальных антител к данному антигену.

Предлагаемый способ включает в себя схему иммунизации, базирующуюся на принципах:

1. Дробного введения различным группам животных микродоз антигена через определенные интервалы, отличающихся числом инъекций антигена и соответственно суммарной нагрузкой антигена на одно животное.

2. Последующего одномоментного тестирования индивидуальных образцов сывороток, определения в них титров антител к гомологичному антигену, средних показателей титров антител в каждой экспериментальной группе и достоверности отличий этих показателей.

3. Оценке иммуногенности использованного антигена и определении предельно допустимой антигенной нагрузки на животное.

Поставленная цель достигается тем, что формируют шесть групп животных по 6-8 особей в каждой группе и отличия между каждой последующей группой животных от предыдущей заключаются в количестве осуществляемых инъекций исследуемого антигена, а контрольной является седьмая группа интактных особей этой же популяции, не получавших антиген, но которые служили донорами нормальной мышиной сыворотки, для иммунизации применяют гликопротеин капсулы высоковирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 100 с м.м. 200 kDa, у которого соотношение полисахариды:белки равно 9:1-8:2, первую инъекцию производят всем опытным группам мышей смесью равных объемов, по 0,15 мл, 25 мкг антигена в физиологическом растворе и неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины, через 7 дней у животных первой группы проводят забор крови, а оставшимся пяти группам животных внутрибрюшинно вводят 0,5 мл раствора антигена в дозе 20 мкг/мышь, через 7 сут, когда для соответствующей группы завершен цикл иммунизации, отбирают кровь, отделяют сыворотку, а для оценки динамики накопления гуморальных антител используют твердофазный иммуноферментный метод, для подготовки твердой фазы используют антиген в концентрации 10 мкг/мл (по белку), поливинилхлоридные пластины сенсибилизируют при 4-8°С в течение 16-18 ч, индивидуальные пробы сывороток исследуют в разведениях с двукратным шагом, начиная с разведения 1:100, после завершения реакции и аппаратного учета результатов реакции производят статистическую обработку данных для каждой группы животных, определяют достоверность отличий показателей между группами, группа животных с наивысшими показателями титров антител к антигену 200 kDa Burkholderia pseudomallei является той группой, которая получила оптимальную дозу, эффективно стимулирующую выработку гуморальных антител.

Первую инъекцию антигена всем взятым в опыт животным осуществляют смесью антигена с неполным адъювантом Фрейнда подкожно в область спины (1:1). Антиген разводят физиологическим раствором. Все последующие инъекции производят внутрибрюшинно раствором антигена в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Кровь отбирают у животных через 7 сут после введения антигена, затем отделяют сыворотку. Образцы сыворотки разводят 1:10, маркируют и замораживают при -20°С до момента использования.

Обязательным является использование контрольной группы интактных животных из той же популяции, которую применяли для иммунизации животных (n=6-8). Сыворотки интактных животных являются заведомо отрицательным контролем в опыте определения титров антител индивидуальных образцов сывороток животных, получивших 1, 2, 3, 4, 5 или 6 инъекций микродоз антигена.

Определение титров антител проводят с помощью непрямого варианта твердофазного иммуноферментного метода. Все образцы сывороток тестируют одномоментно с соблюдением одинаковых условий постановки опыта, что позволяет объективно определить динамику накопления гуморальных антител в крови животных, получивших различные суммарные дозы антигена, а также предельно допустимую антигенную нагрузку на одно животное, превышение которой может привести к толерантности.

Пример 1. Получение гликопротеина В. pseudomallei и его характеристика

Источником выделения гликопротеина капсульного вещества возбудителя мелиоидоза являются обеззараженные ацетоном и высушенные клетки штамма В. pseudomallei 100.

Накопление биомассы проводят в бифазной питательной среде, состоящей из Nutrient-агара, рН 6,8, на который наслаивают Nutrient-бульон, рН 6,8 при 37°С в течение 48 ч. После инкубации собранную с поверхности агара жидкую фазу инактивируют посредством 4 объемов охлажденного до -30°С ацетона. Через 3 сут проводят анализ на стерильность, который включает высев на жидкие и плотные питательные среды и постановку биопробы на золотистых хомячках. Обеззараженные бактерии досушивают охлажденным ацетоном, растирают в фарфоровой ступке под вытяжкой до порошкообразного состояния. Экстракцию гликопротеина из клеток В. pseudomallei 100 осуществляют формамидом по методу Фуллера в модификации, заключающейся в изменении температурного режима экстрагирования биополимера: этап проводят при температуре 20°С.

Определение химического состава полученного антигена осуществляют с использованием методов Лоури и Дюбо.

Иммунохимические свойства антигенного препарата, спектр его компонентов и их молекулярные массы оценивают по результатам иммуноэлектрофореза со специфической сывороткой, а также вертикального электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсультфатом Na с применением маркерных белков с м.м. 205-21 kDa.

Получаемый антигенный препарат представляет собой гликопротеин с м.м. 200 kDa, с соотношением полисахариды/белки, равным 9:1-8:2.

Полученный антиген используют для иммунизации мышей линии BALB/c и в непрямом варианте ТИФМ при подготовке твердой фазы для последующего определения титров сывороточных антител экспериментальных животных.

Расчеты антигенной нагрузки для иммунизации мышей и подготовки твердой фазы для ТИФМ производят по белку гликопротеина (в мкг).

Пример 2. Иммунизация экспериментальных животных полученным антигенным препаратом

Для решения вопроса об иммуногенности гликопротеина 200 KDa В. pseudomallei для мышей линии BALB/c проводят цикл иммунизации антигеном, вводимым дробно в микродозах с интервалами 7 сут шести различным группам животных по 8 особей, пронумерованных согласно числу сделанных им инъекций I, II, III, IV, V, VI, завершающимися отбором крови у соответствующих групп через 7 сут после инъекций антигена для получения сыворотки с целью определения в индивидуальных образцах сывороток титра антител к исследуемому антигену (см. схему).

Первую инъекцию антигена всем взятым в опыт животным осуществляют смесью антигена с неполным адъювантом Фрейнда подкожно в область спины (1:1). Антиген разводят физиологическим раствором. Все последующие инъекции производят внутрибрюшинно раствором антигена в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Кровь отбирают у животных через 7 сут после введения антигена, затем отделяют сыворотку. Образцы сыворотки разводят 1:10, маркируют и замораживают при -20°С до момента использования.

Обязательным является использование контрольной группы интактных животных из той же популяции, которую применяли для иммунизации животных (n=6-8). Сыворотки интактных животных являются заведомо отрицательным контролем в опыте определения титров антител индивидуальных образцов сывороток животных, получивших 1, 2, 3, 4, 5 или 6 инъекций микродоз антигена.

Всего в опыте используют 7 групп животных, номера этих групп соответствовали числу инъекций, полученных мышами: группы 1-6 - опытные, 7-ая группа - интактные животные (для получения сывороток по окончанию эксперимента).

Первую инъекцию антигена вместе с НАФ (0,15 мл НАФ + 25 мкг Аг 200 kDa в 0,15 мл физиологического раствора) производят п/к в область спины 6 группам опытных мышей. Через неделю у 1-ой группы проводят забор крови, остальным 5 группам делают 2-ую инъекцию внутрибрюшинно (20 мкг Аг 200 kDa + 0,5 мл ФР). Образцы крови обрабатывают, индивидуальные сыворотки разводят 1:10, в них добавляют мертиолат 1:10 000, инактивируют и замораживают до момента исследования.

В течение последующих недель оставшимся группам животных аналогичным образом делают инъекции антигена, по 20 мкг/мышь. Наибольшее число инъекций получают мыши VI группы, при этом суммарная доза антигена составит 125 мкг/мышь (по белку) (табл.1).

Пример 3. Оценка динамики накопления гуморальных антител к антигену 200 kDa В. pseudomallei

После завершения этапов иммунизации экспериментальных животных антигеном 200 kDa проводят проверку специфической активности индивидуальных образцов сывороток с помощью непрямого варианта твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ): АГ + исследуемая проба+антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов мыши.

В качестве заведомо положительного контроля при постановке ТИФМ (К+) используют поликлональную иммунную сыворотку мыши с известным титром специфических антител и нормальную мышиную сыворотку, применяемую как отрицательный контроль реакции (К-).

Все условия проведения ТИФМ, включая температурный и временной режим на этапах его выполнения, состав буферов полностью соответствуют общепринятым рекомендациям. Для подготовки твердой фазы используют антиген 200 kDa в концентрации 10 мкг/мл (по белку). Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов мыши используют в рабочем разведении.

Пластины для ТИФМ сенсибилизируют накануне того дня, когда будет проводиться оценка динамики накопления гуморальных антител к антигену 200 kDa В. pseudomallei. Все опытные сыворотки проверяют одномоментно. Пробы исследуют в разведениях с двукратным шагом, начиная с разведения 1:100. Получаемые результаты подвергают статистической обработке, определяя средние величины титров антител в опытных группах и доверительные интервалы этих значений.

Таблица 1 - Схема иммунизации мышей антигеном Группы мышей (n=8) I II III IV V VI Контрольная (интактные мыши) Способ введения п/к с НАФ в/бр в/бр в/бр в/бр в/бр - Дни введения антигена Дозировка для одной мыши (мкг белка/мышь) 0 25 25 25 25 25 25 - 7   20 20 20 20 20 - 14     20 20 20 20 - 21       20 20 20 - 28         20 20 - 35           20 - Σ доза антигена для одной мыши 25 45 65 85 105 125   Примечание: I-VI - опытные группы мышей, VII - контрольная группа интактных мышей

Нормальные мышиные сыворотки контрольной группы животных (группа VII, контрольная) взаимодействуют с Аг 200 кДа в ТИФМ в титрах, не превышающих 1:200, что является показателем «фоновых реакций» при работе с данным антигеном.

Результаты проверки специфической активности сывороток в ТИФМ представлены в таблице 2. Динамика накопления гуморальных антител у мышей, иммунизированных различными дозами антигена, отражена на чертеже.

Данные таблицы и чертежа свидетельствуют о том, что в группах с I по IV зарегистрировано нарастание титров специфических антител. Наибольшей активностью в отношении антигена 200 kDa В. pseudomallei обладали сыворотки животных IV группы, иммунизированных дробно в течение месяца суммарной дозой Аг 85 мкг/мышь. У животных, получивших большую нагрузку (105 и 125 мкг/мышь в V и VI группе соответственно), отмечено достоверное снижение антителопродукции. Таким образом, предельно допустимой антигенной нагрузкой для эффективной стимуляции накопления в сыворотках мышей гуморальных антител к антигену 200 KDа В. pseudomallei являлось суммарное количество белка антигена 85 мкг/мышь, вводимое дробно один раз в неделю в дозах 25, 20, 20, 20 мкг.

Таким образом, предлагаемый способ определения предельно допустимой антигенной нагрузки, стимулирующей продукцию гуморальных антител, имеет ряд преимуществ:

1. Универсальность способа подбора оптимальной стимулирующей В-лимфоциты дозы антигена любого химического состава (способ апробирован для целых м.к. и У3-дезинтегратов м.к., гликопротеина, смеси ЛПС + липопротеин). То есть вне зависимости от природы иммуногена экспериментатор в течение 1,5 мес получает ответ (статистически достоверный) о его потенциале в части стимуляции гуморального иммунитета.

Таблица 2 Сводные данные результатов определения активности мышиных сывороток против антигена 200 kDa В. pseudomallei Номер группы (число инъекций) Суммарная нагрузка антигена/мышь в мкг белка Показатели средних величин обратных титров антител в ТИФМ М±m I(1) 25 <200 II(2) 45 247,1±11З,1 III (3) 65 400±106,9 IV (4) 85 1285,7±399,7 V(5) 105 800±226,8 VI (6) 125 685,7±73,8 Контроль (интактные животные) 0 <200

2. Простота в исполнении. В рамках одного опыта при наличии 60 белых мышей экспериментатор получает необходимую информацию об иммуногенности конкретного антигена. Отпадает необходимость в многократном эмпирическом подборе схем иммунизации и последующем сравнительном анализе результатов различных опытов. Это особенно важно в тех случаях, когда работу проводят с биополимером, иммуногенность которого для данного вида экспериментальных животных не известна.

Может найти применение при:

- оценке иммуногенности биополимеров любого состава;

- оптимизации условий стимуляции гуморального иммунитета - необходимого требования при производстве высокоактивных сывороток-сырья для изготовления медицинских иммунобиологических препаратов;

- изучении динамики накопления гуморальных антител в сыворотках экспериментальных животных при поступлении в организм хозяина иммуногенов различного состава.

Изобретение относится к области медицины и касается разработки принципиальной схемы иммунизации экспериментальных животных антигенами с неизвестными показателями иммуногенности в части эффективной стимуляции выработки гуморальных антител, позволяющей определить предельно допустимую антигенную нагрузку, превышение которой приводит к снижению антителопродуцирующей функции макроорганизма. Способ обеспечивает разработку унифицированного способа определения иммуногенности антигенов сложного состава для мышей линии BALB/c, позволяющего в относительно короткие сроки определить предельно допустимую нагрузку антигена, стимулирующую эффективную продукцию гуморальных антител к данному антигену. Он также универсален и прост в исполнении. Формируют шесть групп животных по 6-8 особей в каждой группе и отличия между каждой последующей группой животных от предыдущей заключается в количестве осуществляемых инъекций исследуемого антигена. Контрольной является седьмая группа интактных особей этой же популяции, не получавших антиген, но которые служили донорами нормальной мышиной сыворотки. Для иммунизации применяют гликопротеин капсулы высоковирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 100 с м.м. 200 kDa, у которого соотношение полисахариды: белки равно 9:1-8:2. Первую инъекцию производят всем опытным группам мышей - смесью равных объемов, по 0,15 мл, 25 мкг антигена в физиологическом растворе и неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины, через 7 дней у животных первой группы проводят забор крови, а оставшимся пяти группам животных внутрибрюшинно вводят 0,5 мл раствора антигена в дозе 20 мкг/мышь. Через 7 сут, когда для соответствующей группы завершен цикл иммунизации, отбирают кровь, отделяют сыворотку, а для оценки динамики накопления гуморальных антител используют твердофазный иммуноферментный метод. Для подготовки твердой фазы используют антиген в концентрации 10 мкг/мл (по белку), поливинилхлоридные пластины сенсибилизируют при 4-8°С в течение 16-18 ч, индивидуальные пробы сывороток исследуют в разведениях с двукратным шагом, начиная с разведения 1:100, после завершения реакции и аппаратного учета результатов реакции производят статистическую обработку данных для каждой группы животных, определяют достоверность отличий показателей между группами, группа животных с наивысшими показателями титров антител к антигену 200 kDa Burkholderia pseudomallei является той группой, которая получила оптимальную дозу, эффективно стимулирующую выработку гуморальных антител. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ определения предельно допустимой антигенной нагрузки, стимулирующей продукцию гуморальных антител, включающий введение антигена животному-продуценту сыворотки и последующее определение иммуногенности антигена по титрам вырабатываемых антител, отличающийся тем, что формируют шесть групп животных по 6-8 особей в каждой группе и отличия между каждой последующей группой животных от предыдущей заключается в увеличивающемся количестве осуществляемых инъекций исследуемого антигена, а контрольной является седьмая группа интактных особей этой же популяции, не получавших антиген, но которые служили донорами нормальной мышиной сыворотки, для иммунизации применяют гликопротеин капсулы высоковирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 100 с м.м. 200 кДа, у которого соотношение полисахариды: белки равно 9:1-8:2, первую инъекцию производят всем опытным группам мышей смесью равных объемов, по 0,15 мл, 25 мкг антигена в физиологическом растворе и неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины, через 7 дней у животных первой группы проводят забор крови, а оставшимся пяти группам животных внутрибрюшинно вводят 0,5 мл раствора антигена в дозе 20 мкг/мышь, через 7 сут, когда для соответствующей группы завершен цикл иммунизации, отбирают кровь, отделяют сыворотку и определяют титры антител в индивидуальных образцах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для оценки динамики накопления гуморальных антител используют твердофазный иммуноферментный метод, для подготовки твердой фазы используют антиген в концентрации 10 мкг/мл (по белку), поливинилхлоридные пластины сенсибилизируют при 4-8°С в течение 16-18 ч, индивидуальные пробы сывороток исследуют в разведениях с двукратным шагом, начиная с разведения 1:100, после завершения реакции и аппаратного учета результатов реакции производят статистическую обработку данных для каждой группы животных, определяют достоверность отличий показателей между группами, группа животных с наивысшими показателями титров антител к антигену 200 кДа Burkholderia pseudomallei является той группой, которая получила оптимальную дозу, эффективно стимулирующую выработку гуморальных антител.