СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНТИТЕЛ К ФАКТОРАМ ВИРУЛЕНТНОСТИ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12Q1/18 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается применения предлагаемого метода для отбора высокоактивных моноклональных антител (МКА), взаимодействующих с эпитопами, экспонированными на поверхности микробных клеток возбудителя мелиоидоза. Тест основывается на использовании феномена эффективной опсонизации бактерий Burkholderia pseudomallei моноклональными иммуноглобулинами различной эпитопной направленности, приводящей к нарушению темпов роста микроорганизмов. Показатели бактериостатического теста наряду с результатами НМФА, подтверждающими взаимодействие МКА с поверхностью бактерий, могут служить дополнительным критерием отбора тех вариантов иммуноглобулинов, которые наиболее эффективно нарушают функциональное состояние микробных клеток, что является основанием для последующего использования их при разработке средств пассивной защиты от мелиоидозной инфекции.

Известны методы определения активности тех или иных МКА в серологических реакциях. Однако показатели специфической активности МКА в серологических тестах не могут служить единственным критерием отбора образцов антител, блокирующих биологически активные биополимеры бактериальной клетки, так как высокие показатели в данных тестах не всегда свидетельствуют о протективных свойствах иммуноглобулинов. Для оценки эффективности опсонизации микробных клеток Burkholderia pseudomallei in vitro необходимо проводить индивидуальное тестирование каждого конкретного образца МКА, определяя эффект задержки роста бактерий на плотной питательной среде с учетом факторов времени, концентрации антител и наличия/отсутствия комплемента.

Например, в работе (авторское свидетельство 1520098) рассматривается способ получения иммуногенных вакцинных штаммов чумного микроба. Данная работа основывается на высеве м.к. на культуральную среду (человеческую нормальную сыворотку) с последующей инкубацией для отбора наиболее эффективных культур Yersinia pestis.

Наиболее близким аналогом является работа о способе определения активности препарата интерферона (авторское свидетельство 1012914). В основе этой работы лежит постановка теста задержки роста бактерий стафилококка на плотной питательной среде после предварительного внесения их в пробирки с интерфероном, взятом в различных разведениях. Однако данный метод не позволяет оценить роль антител в защите от инфекции. К тому же невозможно определить как в таких случаях поведут себя другие факторы специфического иммунитета.

Целью изобретения является разработка способа предварительного отбора вариантов моноклональных антител, обладающих бактериостатическими свойствами, для последующего изучения их протективного потенциала in vivo.

Для осуществления данного метода применялись бактерии Burkholderia pseudomallei 100, Burkholderia pseudomallei С.141, Burkholderia pseudomallei 56830 и специфические иммуноглобулины 2A₈, 2F₁₁, взаимодействующие с эпитопами АГ 6 и G₁₁, 2А₆, Ppm-I, которые взаимодействуют с эпитопами АГ 8. Микробные клетки Burkholderia pseudomallei в концентрации 1·10³ м.к./мл инкубируют в течение 30, 60 и 90 мин с моноклональными антителами в концентрациях 5, 25 и 50 мкг и параллельно готовят такую же смесь «бактерии + антитела» с добавлением комплемента в разведении 1:5 и 1:10, после чего полученные смеси инкубируют 30, 60, 90 мин, затем высевают на плотную питательную среду, посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 1-2 сут, учет результатов опытов по количеству выросших колоний производят через 1-2 сут, анализируя результаты экспериментов используют относительные показатели (%) числа выросших колоний Burkholderia pseudomallei, где за 100% принимают средние значения числа выросших колоний из 100 засеянных на контрольные чашки Петри (контроль качества питательной среды), относительно этой величины производят расчет числа выросших колоний в опытных чашках и на основании проведенных расчетов эффективными иммуноглобулинами считают те варианты антител, которые подавляют рост бактерий на плотной питательной среде на 50% и более.

Показатели бактериостатического теста могут также быть применяемы для идентификации тех или иных значимых биополимеров мелиоидозной клетки.

Пример 1. Определение бактериостатческих свойств МКА различной специфической направленности при опсонизации буркольдерий мелиоидозными антителами in vitro без комплемента.

Из суточной агаровой культуры Burkholderia pseudomallei 100, выращенной при 37°С на среде Хоттингера, готовят взвесь микробных клеток с концентрацией 10⁹ м.к./мл с последующим разведением до получения раб. взвеси с концентрацией 1·10³ м.к./мл. К 0,2 мл рабочей взвеси (200 м.к.) добавляют равный объем раствора мелиоидозных антител, разведенных таким образом, чтобы 100 м.к. контактировали с 5, 25 или 50 мкг МКА. Для опсонизации используют три типа МКА к эпитопам АГ 8, экстрацеллюлярного гликопротеина капсулоподобной субстанции на поверхности подавляющего большинства штаммов мелиоидозных бактерий (2G₁₁, 2А₆, P. pm-I) и два варианта МКА против эпитопа на АГ 6, фрагмента ЛПС (2F₁₁, 2A₈). Полученные смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 30, 60 и 90 мин. После завершения инкубации осуществляют высев бактерий на чашки с плотной питательной средой. Из пробирок со смесями «бактерии + антитела» на поверхность агара выносят по 0,2 мл содержимого. Таким образом производят высев 100 м.к. на каждую чашку Петри. Из каждой опытной пробирки производят высев на 3 чашки Петри. В каждом опыте контроль качества среды осуществляют посредством высева 100 м.к. на 3 чашки Петри. Все посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 2 сут. Учет результатов опытов по количеству выросших колоний производят через 1-2 сут. При анализе результатов экспериментов используют относительные показатели (%) числа выросших колоний Burkholderia pseudomallei. За 100% принимают средние значения числа выросших колоний из 100 засеянных на контрольные чашки Петри (контроль качества питательной среды). Относительно этой величины производят расчет числа выросших колоний в опытных чашках. Эффективными иммуноглобулинами считают те варианты антител, которые подавляют рост бактерий на плотной питательной среде на 50% и более.

Как следует из данных таблицы 1, из использованных в опыте иммуноглобулинов наиболее эффективно опсонизировали бактерии мелиоидоза моноклональные антитела G₁₁ и Ppm-I, взаимодействующие с эпитопами АГ8, одним из наиболее значимых факторов вирулентности возбудителя мелиоидоза.

Пример 2. Определение бактериостатческих свойств МКА при опсонизации буркольдерий мелиоидозными антителами in vitro в присутствии комплемента.

При постановке данного метода для усиления эффекта подавления роста и размножения возбудителя мелиоидоза на плотной питательной среде наряду с моноклональными антителами используют комплемент. Из суточной агаровой культуры Burkholderia pseudomallei 100, выращенной при 37°С на среде Хоттингера, готовят взвесь микробных клеток с концентрацией 10⁹ м.к./мл с последующим разведением до получения раб. взвеси с концентрацией 1·10³ м.к./мл. В ряд пробирок со взвесью Burkholderia pseudomallei (200 м.к.) вносили различные образцы антител (0,2 мл в концентрациях 5, 25 и 50 мкг) и комплемент в разведении 1:5 и 1:10 в объеме 0,2 мл. Таким образом, в данных вариантах опыта объем реагентной смеси составлял 0,6 мл. Полученные смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 30, 60 и 90 мин. После завершения инкубации осуществляют высев бактерий на чашки с плотной питательной средой. Из пробирок со смесями «бактерии + антитела + комплемент» на поверхность агара выносят по 0,3 мл содержимого. Таким образом производят высев 100 м.к. на каждую чашку Петри. Из каждой опытной пробирки производят высев на 3 чашки Петри. В каждом опыте контроль качества среды осуществляют посредством высева 100 м.к. на 3 чашки Петри. Все посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 1-2 сут. Учет результатов опытов по количеству выросших колоний производят через 1-2 сут. При анализе результатов экспериментов используют относительные показатели (%) числа выросших колоний Burkholderia pseudomallei. За 100% принимают средние значения числа выросших колоний из 100 засеянных на контрольные чашки Петри (контроль качества питательной среды). Относительно этой величины производят расчет числа выросших колоний в опытных чашках. Эффективными иммуноглобулинами считают те варианты антител, которые подавляют рост бактерий на плотной питательной среде на 50% и более. Следует отметить, что в ряде случаев присутствие комплемента не оказывает ожидаемого, подавляющего рост мелиоидозных бактерий, эффекта. Так, например, при опсонизации Burkholderia pseudomallei 56830 препаратами моноклональных антител в концентрации 50 мкг в присутствии комплемента замедления темпов роста возбудителя инфекции в большинстве случаев не наблюдается (табл.2). При осуществлении данной методики использование специфических моноклональных антител является приоритетным, однако, в перспективе остается актуальным применение моноклональных антител в комплексе с факторами неспецифического иммунитета.

Таким образом, предложенный метод позволяет тестировать индивидуальные образцы антител с учетом факторов времени контакта бактерий с антителами, концентрации иммуноглобулинов, наличия или отсутствия комплемента в реагентной смеси, что является дополнительным способом отбора образцов специфических иммуноглобулинов, рассматриваемых в качестве потенциальных средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.

Благодаря способу определения бактериостатических свойств антител к факторам вирулентности Burkholderia pseudomallei, по степени подавления роста микроорганизмов на плотной питательной среде можно выделить те мелиоидозные специфические моноклональные антитела, которые обладают определенной эпитопной направленностью к антигенам и тем самым определить значение моноклональных антител в создании иммунитета. Это дает возможность узнать о роли конкретного вирулентного фактора в патогенезе мелиоидозной инфекции.

Таблица 1
Влияние опсонизации клеток Burkholderia pseudomallei моноклональными иммуноглобулинами разноэпитопной направленности на рост бактерий in vitroНаименование МКАСпецифичность МКАВремя предварительной инкубации (мин)Штаммы Burkholderia pseudomallei100С-14156830525505255052550мкг антител/100 м.к.G₁₁Взаимодействуют с эпитопом Аг 830------+++60++----+++90-----++++Ppm-I30------+-+60------+++90------+++2А₆30---------60--------- 90------+--2F₁₁Взаимодействуют с эпитопом Аг 630++------+60-------+-90-------++2А₈30+-+-----+ 60---------  90-+------+Контроль (γ-глобулин нормальной мышиной сыворотки)30+----++++60+++--+++-90++--+++-+Примечание:«+» - положительный результат: подавление роста 50% бактерий и более;«-» - отрицательный результат: подавление роста бактерий слабое;МКА - моноклональные антитела.

Таблица 2
Влияние опсонизации клеток Burkholderia pseudomallei 56830 моноклональными иммуноглобулинами различной специфичности и комплементом на рост бактерий in vitroНаименование моноклональных антителСпецифичность МКАВремя предварительной инкубации (мин)Штамм В.pseudomallei 56830МКА (без комплемента)Комплемент (в разведении)1/51/10G₁₁Взаимодействуют с эпитопом Аг 830+--60+--90+--Ppm-I30+--60+--90+--2А₆30---60---90---2F₁₁Взаимодействуют с эпитопом Аг 630+--60---90+--2А₈30+--60---90+--Контроль (γ-глобулин нормальной мышиной сыворотки)30+-+60---90+++Примечание:«+» - положительный результат: подавление роста 50% бактерий и более;«-» - отрицательный результат: подавление роста бактерий слабое;МКА - моноклональные антитела.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и иммунологии и касается отбора высокоактивных моноклональных антител (МКА), взаимодействующих с эпитопами, экспонированными на поверхности микробных клеток возбудителя мелиоидоза. Способ определения бактериостатических свойств антител к биологически активным компонентам клеточной стенки Burkholderia pseudomallei заключается в следующем: бактериальные клетки предварительно инкубируют при различных экспозициях с исследуемыми моноклональными антителами, а также с МКА в присутствии комплемента высевают на плотную питательную среду, посевы инкубируют в термостате при 37°С и производят учет результатов опытов по количеству выросших колоний через 1-2 суток. Исходя из показателей подавления роста бактерий, оценивают протективный потенциал МКА. Данный метод позволяет по степени подавления роста микроорганизмов выделить специфические моноклональные антитела, которые обладают определенной эпитопной направленностью к антигенам и определить значение МКА в создании иммунитета. 2 табл.

Способ определения бактериостатческих свойств антител к факторам вирулентности Burkholderia pseudomallei путем инкубирования бактериальных клеток в присутствии специфичных антител и последующей оценки их протективного потенциала, исходя из показателей подавления роста бактерий, отличающийся тем, что к суточной культуре Burkholderia pseudomallei (в рабочей концентрации 1·10³ м.к./мл) из расчета на 100 микробных клеток добавляют образцы моноклональных иммуноглобулинов различной эпитопной направленности в концентрациях 5, 25, 50 мкг и параллельно готовят такую же смесь «бактерии + антитела» с добавлением комплемента в разведении 1:5 и 1:10, после чего полученные смеси инкубируют 30, 60, 90 мин, затем высевают на плотную питательную среду, посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 1-2 сут., учет результатов опытов по количеству выросших колоний производят через 1-2 сут., анализируя результаты экспериментов, используют относительные показатели (%) числа выросших колоний Burkholderia pseudomallei, где за 100% принимают средние значения числа выросших колоний из 100 засеянных на контрольные чашки Петри (контроль качества питательной среды), относительно этой величины производят расчет числа выросших колоний в опытных чашках и на основании проведенных расчетов эффективными иммуноглобулинами считают те варианты антител, которые подавляют рост бактерий на плотной питательной среде на 50% и более.