CAPS-маркер для отбора гибридов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано для отбора гибридов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне.

Проантоцианидины, известные также как конденсированные танины, представляют собой олигомерные флавоноидные соединения, относящиеся к классу растительных полифенолов. Накапливаясь в оболочках зерна ячменя (Hordeum vulgare, 2n=2х=14, НН), эти соединения помимо важной роли в поддержании состояния покоя семян, защите их от неблагоприятных условий окружающей среды, оказывают существенное влияние на качественные характеристики зерна, определяя его целевое использование. Так, проантоцианидины зерна ячменя способны связывать пролин-богатые запасные белки, обуславливая необратимое коллоидное помутнение пива (1). Для решения проблемы коллоидного помутнения пива в 70-х гг. прошлого века было предложена стратегия снижение фракции проантоцианидинов в зерне пивоваренных сортов за счет введения в селекцию мутантных аллелей генов, контролирующих синтез проантоцианидинов (2). Это стало возможным благодаря созданной в Швеции коллекции индуцированных мутантов ячменя с нарушенным синтезом флавоноидных соединений - Anthocyanin-less (Ant), - которая на сегодняшний день насчитывает более 700 индивидуальных мутантов, сгруппированных в 30 групп комплементации, или локусов, для восьми из которых были определены молекулярные функции (1, 3).

Использование полученных мутантов в качестве доноров рецессивных аллелей генов, контролирующих биосинтез проантоцианидинов, позволило получить высокоурожайные пивоваренные сорта с повышенной коллоидной стойкостью пива (2). Однако, как было показано, мутантные аллели большинства Ant локусов не могут быть использованы в селекции беспроантоцианидиновых сортов, поскольку приводят не только к отсутствию проантоцианидинов в зерне, но и к снижению урожайности и качественных характеристик солода и готового пива (4-6). Наиболее удачным оказался опыт использования мутантов по локусам Ant27, Ant28, Ant29, специфически контролирующим синтез проантоцианидинов и не влияющим на синтез других флавоноидных соединений, в том числе антоцианов (2, 7, 8). При создании беспроантоцианидиновых сортов на основе этих мутантов использовался классический селекционный подход, включающий скрещивание мутантов с рекуррентными сортами/линиями и последующий отбор в гибридной популяции растений, зерно которых не накапливает проантоцианидины, с проверкой стабильности наследования мутантных аллелей по потомкам. Основной сложностью отбора растений, зерно которых не содержит проантоциандины, является то, что оболочка зерна, или теста, где накапливаются эти соединения, имеет материнское происхождение, в связи с чем наличие проантоциандинов возможно оценить только после сбора урожая. Тестирование зерна на наличие проантоциандинов проводят с помощью качественных тестов с п-диметиламино-коричным альдегидом (4-dimethylaminocinnamaldehyde, DMACA), раствором ванилина в соляной кислоте, или щелочью (9, 10, 11).

Использование ДНК-маркеров, разработанных к целевым генам, аллели которых определяют отличия между родительскими формами по фенотипическим признакам, позволяет проводить отбор в гибридных популяциях нужных генотипов уже на стадии проростков, не дожидаясь созревания зерна растений, что может существенно сократить время, снизить трудозатраты и повысить точность отбора. Выявление целевых генов и разработка внутригенных маркеров на основе их нуклеотидных последовательностей является актуальной задачей селекции растений.

Единственный локус, мутанты по которому были успешно использованы в селекции беспроантоцианидиновых сортов и для которого были определены нуклеотидные последовательности, является Ant28, картированный в длинном плече хромосомы 3Н ячменя (12). Ген Hvmyb10, кодирующий регуляторный фактор с доменом R2R3-MYB, был определен в качестве гена-кандидата для Ant28.

На фиг. 1 показана структурная организация гена Hvmyb10 и локализация однонуклеотидных замен, выявленных в мутантных аллелях этого гена. Так, у мутантов ant28.484, -493, -494, -495 гуанин «G» в позиции 51 в экзоне 1, считая от точки инициации трансляции, был замещен на аденин «А» (замена G/A), что на уровне белкового продукта привело к замене аминокислоты триптофан (W) на преждевременный стоп-кодон, нарушающий структуру белка. Другая замена G/A в позиции 558, выявленная у мутантов ant28.2131 и ant28.2132 привела к нарушению сплайсинга и образованию делеции пяти аминокислотных остатка в кодируемом белке у мутантов.

Наиболее близким к заявляемому маркеру - прототипом, является маркер dCAPS (derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences), разработанный для выявления мутантных аллелей гена Hvmyb10 у мутантов ant28.484, -493, -494, -495 (12). Маркер состоит из набора олигонуклеотидных праймеров: прямого dCAPS ant28M F2: 5'-TCCAAGGAGGGCCTGAACAGAGGAGCGTT-3' и обратного ant28 R1: 5'-ATGTCGGGGTATGAGCAAAG-3'; и эндонуклеазы рестрикции MseI, распознающей сайт «Т↓ТАА», вводимый прямым праймером с помощью ПЦР в мутантный аллель гена.

При амплификации ДНК мутантов ant28.484, -493, -494, -495 и родительских сортов с помощью описанных праймеров образуется ПНР-продукт длиной 160 пар нуклеотидов (п.н.), который далее у мутантных образцов расщепляется с помощью эндонуклеазы рестрикции на два фрагмента длиной 132 и 28 п. н. и сохраняется нерасщепленным у родительских сортов.

Недостатком известного dCAPS маркера является его ограниченная функциональная возможность, связанная с тем, что данный маркер может быть использован только для анализа гибридов ячменя, полученных в результате скрещивания сортов/линий ячменя, накапливающих проантоцианидины в зерне, и одного из беспроантоцианидиновых мутантов ant28.484, -493, -494, -495, имеющих в позиции 51 замену G/A.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка CAPS-маркера, позволяющего быстро и эффективно отбирать гибриды ячменя, не накапливающие проантоцианидины в зерне, и несущие в гомозиготном состоянии рецессивные аллели гена Hvmyb10, унаследованные от мутантов ant28.2131 или ant28.2132, несущих замену G/A в позиции 558.

Поставленная задача достигается тем, что разработан CAPS-маркер, состоящий из двух олигонуклеотидных праймеров и эндонуклеазы рестрикции ApaLI, расщепляющей полученный с помощью данных праймеров ПЦР-продукт доминантного аллеля гена Hvmyb10, контролирующего синтез проантоцианидинов, на два фрагмента, и не расщепляющей рецессивный аллель гена Hvmyb10, присутствующий в образцах, не накапливающих проантоцианидины в зерне, в гомозиготном состоянии.

Технический результат: расширение функциональных возможностей прототипа, снижение трудозатрат, повышение точности и скорости отбора гибридов ячменя, не содержащих проантоцианидины в зерне.

Для выполнения поставленной задачи были подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры. Для этого проведено секвенирование гена Hvmyb10, подтвердившее наличие в позиции 558 нуклеотида «G» - у сорта «Alexis» и «А» - у мутанта ant28.2131. Далее полученные последовательности аллелей гена Hvmyb10 длиной 59 нуклеотидов, содержащие замену G/A, анализировались с помощью программы dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/) на наличие полиморфных между сравниваемыми образцами сайтов рестрикции. В нуклеотидной последовательности гена Hvmyb10 сорта «Alexis» был выявлен сайт рестрикции для эндонуклеазы ApaLI (G↓TGCAC), который отсутствовал у мутанта ant28.2131, как показано на фиг. 1. С помощью программы PrimerQuest (https://www.idtdna.com/pages/tools/primerquest) были подобраны прямой Ant28_F: 5'-TTGTGTGCAGGGCTGAATAG-3' и обратный Ant28_R: 5 '-GAAACTCCAACGGAAGGGTTAG-3' праймеры, в продукт амплификации которых длиной 414 п. н. попадает район локализации выявленного сайта рестрикции эндонуклеазы ApaLI, по которому образуемый ПЦР-продукт расщепляется на два фрагмента длиной 141 и 273 п. н. Нуклеотидная последовательность разработанных праймеров представлена в перечне последовательностей.

На фиг. 2 представлены результаты электрофоретического анализа продуктов ПНР, полученных с помощью разработанной пары праймеров на ДНК мутанта ant28.2131, его родительского сорта «Alexis» и отечественных сортов ячменя «Алей» и «Ворсинский 2» (Ворс.2).

Как видно на фиг. 2, до обработки эндонуклеазой рестрикции ApaLI, длина ПЦР-продуктов всех образов составляла 414 п. н., тогда как после обработки полученные ПЦР-продукты сортов «Alexis», «Алей» и «Ворсинский 2», накапливающих проантоцианидины в зерне, расщепились на два фрагмента длиной 141 и 273 п. н., тогда как ПЦР-продукт мутантного аллеля ant28.2131 остался неизменным.

Отбор беспроантоцианидиновых гибридов ячменя с использованием предлагаемого CAPS-маркера осуществляют следующим образом. С помощью скрещивания сортов/линий ячменя, характеризующихся наличием проантоцианидинов в зерне, с донором рецессивного аллеля гена Hvmyb10 - мутантом ant28.2131 или ant28.2132, и последующего размножения собранных зерен получают гибридные растения ячменя второго поколения F₂. Затем из молодых листьев родительских форм и гибридов второго поколения F₂ проводят выделение ДНК. Для этого 2-3 кусочка листа (примерно 0,5x2 см) помещают в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл. Добавляют 200 мкл свежего буфера для экстракции (100 mM Tris-HCl, рН 7,5-8,0, 500 mМ NaCl, 50 mМ EDTA, 1,25% SDS, 0,38% Na₂S₂O₅), нагретого до 60°С. Листья тщательно измельчают на гомогенизаторе. Далее добавляют 500 мкл буфера для экстракции, перемешивают и инкубируют на водяной бане при 60°С в течение 30-40 мин. После чего добавляют 700 мкл смеси хлороформ-изоамилового спирта (24:1) и после перемешивания центрифугируют 25 мин при 10000-12000 об/мин при комнатной температуре. К отобранной верхней фракции (~500 мкл) добавляют 1,4 мл 96% холодного этанола, слегка перемешивают и центрифугируют при 10000-12000 об/мин. Осадок промывают 70% этанолом не менее 3 раз, просушивают и растворяют в 20-25 мкл бидистиллированной стерильной воды. Оценку качества и количества экстрагированной ДНК производят путем проведения аналитического электрофореза. Концентрацию ДНК в пробах стандартизуют путем разведения в стерильной бидистиллированной воде до 100 мкг/мкл.

Разведенную ДНК в объеме 5 мкл используют в качестве матрицы в ПНР, которую проводят в реакционной смеси объемом 20 мкл с помощью набора БиоМастер LR HS-ПЦР (2х), содержащего 100 мМ Трис-НСl, 100 мМ КСl, 0.8 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 4 мМ MgSO₄, 0.1 ед. акт./мкл смеси ферментов: высокопроцессивной рекомбинантной HS-Taq ДНК-полимеразы и Pfu ДНК-полимеразы с корректирующей активностью, 0.2% Tween 20, стабилизаторы ДНК-полимераз (Биолабмикс, Новосибирск), с добавлением по 1 мкМ подобранных прямого и обратного праймеров. Амплификацию проводят в следующих условиях: 4 мин при 94°С; 10 циклов: 15 сек при 94°С, 30 сек при 55°С, 2 мин при 68°С; 20 циклов: 20 сек при 94°С, 30 сек при 55°С, 2 (+10 сек/цикл) мин при 68°С; 5 мин при 68°С. К 10 мкл полученной ПЦР-смеси добавляют 2 ед. акт. эндонуклеазы рестрикции ApaLI и 2 мкл совместимого с ней буфера NE, полученную смесь выдерживают в амплификаторе при 37°С в течение 12 часов, после чего анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

Наличие расщепленных фрагментов свидетельствует о присутствии нуклеотида «G» в позиции 558, характерного для доминантных аллелей гена Hvmyb10, выявляемого у образцов ячменя, накапливающих проантоцианидины в зерне, тогда как сохранение исходного ПЦР-продукта свидетельствует о наличие нуклеотида «А» в этой позиции, характерного для рецессивного аллеля гена Hvmyb10, присутствующего у мутантов ant28.2131 и ant28.2132, не накапливающих проантоцианидины в зерне. Наличие одновременно расщепленных и нерасщепленного фрагментов после обработки ПЦР-смеси эндонуклеазой рестрикции свидетельствует о присутствии аллелей в гетерозиготном состоянии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Разработанный CAPS-маркер был использован для отбора гибридов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне, полученных после скрещивания сорта «Алей», характеризующегося наличием проантоцианидинов в зерне, с мутантом ant28.2131, зерно которого не содержит этих соединений. Сорт «Алей» был получен из коллекции ГенАгро (https://ckp.icgen.ru/plants/, ФИЦ ИЦиГ СО РАН, Новосибирск), а мутант ant28.2131 (кат. номер NGB13712) - из коллекции Nordgen (https://www.nordgen.org/en/, Альнарп, Швеция). Полученные после скрещивания гибридные семена второго поколения F₂, а также семена родительских форм высаживали в ванну гидропонной теплицы центра коллективного пользования репродукции растений ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, Россия). Из молодых листьев выделяли ДНК, которую далее генотипировали с помощью разработанного CAPS-маркера. Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР, полученных на ДНК 36 гибридов второго поколения F₂ и сортов «Алей», «Alexis», мутанта ant28.2131 после обработки эндонуклеазой рестрикции ApaLI в 2% агарозном геле представлены на фиг. 3. Как видно на фиг. 3, длина ПЦР-продукта мутанта после обработки эндонуклеазой рестрикции осталась 414 п. н., что свидетельствует о наличие нуклеотида «А» в позиции 558 гена Hvmyb10, характерного для рецессивного аллеля, тогда как ПЦР-продукт сорта «Алей» и «Alexis» (на фиг. 3 отмеченного как А1) расщепился на два фрагмента длиной 141 и 273 п. н., что свидетельствует о наличие нуклеотида «G» в позиции 558 гена Hvmyb10, характерного для доминантного аллеля гена Hvmyb10. Среди гибридов было выявлено девять образцов, гомозиготных по доминантному аллелю гена Hvmyb10 (1, 6, 7, 9, 10, 18, 22, 23, 28), семь образцов, гомозиготных по рецессивному аллелю гена Hvmyb10 (4, 5, 24, 25, 30, 33, 36), и двадцать гетерозиготных образцов (2, 3, 8, 11-17, 19-21, 26, 27, 29, 31, 32, 34, 35). Зерно, собранное с родительских образцов и анализируемых гибридов, было протестировано с помощью качественной реакции на проантоцианидины. Для этого, по пять зерен с растения, вымачивали в течение 8 часов в растворе 1N NaOH с 0.01% Tween20. В результате зерно, содержащее проантоцианидины, приобретало коричневый цвет, тогда как зерно без проантоцианидинов оставалось желтым. Зерна всех гибридов, несущих доминантные аллели гена Hvmyb10 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии, приобретали после обработки гидроксидом натрия коричневый цвет. Такие образцы отмечены на фиг. 3 как «ПА+» (содержат проантоцианидины). Образцы с рецессивным аллелем гена Hvmyb10 в гомозиготном состоянии после замачивания в гидроксиде натрия имели желтую окраску, что свидетельствует об отсутствии проантоцианидинов в зерне этих образцов, которые отмечены на фиг. 3 как «ПА-» (не содержат проантоцианидины). Среди проанализированных растений были отобраны семь растений под номерами 4, 5, 24, 25, 30, 33, 36, характеризовавшиеся наличием рецессивного аллеля гена Hvmyb10 в гомозиготном состоянии, отсутствие проантоцианидинов в зерне которых было подтверждено с помощью тестирования щелочью. Эти образцы были отобраны для дальнейшей селекции сортов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне.

Пример 2

Отбор гибридов ячменя, зерно которых не накапливает проантоцианидины, с помощью разработанного CAPS-маркера, проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве родительского сорта использовали сорт «Ворсинский 2». Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР, полученных на ДНК 36 гибридов второго поколения F2 и сортов «Ворсинский 2» (на фиг. 4 отмеченного как Ворс.2), «Alexis», мутанта ant28.2131 после обработки эндонуклеазой рестрикции ApaLI в 2% агарозном геле, представлены на фиг. 4.

У гибридов под номерами 2, 6, 9, 14, 17, 19, 24, 28, 30, 31, 32 был выявлен рецессивный аллель гена Hvmyb10, унаследованный от мутанта ant28.2131, в гомозиготном состоянии. Тестирование собранных с этих гибридов зерен на наличие проантоцианидинов в 1N растворе NaOH с 0.01% Tween20 подтвердило отсутствие этих соединений. Указанные гибриды были отобраны для дальнейшей селекции сортов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне.

Таким образом, разработанный CAPS-маркер может быть применен для отбора гибридов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне, полученных в результате скрещивания проантоцианидин-содержащих сортов/линий ячменя с донором мутантного аллеля гена Hvmyb10 (мутантом ant28.2131), зерно которых не накапливает проантоцианидины.

Использование предлагаемого CAPS-маркера позволит расширить функциональные возможности прототипа, снизить трудозатраты, повысить точность и скорость отбора гибридов ячменя, не содержащих проантоцианидины в зерне.

Источники информации

1. Шоева О.Ю. Мировой опыт создания пивоваренных сортов ячменя на основе беспроантоцианидиновых мутантов // Письма в Вавиловский журнал генетики и селекции. 2021. Т. 7. №1. Р. 23-33.

2. von Wettstein D. From analysis of mutants to genetic engineering // Annu. Rev. Plant Biol. 2007. V. 58. P. 1-19.

3. Lundqvist U. Scandinavian mutation research in barley - a historical review // Hereditas. 2014. V. 151. P. 123-131.

4. von Wettstein D., Jende-Strid В., Ahrenst-Larsen В., Sorensen J.A. Biochemical mutant in barley renders chemical stabilization of beer superfluous // Carlsberg Res. Commun. 1977. V. 42. P. 341-351.

5. van Harten A.M. Mutation breeding: theory and practical applications. Cambridge: Cambridge University Press, 1998.

6. Fukuda K., Saito W., Arai S., Aida Y. Production of a novel proanthocyanidin-free barley line with high quality // J. Inst. Brew. 1999. V. 105. №3.P. 179-183.

7. von Wettstein D. Breeding of value added barley by mutation and protein engineering. Induced mutations and molecular techniques for crop improvement. Proceedings of a symposium. Vienna. 1995;67-76.

8. von Wettstein D., Cochran J.S., Ullrich S.E., Kannangara C.G., Jitkov V.A., Burns J.W., Reisenauer P.E., Chen X., Jones B.L. Registration of 'Radiant' barley. Crop Science. 2004;44:1859-1860.

9. Kohyama N., Chono M., Nakagawa H., Matsuo Y., Ono H., Matsunaka H. Flavonoid compounds related to seed coat color of wheat // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2017. V. 81, №11. P. 2112-2118.

10. Aastrup S., Outtrup H., Erdal K. Location of the proanthocyanidins in the barley grain // Carlsberg Res. Commun. 1984. V. 49. P. 105-109.

11. Himi E., Taketa S. Barley Ant17, encoding flavanone 3-hydroxylase (F3H), is a promising target locus for attaining anthocyanin/proanthocyanidin-free plants without pleiotropic reduction of grain dormancy // Genome. 2015. V. 58. P. 43-53.

12. Himi E., Yamashita Y., Haruyama N., Yanagisawa Т., Maekawa M., Taketa S. Ant28 gene for proanthocyanidin synthesis encoding the R2R3 MYB domain protein (Hvmyb10) highly affects grain dormancy in barley // Euphytica. 2012. V. 188. P. 141-151.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CAPS_Ant28.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.0.0"

productionDate="2022-08-15">

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр

«Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской

академии наук» (ИЦиГ СО РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Institute of Cytology and Genetics, Siberian

Branch of Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">CAPS-маркер для отбора гибридов

ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

SEQID NO 1

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>Hordeum vulgare</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttgtgtgcagggctgaatag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

SEQID NO 2

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>Hordeum vulgare</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaactccaacggaagggttag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к CAPS-маркеру для отбора гибридов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне. Изобретение позволяет эффективно отбирать растения ячменя, зерно которых не накапливает проантоцианидиновые соединения. 4 ил., 2 пр.

CAPS-маркер для отбора гибридов ячменя, не накапливающих проантоцианидины в зерне, состоящий из олигонуклеотидных праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO 1: 5'-TTGTGTGCAGGGCTGAATAG-3' и SEQ ID NO 2: 5'-GAAACTCCAACGGAAGGGTTAG-3', и эндонуклеазы рестрикции ApaLI, расщепляющей полученный с помощью данных праймеров ПЦР-продукт доминантного аллеля гена Hvmyb10 длиной 414 пар нуклеотидов (п.н.), контролирующего синтез проантоцианидинов, на два фрагмента длиной 141 и 273 п.н., и не расщепляющей рецессивный аллель гена Hvmyb10, присутствующий в образцах, не накапливающих проантоцианидины в зерне, в гомозиготном состоянии.