ТРИТЕРПЕНОИДЫ С ФРАГМЕНТОМ ЕН-НИТРИЛА В А-ПЕНТАЦИКЛЕ Российский патент 2013 года по МПК C07J53/00 A61K31/277 A61P31/18 A61P31/22 

Изобретение относится к новым химическим соединениям класса лу-пановых тритерпеноидов.

Для многих природных и полусинтетических А-секотритерпеноидов характерны цитотоксические или противовирусные свойства, что делает данную группу соединений перспективной для разработки новых терапевтически значимых агентов [Y. Wei, С.-М. Ma, D.-Y. Chen, М. Hattori. Anti-HIV-1 protease triterpenoids from Stauntonia obovatifoliola Hayata subsp.intermedia //Phytochemistry. - 2008. -Vol.69.-P. 1875-1879; Y. Wei, C.-M. Ma, M. Hattori. Synthesis and evaluation of A-seco type triterpenoids for anti-HIV-1 protease activity // European Journal of Medicinal Chemistry. -2009. - Vol.44. - P. 4112-4120; Y. Wei, C.-M. Ma, M. Hattori. Synthesis of dammarane-type triterpene derivatives and their ability to inhibit HIV and HCV proteases // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2009. - Vol.17. - P. 3003-3010].

Известны лупановые и 19(3,28-эпокси-18αН-олеанановые 1-циано-2,3-секотритерпеноиды), проявляющие активность в отношении вирусов оболочечного типа (гриппа А, герпеса простого 1 типа и везикулярного стоматита, в частности) [И.А.Толмачева, В.В.Гришко, Е.И.Бореко, О.В.Савинова, Н.И.Павлова. Синтез и противовирусная активность 2,3-се/со-производных бетулоновой кислоты // Химия природных соединений. -2009. - №5. - С.566-568; Н.В.Галайко, И.А.Толмачева, В.В.Гришко, Л.В.Волкова, Е.Н.Перевозчикова, С.А.Пестерева. Противовирусная активность лупановых и 19β,28-эпокси-18α-олеанановых 2,3-секотритерпеновых гидразонов) // Биоорганическая химия. - 2010. - Т. 36. -№4.-С.556-562].

Известны также 1-циано-2,3-секотритерпеноиды, которые могут быть использованы в качестве базовых соединений в синтезе А-пентациклических тритерпеноидов с 1-циано-1-еновым фрагментом. Изомерный 2-циано-1-еновый фрагмент в шестичленном цикле А определяет высокий уровень фармакологической активности ряда полусинтетических тритерпеноидов [М.В.Sporn, К.Т.Liby, М.М.Yore, L.Fu, J.М.Lopchuk, G.W.Gribble. New synthetic triterpenoids: potent agents for prevention and treatment of tissue injury caused by inflammatory and oxidative stress // Journal of Natural Products.-2011.-Vol.74.-P. 537-545].

Наиболее близкими к заявляемым соединениям по структуре являются природная цеанотовая кислота и полусинтетические А-пентациклсодержащие тритерпеноиды, которые обладают выраженной цитотоксической активностью [S.-S. Lee, W.-C. Chen, C.-F. Huang, Y. Su. Preparation and cytotoxic effect of ceanothic acid derivatives // Journal of Natural Products. - 1998. - Vol.61. - P. 1343-1347; K. Nakagawa-Goto, K. Yamada, M. Taniguchi, H. Tokuda, K.-H.Lee. Cancer preventive agents 9. Betulinic acid derivatives as potent cancer chemopreventive agents // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2009. - Vol.19. - P. 3378-3381].

Задачей изобретения является синтез новых тритерпеновых производных, проявляющих противовирусную активность для расширения сырьевой базы противовирусных средств, а также перспективных в качестве ключевых интермедиатов для получения новых биологически активных соединений.

Для решения поставленной задачи синтезированы

1. А-пентациклические тритерпеноиды общей формулы:

,

где R=Н, R₁= или R=Н, R₁= или

R=Н, R₁= или R=NH₂, R₁= или

R=NH₂, R₁=

2. Соединение по п.1, где R=Н, R₁=, проявляющее ингибирующую активность в отношении ВИЧ-1.

3. Соединения по п.1, где R=Н, R₁= или

R=Н, R₁=, проявляющие ингибирующую активность в отношении вируса герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1 С).

Получены соединения общей формулы, где R=Н, R₁=

(соединение I); R=Н, R₁= (соединение II); R=Н, R₁=

(соединение III), R=NH₂, R₁= (соединение IV), R=NH₂, R₁= (соединение V), которые представляют собой мелкокристаллические вещества белого цвета.

Указанные соединения хорошо растворимы в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметилсульфоксиде, плохо растворимы в гексане и не растворимы в воде.

Синтез соединений I-III проводили способом, включающим внутримолекулярную циклизацию 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты (для соединения I) или метилового эфира 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты (для соединения II) или 1-циано-19β,28-эпокси-18αН-олеанан-3-аля (для соединения III). Синтез соединений IV и V проводили способом, включающим внутримолекулярную циклизацию метилового эфира 1,4-дициано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты (для соединения IV) или 1,4-дициано-19β,28-эпокси-18αН-олеанана (для соединения V).

Структура заявляемых соединений подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. Спектральные характеристики соединений I-V приведены в таблице 1. ИК-спектры (ν, см^-1) регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре IFS 66/S Bruker (Германия) в пасте с вазелиновым маслом. Спектры ¹Н- и ¹³С-ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) записывали для растворов в CDCl₃ на спектрометре Varian Mercury+(США) при рабочей частоте прибора 300,0 МГц, внутренний стандарт - гексаметилдисилоксан. Пороговое значение температуры в точке плавления при скорости нагрева 1°С/мин определяли на приборе OptiMelt МРА100 (США). ТСХ-анализ проводили на пластинах Sorbfil (Россия) в системе гексан/этилацетат. Обнаружение веществ осуществляли обработкой 5% H₂SO₄ с последующим прогреванием пластины при 95-100°С в течение 2-3 мин. Для колоночной хроматографии использовали силикагель 60-200 µm марки Merck (Германия), элюент для каждого соединения подбирали индивидуально.

Противовирусная активность заявляемых соединений изучена на культурах клеток. Соединения II и III проявляют противовирусную активность в отношении вируса герпеса простого I типа (ВГП-1). Соединение II проявляет противовирусную активность в отношении вируса иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1).

Описания заявляемых соединений и их свойств в источниках информации не обнаружено.

Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами 1-7 и результатами исследований, приведенными в таблицах 1 и 2.

Пример 1. Получение 1-циано-2-нор-луп-1(3),20(29)-диен-28-овой кислоты (соединение I).

Смесь 0.5 ммоль 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты и 1 ммоль t-BuOK в присутствии 10 мл t-BuOH кипятили в течение 1.5 ч. Реакцию контролировали методом ТСХ. Реакционную смесь разбавляли 30 мл 5% раствором HCl и экстрагировали этилацетатом (50 мл × 2). Органический слой промывали 10% раствором NaНСО₃ и сушили над безводным Mg₂SO₄. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью метода колоночной хроматографии. Элюент - гексан/этилацетат (7:1). Выход 21%. R_f 0.70 хлороформ/метанол (20:1). Т. пл. 203.7°С (гексан/этилацетат (7:1)). $${[\alpha ]}_D^{24}$$ +8.5 (с 0.5, СНСl₃).

Пример 2. Метиловый эфир 1-циано-2-нор-луп-1(3),20(29)-диен-28-овой кислоты (соединение II) получали по методике, описанной в примере 1, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты и для очистки с помощью метода колоночной хроматографии в качестве элюента - гексан/этилацетат (10:1). Выход 30%. R_f 0.50 гексан/этилацетат (5:1). Т. пл. 202.6°С (гексан/этилацетат(10:1)). $${[\alpha ]}_D^{24}$$ +6.8 (с 0.5, CHCl₃).

Пример 3. 1-Циано-19β,28-эпокси-2-нор-18αН-олеан-1(3)-ен (соединение III) получали по методике, описанной в примере 1, используя в качестве исходного соединения 1-циано-19β,28-эпокси-18αН-олеанан-3-аль и для очистки с помощью метода колоночной хроматографии в качестве элюента - гексан/этилацетат (10:1). Выход 25%. R_f 0.41 гексан/этилацетат (7:3). Т. пл. 231.6°С (гексан/этилацетат (10:1)). $${[\alpha ]}_D^{24}$$ +32.2° (с 0.5, СНСl₃).

Пример 4. Получение метилового эфира 3-амино-1-циано-2-нор-луп-1(3),20(29)-диен-28-овой кислоты (соединение IV).

Для синтеза соединения IV предварительно синтезировали метиловый эфир 1,4-дициано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты.

Способ А). Смесь 1 ммоль метилового эфира 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты и 3 ммоль NH₂OH×HCl растворяли в 50 мл смеси C₂H₅OH/C₅H₅N (5:1). Реакционную смесь кипятили в течение 2-3 ч. Ход реакции контролировали с помощью метода ТСХ. По окончании реакции растворитель упаривали, остаток разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом, органический слой отделяли, сушили над безводным Mg₂SO₄. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью метода колоночной хроматографии. Элюент - гексан/этилацетат (5:1). Полученный таким образом метиловый эфир 3-гидроксимино-1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты и 1 ммоль CH₃COONa растворяли в 3 мл уксусного ангидрида. Реакционную смесь кипятили в течение 3 ч. Ход реакции контролировали методом ТСХ. По окончании реакции реакционную смесь разбавляли водой, продукты экстрагировали этилацетатом (50 мл × 2), органический слой промывали 10% раствором NаНСО₃ и сушили над безводным Mg₂SO₄. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью метода колоночной хроматографии. Элюент - гексан/этилацетат (5:1).

Способ Б). 1 Ммоль 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты и 1.1 ммоль NH₂OH×HCl растворяли в безводном ДМФА (10 мл) и нагревали до 100°С. В полученную смесь, продолжая нагревание, добавляли в течение 15 мин KF/Al₂O₃ (7.25 г) [V.К.Yadav, К.G.Babu, М.Mittal. KF-Al₂O₃ is an efficient solid support reagent for the acetylation of alcohols and amines, impeding effect of solvent on the reaction rate // Tetrahedron. - 2001. - Vol.57. - P. 7047-7051]. Реакцию контролировали методом TCX. Растворитель отгоняли, к остатку прибавляли 20 мл дихлорметана и смесь отфильтровывали. Фильтрат промывали водой (50 мл х 2), органический слой отделяли, сушили безводным Mg₂SO₄, растворитель отгоняли, остаток очищали с помощью метода колоночной хроматографии, элюент - гексан/этилацетат (5:1).

Смесь 0.5 ммоль полученного метилового эфира 1,4-дициано-2,3-секолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты и 1 ммоль t-BuOK в присутствии 10 мл t-BuOH кипятили в течение 1.5 ч. Реакцию контролировали с помощью метода ТСХ. Реакционную смесь разбавляли 30 мл 5% раствором соляной кислоты и экстрагировали этилацетатом (50 мл × 2). Органический слой промывали 10% раствором NaHCO₃ и сушили над безводным Mg₂SO₄. Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью метода колоночной хроматографии. Элюент - гексан/этилацетат (7:1). Выход 14%. R_f 0.39 гексан/этилацетат (7:3). Т. пл. 156.6°С (гексан/этилацетат (7:1)). $${[\alpha ]}_D^{24}$$ +16.53° (с 0.5, CHCl₃).

Пример 5. 3-Амино-1-циано-19β,28-эпокси-2-нор-18αН-олеан-1(3)-ен (соединение V) получали по методике, описанной в примере 4, используя в качестве исходного соединения 1,4-дициано-19β,28-эпокси-18αН-олеанан). Выход 13%. R_f 0.41 гексан/этилацетат (7:3). Т. пл. 172.2°С (гексан/этилацетат (7:1)). $${[\alpha ]}_D^{24}$$ +43.24°(с 0.5, CHCl₃).

Пример 6. Исследование противовирусной активности в отношении вируса герпеса простого I типа.

При проведении исследований использовали линию клеток рабдо-миосаркомы человека (RD) и вирус герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1 С). Монослойную культуру клеток RD, выращенную в лунках пластиковой 96-луночной панели, отмывали от ростовой среды, инфицировали 0,01-0,001 ТЦИД₅₀/клетка ВГП-1 путем нанесения на клетки разведений вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37°С. Затем жидкость удаляли и клетки покрывали средой поддержки (среда DMEM), содержащей различные концентрации исследуемых веществ. Водонерастворимые вещества предварительно растворяли в 10% этаноле. При последующем разведении использовали DMEM. Содержание этанола в конечных концентрациях веществ для исследования не превышало 1%. На каждую концентрацию изучаемого вещества использовали по 2-4 лунки с культурой клеток, инфицированной одним разведением вируса. Для изучения противовирусных свойств каждого вещества использовали 3-4 разведения вируса. После 48 ч инкубации при 37°С регистрировали морфологические изменения монослоя клеток (цитопатическое действие (ЦПД) вируса, увеличение × 80). На основе наличия/отсутствия ЦПД вируса в лунках с разными концентрациями вещества вычисляли титр вируса. Первичным критерием противовирусного действия считали наличие различий в сравнении с контролем вируса. На основе значений титра вируса вычисляли среднеэффективную концентрацию вещества (ЕС₅₀). Рассчитывали также отношение максимально переносимой концентрации (МПК) соединения к ЕС₅₀. МПК определяли как максимальную концентрацию вещества, не оказывающую влияния на морфологию неокрашенной культуры клеток за период инкубации (48 ч).

Установлено, что соединения II и III обладают способностью подавлять репродукцию ВГП-1 в диапазонах концентраций от МПК до 1/40 МПК со снижением титра вируса, достигающим у соединений II и III более 2,2 lg ТЦИД₅₀/мл. Вычисленные значения ЕС₅₀, а также отношения МПК/ЕС₅₀ приведены в таблице 2.

Пример 7. Методика исследования противовирусной активности в отношении ВИЧ-1.

Испытания проводили на перевиваемой суспензионной Т-лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4 (плотность 4-5×10⁵ клеток/мл) на питательной среде RPMI-1640 Sigma-Aldrich (США). В качестве инфекционного агента использовали высокорепликативный изолят ВИЧ-1_zmb с титром 6,0 lg ТЦД₅₀. Определение наличия анти-ВИЧ активности проводили с помощью формазанового теста в МТТ-варианте. Исходный раствор препарата (5,0 мг/мл) готовили ex tempore путем растворения в 10% этаноле. Базовый раствор титровали в лунках 96-луночной панели с 5-кратным шагом, после чего в лунки последовательно вносили клетки и вирус (терапевтическая схема). Конечный объем реакционной смеси составлял 200 мкл/лунку. Контролями служили необработанные препаратом ВИЧ-инфицированные клетки (контроль вируса) и необработанные препаратом неинфицированные клетки (контроль клеток). Панели инкубировали в атмосфере, содержащей 5% СО₂ при 37°С. Учет результатов осуществляли через 72 ч. В качестве позитивного контроля на анти-ВИЧ активность в каждой серии экспериментов использовали коммерческий препарат азидотимидина, который титровали параллельно с исследуемым образцом.

Методика базируется на определении интенсивности образования формазанового продукта при внесении в клеточную культуру реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид). После 3-часовой экспозиции при 37°С надосадок удаляли, а образовавшийся формазановый продукт растворяли в диметилсульфоксиде, затем проводили измерение интенсивности развившегося окрашивания на спектрофотометре Plate Reader DAS A3 (Италия) при длине волны 550/630 нм. Результаты теста учитывали путем определения индекса защиты клеток, который в положительных случаях должен быть не ниже 50%. Вычисляли ЕС₅₀ препарата и соотношение МПК/ЕС₅₀, характеризующее широту спектра его нетоксических эффективных концентраций.

Установлено, что соединение II обладает способностью подавлять репродукцию ВИЧ-1 в диапазонах концентраций от 1/3 МПК до 1/10 МПК (таблица 2). Полученные результаты подтверждены с помощью методики непрямой иммунофлуоресценции.

Заявляемые соединения могут быть использованы для разработки противовирусных средств и в качестве ключевых интермедиатов для получения новых биологически активных соединений.

Таблица1 Данные ИК, ЯМР ¹Н и ¹³С спектров соединений I-V № соеди-
нения ИК-спектр (v, см^-1) Спектр ¹Н ЯМР (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц) I 1693 (СООН), 2215 (C≡N) 0.97 (6H, с, 2СН₃); 1.00, 1.07, 1.13 (9Н, 3с, 3СН₃); 1.68 (3Н, с, СН₃-30); 2.96 (1Н, тд, J=10.7, 4.2, СН-19); 4.62 и 4.73 (2Н, 2с, СН₂-29); 6.41 (1Н, с, СН-3); 11.34 (1H, уш. c., СООН) II 1724 (СООСН₃), 2214 (C≡N) 0.94, 0.97, 0.98, 1.06, 1.13 (15Н, 5с, 5СН₃); 1.67 (3Н, с, СН₃-30); 2.99 (1Н, тд, J=11.1, 4.5, СН-19); 4.60 и 4.72 (2Н, 2с, СН₂-29); 6.40 (1Н, с, СН-3) III 2214 (C≡N) 0.79, 0.92, 0.95, 0.98, 1.01, 1.08, 1.16 (21Н, 7с, 7СН₃); 3.44 и 3.76 (2Н, 2д, J=7.7, СН₂-28); 3.52 (1Н, с, СН-19); 6.42 (1Н, с, СН-3) IV 1728 (СООСН₃), 1690 (NC=C), 2232 (C≡N), 3182 (NH₂) 0.92, 0.97, 1.00, 1.06, 1.11 (15Н, 5с, 5СН₃); 1.66 (3Н, с, СН₃-30); 2.96 (1Н, тд, J=10.8, 4.5, СН-19); 3.66 (3Н, с, СООСН ₃); 4.32 (2Н, с, NH₂); 4.60 и 4.71 (2Н, 2с, СН₂-29) V 1695 (NC=C), 2176 (C≡N), 3350 (NH₂) 0.79, 0.92, 0.94, 0.99, 1.01, 1.08, 1.15 (21Н, 7 с, 7СН₃); 3.44 и 3.76 (2Н, 2д, J=7.8, СН₂-28); 3.52 (1Н, с, СН-19); 4.37 (2Н, с, NH₂)

Таблица 2 Противовирусные свойства соединений II, III № соеди-
нения Токсичность для культур клеток, МПК (RD/MT-4), мкг/мл Противовирусные свойства ВГП-1 ВИЧ-1 ЕС50 (I₉₅) мкг/мл отношение МПК/ЕС₅₀ ЕС₅₀ (I₉₅), мкг/мл отношение МПК/ЕС₅₀ II 400/75 40,7 (42,8÷38,7) 9,8 23,4 (38,9÷7,84) 3,21 III 800/>500 43,3 (45,9÷40,7) 18,5 Н.а. Н.а. Н.а. - соединение не активно.

Изобретение относится к А-пентациклическим тритерпеноидам общей формулы:

, где R=Н, R₁=, или ; R=NH₂, R₁= или . Соединения обладают противовирусной активностью, в том числе в отношении вируса герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1 С), ВПГ-1 и ВИЧ-1, а также может быть использовано в качестве интермедиатов для новых биологически активных соединений. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 пр.

1. А-пентациклические тритерпеноиды общей формулы
,
где R=Н, R₁= или R=Н, R₁= или
R=Н, R₁= или R=NH₂, R₁= или
R=NH₂, R₁=

2. Соединение по п.1, где R=Н, R₁=, проявляющее ингибирующую активность в отношении ВИЧ-1.

3. Соединения по п.1, где R=Н, R₁= или
R=Н, R₁=, проявляющие ингибирующую активность в отношении вируса герпеса простого I типа (ВГП-1, штамм 1С).