УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к приготовлению препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации нуклеиновых кислот (fluorescent in situ hybridization - FISH), применяемой в научных и клинико-диагностических исследованиях.

В основе метода FISH лежит гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных или интерфазных клеток. ДНК-зонд несет «метку», то есть содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом или связанные с гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром. Именно наличие метки позволяет определять место связывания зонда в геноме с помощью флуоресцентного микроскопа. Метод FISH превосходит стандартный цитогенетический подход по способности выявлять как тонкие, так и сложные структурные изменения хромосом. Кроме того, в отличие от стандартного цитогенетического подхода, основанного на анализе исключительно метафазных пластинок, FISH-метод позволяет исследовать интерфазные ядра. Эта способность особенно актуальна при анализе опухолевых клеток, метафазные препараты которых часто обнаруживают плохую морфологию.

Для проведения клинико-диагностических исследований целесообразнее применять коммерческие ДНК-зонды, поскольку они стандартизованы и эффективность их использования гарантирована и проконтролирована производящей фирмой. Главным препятствием к более широкому распространению FISH-анализа являются высокие трудоемкость и себестоимость, несмотря на постоянно растущую потребность в данном анализе. Одним из способов устранения отмеченных недостатков является получение препаратов с множественными зонами одновременной гибридизации на одном предметном стекле благодаря миниатюризации отдельной зоны.

Известен способ приготовления препаратов с множественными зонами гибридизации на стекле с тефлоновым покрытием и прозрачными окошками. Недостатком способа является наличие оптической аберрации при микроскопировании, вызванной толщиной указанного покрытия. Такая аберрация ограничивает сферу применения способа. В частности, последний непригоден для FISH-анализа с помощью транслокационных зондов, которые формируют так называемые слитные (сливные) сигналы при наличии соответствующей транслокации в исследуемых клетках (Duongruitai N., Warren A.D, Olli H.T. Microbial Populations Identified by Fluorescence In Situ Hybridization in a Constructed Wetland Treating Acid Coal Mine Drainage. J. ENVIRON. QUAL., vol.35, 2006, p.1329-1337).

Известен способ приготовления препаратов для одновременного FISH-анализа большого числа (до 9) пациентов. Авторы способа достигают этого результата благодаря использованию трафарета с размерами 22×22 мм² и 9 круглыми отверстиями. Чтобы не происходила контаминация между фиксированными образцами от разных пациентов, авторы наносят через каждое отверстие в трафарете крайне малый объем суспензии фиксированных интерфазных клеток - по 0,2 мкл с клеточностью примерно 2500 клеток/мкл. Одним из недостатков способа является то, что ввиду очень малых объемов наносимой суспензии и соответственно малых размеров пятен способ пригоден исключительно для интерфазной FISH. Другой недостаток связан с отсутствием возможности разграничить пятна от различных пациентов визуально без микроскопа (например, с помощью маркера или алмазного карандаша), что не позволяет проводить гибридизацию в разных пятнах с различающимися ДНК-зондами. Данная особенность обуславливает еще один недостаток, а именно: способ не дает возможности варьировать объем наносимой гибридизационной смеси в зависимости от числа пятен. К числу недостатков следует отнести также то, что ввиду исключительно малого объема наносимых суспензий клеток фиксатор быстро испаряется, что, как правило, ухудшает качество гибридизационного сигнала (Lymphoma: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol.115, Walker JM, series editor) Humana Press; Totowa, NJ 2005, p.93-108).

Известен разработанный на микрофлюидной платформе подход «лаборатории-на-чипе» к минитюаризации FISH-анализа. 1. Sieben, V.J., Debes-Marun C.S., Pilarski, P.M. et al. 2007. FISH and chips: chromosomal analysis on microfluidic platforms. IET Nanobiotechnol. 1: 27-35; 2. Sieben V.J., Debes-Marun C.S., Pilarski L.M., and Backhouse C.J. 2008. An integrated microfluidic chip for chromosome enumeration using fluorescence in situ hybridization. Lab Chip 5:2151-2156). В соответствии с этим подходом на полностью интегрированном микрочипе гемопоэтические клетки нагреванием иммобилизуются внутри ячеек, последующие приготовление препаратов и собственно FISH-анализ проводятся в автоматическом режиме. Недостатками указанного подхода являются отсутствие его широкой доступности из-за сложности и высокой стоимости изготовления микрочипа, а также необходимость дорогостоящего дополнительного оборудования для анализа флуоресцентного сигнала от ячеек микрочипа.

Известен способ приготовления препаратов для FISH-анализа, основанный на адгезии полимерной микрофлюидной пластины размерами 20×10×1 мм с прямым микроканалом размерами 10×0,3×0,05 мм к стандартному предметному стеклу, покрытому наноструктурированным оксидом титана (TiO₂), обеспечивающему быструю и эффективную иммобилизацию живых и фиксированных гемопоэтических клеток на малой поверхности (3 мм²) - проекции микроканала на указанной пластине. Способ имеет ряд недостатков. Во-первых, способ отличается малой доступностью из-за технологической сложности изготовления микрофлюидной пластины с микроканалом и нанесения покрытия из наноструктурированного TiO₂ на предметное стекло, а также дороговизны нанесения покрытия. Другим недостатком способа является сравнительно малое количество зон гибридизации на 1 стекле, а именно: одновременно можно обеспечить всего 3 зоны гибридизации на 1 стекле благодаря использованию 3 микрофлюидных пластин (либо триплексной пластины с 3 каналами). В-третьих, ввиду малого количества клеток (≤3700), сорбируемых на малой поверхности предметного стекла, способ пригоден исключительно для интерфазной FISH.

В качестве прототипа изобретения выбран способ приготовления фиксированных клеток для FISH-анализа, в соответствии с которым наносят 5 мкл суспензии культивированных или некультивированных фиксированных клеток на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм² благодаря ее раскатыванию вдоль предметного стекла в течение 3-5 сек с помощью валика на нагревательном столике с температурой 60°C (Способ приготовления препаратов клеток для флуоресцентной in situ гибридизации: пат. RU 2390776 C1: МПК G01N 33/48, G01N 1/28 / Овсепян В.А., заявитель и патентообладатель ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России». - №2410663; заявл. 14.09.2009; опубл. 27.01.2011, Бюл. №3. - 7 с.: ил.).

Недостатком способа является то, что после удаления полоски парафильма с предметного стекла остается загрязнение («след») от нагретого и в последующем охлажденного до комнатной температуры парафильма вокруг зон гибридизации. Остающийся «след» затрудняет отмывку зон гибридизации от неспецифически связанного зонда, осложняющего оценку препарата, а также препятствует равномерному распределению контрастирующего красителя DAPI по поверхности отмытого и высушенного предметного стекла после проведения гибридизации. Загрязнение на предметном стекле обычно удаляется с помощью ватных тампонов, намотанных на тонкий (глазной) пинцет и намоченных 96% этиловым спиртом, что занимает в среднем 3-4 мин. Однако данная процедура требует повышенного внимания и аккуратности, чтобы не повредить зоны гибридизации. При этом загрязнение на предметном стекле, как правило, не удается удалить полностью. Поэтому для равномерного распределения контрастирующего красителя DAPI по поверхности стекла требуются дополнительные усилия, направленные на прижимание покровного стекла к предметному. Кроме того, отмеченная процедура связана со значительными затратами времени при проведении больших серий FISH-исследований.

Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.

Технический результат заключается в увеличении производительности труда при выполнении больших серий FISH-исследований и в повышении качества отмывки предметного стекла.

Данный технический результат достигнут тем, что разработан способ предотвращения загрязнения на предметном стекле, остающегося после удаления герметично прилепленной к нему полоски парафильма, который состоит в том, что после нанесения суспензии культивированных или некультивированных фиксированных клеток на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм², указанная полоска вместе с предметным стеклом подвергается нагреванию при 95°C в течение 2 мин и затем сразу удаляется со стекла сдиранием.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что благодаря нагреванию при 95°C в течение 2 мин. удаление полоски парафильма размерами 26×56 мм² с 8 отверстиями не оставляет загрязнения на предметном стекле.

Способ осуществляют следующим образом.

Прилепляют полоску парафильма размерами 26×56 мм² с 8 отверстиями к предметному стеклу, нагревая стекло с парафильмом при температурой 60°C и одновременной раскатывая валиком в течение 3-5 сек. На дно каждой образовавшейся лунки наносят по 5 мкл суспензии фиксированных клеток, приготовленной стандартным способом из образцов разных пациентов или одного и того же пациента, если FISH-анализ проводится с помощью большого количества различных зондов. Для FISH-анализа используют как свежеприготовленные суспензии фиксированных клеток, так и хранящиеся при -20°C. В последнем случае, если срок хранения превышает 24 час до приготовления препаратов для FISH, клетки предварительно переводят в свежий фиксатор. Это осуществляют следующим образом. Суспензию фиксированных клеток центрифугируют при 200 g в течение 10 мин, удаляют супернатант и суспендируют в свежеприготовленном фиксаторе (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении, равном 3:1). Указанную процедуру повторяют дважды.

После нанесения суспензий клеток оставляют препараты сохнуть на воздухе. Затем на обратной стороне предметных стекол обводят отверстия в полоске парафильма нефлуоресцирующим маркером. Проверяют плотность клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Нагревают предметное стекло с полоской парафильма при 95°C в течение 2 мин в термостате и быстро сдирают указанную полоску со стекла. После удаления полоски парафильма на стекле не остается никакого загрязнения. Само удаление занимает в среднем 2-3 сек.

На каждое клеточное пятно наносят по 1,2-1,4 мкл свежеприготовленной гибридизационной смеси, содержащей ингредиенты в пропорциях, рекомендуемой фирмой-производителем ДНК-зонда. Накрывают каждое пятно круглым покровным стеклом диаметром 9-10 мм и наносят по его краям резиновый клей для герметизации. Дальнейшие процедуры одновременной денатурации ДНК-зонда и ДНК мишени, гибридизации, отмывки и визуализации проводят стандартным способом в соответствии с протоколом фирмы-производителя зонда (зондов). Этап одновременной денатурации ДНК-зонда и ДНК мишени, а также их последующую гибридизацию проводится в гибридайзере «HY-Brite» (кампания «Vysis-Abbott Laboratories»). Постгибридизационную отмывку выполняют в так называемых сосудах Коплина.

При приготовлении 1 предметного стекла с 8 зонами гибридизации на процедуры удаления полоски парафильма (2-3 сек.) и предварительного нагревания при 95°C (2 мин.) суммарно расходуется в 1,5-2 раза меньше времени по сравнению с удалением пара-фильма с последующей чисткой предметного стекла с помощью ватного тампона, намоченного 96% этиловым спиртом: 122-123 (2 мин.*60 сек. + 2-3 сек.) сек. в случае подхода с предварительным нагреванием против 180-240 сек. при использовании тампона. Указанное различие становится особенно разительным с увеличением количества приготовляемых предметных стекол для гибридизации. Так, при приготовлении 5 стекол с 8 зонами гибридизации суммарное время предварительного нагревания при 95°C и удаления полоски парафильма составляет не более 135 сек (2 мин*60 сек + 5 стекла*3 сек), в то время как при использовании ватного тампона не менее 900 (5 стекла*3 мин*60 сек) сек. В этом случае указанные подходы могут различаться по времени выполнения не менее чем в 6,7 раза. Кроме того, процедура удаления полоски парафильма с применением предварительного нагревания при 95°C в отличие от таковой без нагревания, но с последующей очисткой ватным тампоном, намоченным 96% этиловым спиртом, полностью предотвращает загрязнение предметного стекла и тем самым не вызывает повышения уровня неспецифически связанного зонда, обусловленного неполным удалением загрязнения, а также обеспечивает без дополнительных усилий равномерное распределение контрастирующего красителя DAPI по поверхности стекла. Еще одним достоинством предварительного нагревания при 95°C - это способствование ускоренному «старению» (обезвоживанию) свежеприготовленных препаратов благодаря инкубации при 95°C.

Пример. Для верификации диагноза хронический миелолейкоз (ХМЛ) или оценки эффективности его терапии с помощью FISH-анализа были использованы свежеприготовленные или хранящиеся при -20°C суспензии фиксированных клеток (на самом деле, это уже не клетки, а их ядра, но чтобы сохранить терминологическую преемственность, будем и далее употреблять термин «клетки»), полученных стандартным способом из образцов костного мозга или периферической крови соответственно 9 и 12 больных. Клетки костного мозга у всех больных были предварительно культивированы в течение 24-48 час в соответствии с общепринятой методикой. Во всех случаях, когда срок хранения при -20°C превышал 24 час до приготовления препаратов для FISH-анализа, клетки переводили в свежий фиксатор. Для получения препаратов фиксированных клеток приготовили 3 стекла с парафильмово-бумажным покрытием и 8 круглыми окошками диаметром 9 мм. Внесли по 5 мкл суспензии фиксированных клеток от каждого больного в отдельную лунку. На 2 предметных стекла было нанесено по 8 образцов суспензии, а на третье - 5. После высыхания препаратов проверили плотность клеток на дне лунок с помощью фазово-контрастной микроскопии. Обвели нефлуоресцирующим маркером отверстия с обратной стороны предметных стекол. Подвергли все 3 предметных стекла с нанесенными суспензиями клеток термической обработке при 95°C в течение 2 мин. После этого сразу удалили полоски парафильма с них. На указанную процедуру потратили 6 сек (по 2 сек на каждое стекло). Приготовили гибридизационную смесь объемом 25,2 мкл, включающую 2,5 мкл транслокационного двухцветного зонда LSI BCR7ABL с двойным слиянием («Vysis-Abbott Diagnostics»), 17,6 мкл гибридизационного буфера и 5,0 мкл дистиллированной воды (пропорции ингредиентов гибридизационной смеси соответствуют рекомендациям фирмы-производителя зонда и буфера). Внесли по 1,2 мкл гибридизационной смеси в каждую лунку. Накрыли каждую смесь круглым покровным стеклом диаметром 10 мм и герметизировали его края резиновым клеем. Поставили все 3 предметных стекла на нагревательный столик гибридайзера «HYBrite». Все дальнейшие процедуры денатурации, гибридизации, отмывки и визуализации (с помощью контрастирующего красителя DAPI) выполняли в соответствии с рекомендациями фирмы «Vysis-Abbott Laboratories» и инструкциями к гибридайзеру. Проводили гибридизацию в течение 18 час. После отмывки и последующей сушки наносили 25 мкл контрастирующего красителя DAPI и накрывали каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм².

Оценивали не менее 5 метафазных клеток или не менее 200 интерфазных ядер с помощью люминесцентного микроскопа. У 5 диагностических больных присутствовали метафазные пластинки в приготовленных препаратах. У 4 больных была выявлена специфическая для ХМЛ t(9;22): ish t(9;22)(ABL1+,BCR+;BCR+,ABL1+) [5]. У 5-го диагностического больного в исследованных метафазных клетках не было обнаружено t(9;22): ish 9q34(ABL1×2),22q11.2(BCR×2) [11]. У 16 больных был проведен интерфазный FISH-анализ. У 9 из них картина флуоресцентных гибридизационных сигналов соответствовало норме: nuc ish(ABL1,BCR)×2[400]. У 7 больных обнаружили аберрантные клетки: nuc ish(ABL1,BCR)×3(ABL1 con BCR×2)[194/200] и nuc ish(ABL1,BCR)×3(ABL1 con BCR×2)[198/200].

При проведении вышеописанной серии диагностических исследований применение разработанного способа приготовления препаратов клеток для FISH-анализа с дополнительным этапом нагревания при 95°C в течение 2 мин. позволило сэкономить время на этапе очистки загрязнения, вызванного удалением полоски парафильма, не менее чем в 2,8 (3 стекла*2 мин*60 сек/2 мин*60 сек+6 сек) раза. Кроме того, данный способ в отличие от ранее запатентованного способа «Способ приготовления препаратов клеток для флуоресцентной in situ гибридизации: пат. RU 2390776 C1: МПК G01N 33/48, G01N 1/28 / Овсепян В.А., заявитель и патентообладатель ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России». - №2410663; заявл. 14.09.2009; опубл. 27.01.2011, Бюл. №3. - 7 с.: ил.» полностью предотвращает загрязнение предметного стекла, не вызывает увеличения уровня неспецифически связанного зонда, обусловленного неполным удалением загрязнения, обеспечивает без дополнительных усилий равномерное распределение контрастирующего красителя DAPI по поверхности стекла и, кроме того, благодаря инкубации при 95°C способствует ускоренному «старению» свежеприготовленных препаратов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации нуклеиновых кислот (fluorescent in situ hybridization - FISH). Для этого наносят 5 мкл суспензии на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм² благодаря ее раскатыванию вдоль предметного стекла в течение 3-5 сек с помощью валика на нагревательном столике с температурой 60°C. При этом указанная полоска вместе с предметным стеклом подвергается нагреванию при 95°C в течение 2 мин и затем сразу удаляется со стекла сдиранием. Изобретение обеспечивает повышение качества отмывки предметного стекла, не вызывает увеличения уровня неспецифического связывания зонда, обеспечивает равномерное распределение контрастирующего красителя на поверхности стекла при выполнении FISH-исследований. 1 пр.

Способ приготовления фиксированных клеток для FISH-анализа, заключающийся в том, что наносят 5 мкл суспензии на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм² благодаря ее раскатыванию вдоль предметного стекла в течение 3-5 с с помощью валика на нагревательном столике с температурой 60°C, отличающийся тем, что указанная полоска вместе с предметным стеклом подвергается нагреванию при 95°C в течение 2 мин и затем сразу удаляется со стекла сдиранием.