СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ДИУРЕТИЧЕСКОЙ И АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2013 года по МПК A61K36/80 B01D11/02 A61P7/10 

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и касается создания средства растительного происхождения на основе биологически активных веществ льнянки обыкновенной Linaria vulgaris Mill (сем. Scrophulariaceae), обладающей диуретической активностью.

Диуретические средства находят широкое применение в медицинской практике. Их активно назначают при заболеваниях сердечно-сосудистой системы: при отеках, связанных с хронической сердечной недостаточностью, в терапии больных гипертонической болезнью. Очень часто эти заболевания сопровождаются образованием сосудистых тромбов, чем обусловлено применение антикоагулянтных средств в комплексной терапии. В настоящее время доказана эффективность применения лекарственных препаратов из растительного сырья для лечения заболеваний сердечно - сосудистой системы, при этом фитопрепараты не оказывают побочного действия и безвредны при длительном применении.

Известен ряд растительных средств, оказывающих диуретическое действие. Диуретическая активность обнаружена у извлечений из подземных органов сабельника болотного [Патент RU 2318531 C1], у листьев груши и травы горцев незамечаемого и разнолистного [Денисенко О.Н. Фармакогностическое изучение растений диуретического действия видов груши и горца птичьего в условиях юго-востока Украины, автореф. дисс. на соиск. ученой степени канд. фарм. наук, 1991, Львов], у толокнянки обыкновенной, брусники [Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. М., 1982.]. Известно использование листьев хвоща полевого в качестве диуретического средства. Отвар готовят из резаной травы, брикетов и гранул из травы хвоща полевого [Машковский М.Д. «Лекарственные растения», Харьков, Торсинг, 1997, Изд. 13, т.1, с.498]. Антикоагулянтная активность обнаружена у извлечений из растений одуванчика лекарственного [Патент RU 2085205 С1], пиона древовидного [Патент RU 93033687 A].

Наиболее близким по комплексности действия и способу получения является средство, включающее сухие экстракты травы горца птичьего, листьев ортосифона, листьев толокнянки обыкновенной и обладающее диуретической и гипоазотемической активностями [Патент RU 2008142861 А], взятое нами за прототип.

Основные недостатки прототипа

1. Технология получения средства многостадийна: каждое сырье экстрагируют отдельно.

2. Температура экстракции может достигать 80°С, что ведет к дополнительным затратам.

3. Средство не обладает антикоагулянтной активностью.

Целью изобретения является получение препарата на основе травы льнянки обыкновенной и выявление его диуретического и антикоагулянтного действия.

Для достижения указанной цели сырье льнянки обыкновенной, измельченное до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм и отсеянное от пыли экстрагировали методом ремацерации с делением экстрагента на 3 части с нагреванием и подключением вакуума на стадии слива. Сырье последовательно настаивали с первой частью экстрагента (5 частей), затем со второй и третей (по 2,5 части каждая), каждый раз сливая вытяжку. В качестве экстрагента используют 60%-ный этанол. Время настаивания с каждой частью экстрагента 40 мин при температуре 42°С. Полученную вытяжку сгущали в роторном выпарном аппарате при температуре 60-70°С, затем высушивали в сушильном шкафу при температуре 60°С. Выход готового продукта составляет 24% от массы растительного сырья. В дальнейшем цель достигается проведением экспериментов, характеризующих силу мочегонного эффекта льнянки обыкновенной.

Конечный продукт имеет следующие качественные и количественные характеристики.

Анализ на содержание флавоноидов:

Сухой экстракт (0,1 г) растворяют в 10 мл 60% этилового спирта

1. К 3 мл раствора прибавляют 1 мл 2% раствора алюминия хлорида, появляется желтое окрашивание.

2. К 3 мл раствора прибавляют 10 мг кристаллического магния и 5 капель концентрированной хлороводородной кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, появляется оранжево-красное окрашивание.

Количественное содержание флавоноидов:

Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито по ГОСТ 214-83 с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска) сырья помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл со шлифом, прибавляют 100 мл 60%-ного этанола. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин, считая с момента закипания экстрагента. Колбу охлаждают до комнатной температуры, извлечение фильтруют через ватный тампон в плоскодонную мерную колбу вместимостью 100 мл и через этот же фильтр доводят объем раствора 60%-ным этанолом до метки. Полученное извлечение фильтруют в колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают; 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 60%-ным этанолом до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 332 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 60%-ый этиловый спирт. Содержание суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной в пересчете на ацетилпектолинарин вычисляют по формуле:

$$x\left(\%\right)=\frac{A\cdot 100\cdot 50\cdot 100\%}{379\cdot m\cdot V\cdot \left(100-w\right)}$$

где А - оптическая плотность исследуемого раствора; m - навеска сырья, г; V - объем раствора А, взятого для разбавления; 100 - объем раствора А, мл; 50 - объем раствора Б, мл; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; 379 - удельный показатель поглощения ацетилпектолинарина при длине волны 332 нм.

Анализ содержания иридоидов:

Сухой экстракт (0,1 г) растворяют в 10 мл 60% этилового спирта.

1. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Трим-Хилла (смесь, состоящая из 5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, 10 мл 0,2% раствора сульфата меди и 100 мл ледяной уксусной кислоты), нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин, появляется синее окрашивание.

2. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Шталя (1 г n-диэтиламинобензальдегида, 5 г фосфорной кислоты и 50 г уксусной кислоты, разбавляют водой до 100 мл), доводят до кипения на водяной бане, появляется сине-голубое окрашивание.

Количественное содержание иридоидов:

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 2,0 г (точная навеска) измельченного и отсеянного от пыли сырья помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 0,05 карбоната кальция и 50 мл 20% спирта этилового. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 40 мин. Горячее извлечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 50 мл. После охлаждения объем извлечения доводят до метки спиртом этиловым 20% и перемешивают. Полученный раствор переносят в плоскодонную колбу вместимостью 100 мл с 1,0 г нейтральной окиси алюминия, перемешивают на шейкере в течение 20 мин и фильтруют через бумажный фильтр.

Для фотоколориметрического определения берут 1 мл полученного раствора в пробирку, добавляют 0,5 мл реактива Трима-Хилла (HCl конц.; 0,2% CuSO₄; СН₃СООН лед.) и 2,5 мл 50%-ной уксусной кислоты. Полученный объем нагревают на водяной бане 15 мин, охлаждают и определяют оптическую плотность при длине волны 590 нм (желтый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см. В качестве раствора сравнения используют смесь из 1 мл спирта этилового 20%, 0,2 мл реактива Трима-Хилла и 2,5 мл 50% уксусной кислоты. Содержание иридоидов определяют по калибровочному графику, где по оси ординат обозначена оптическая плотность раствора (D), а по оси абцисс - концентрация аукубина (мкг/мл).

Содержание суммы иридоидов в пересчете на аукубин в процентах на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

Х=С*50*100*100/m*(100-W)*1000*1000, где

С - содержание суммы иридоидов в пересчете на аукубин, найденное по графику, мкг/мл; m - навеска сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

Способ получения средства иллюстрируется следующим примером:

0,1 кг травы льнянки обыкновенной (только надземная часть) измельчают до размера частиц <0,25≤2,0. Измельченное сырье загружают в экстрактор, заливают 500 мл 60%-ный этанола и экстрагируют в течение 40 мин при температуре 42°С. Полученное извлечение сливают при подключении вакуума. Частично истощенное сырье вновь заливают 250 мл 60%-ого этанола и настаивают аналогично первому этапу экстракции. Всего процедура настаивания повторяется 3 раза. Общий расход экстрагента 1000 мл, что соответствует соотношению сырье - экстрагент 1:10. Полученную вытяжку сгущают в роторном выпарном аппарате при температуре 60-70°С, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 60°С. Получают 0,024 кг готового продукта, что составляет 24% сухого экстракта от массы исходного сырья. Экстракт спиртовый сухой представляет собой массу черно-коричневого цвета. Содержание флавоноидов в экстракте составляет 23.7±0.20%, иридоидов 0.28±0.001%, влажность 7.9±0.10%.

Предлагаемый способ получения позволяет получить продукт постоянного состава, предотвращает желирование получаемого извлечение и потерю биологически активных веществ. Способ получения может быть внедрен на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.

Испытания

Проведение экспериментальных исследований токсичности и специфической активности травы льнянки обыкновенной.

1. Изучение острой токсичности.

Изучение острой токсичности экстрактов проводили на белых мышах по Прозоровскому [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективности дозы и ее ошибки. // Фармакол. и токсикол. - 1978 - №4 - С.497-503.]. Сухой экстракт льнянки обыкновенной, разведенный в воде дистиллированной, исследовали при однократном пероральном введении в дозах 1000 мг/кг, 2000 мг/кг, 5000 мг/кг.

Исследования, проводимые на белых мышах с широким диапазоном доз, ставили своей целью возможность выявления токсических эффектов различной степени тяжести и даже летальных исходов. Льнянка обыкновенная не оказывает токсического действия на экспериментальных животных даже при введении высоких концентраций. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты определения острой токсичности сухого экстракта льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris) Экстракт (экстрагент) Количество животных в эксперименте Количество погибших животных Выжившие животные, % ЛД₅₀, мг/кг Травы хвоща полевого (вода) 6 0 100 >5000 Травы льнянки обыкновенной (60% этанол) 6 0 100 >5000

Как видно из таблицы, пероральное введение экстрактов исследуемого растения в указанных дозах не вызывало гибели животных. В пяти экспериментальных группах животных, получавших экстракты, не отмечалось визуальных изменений по сравнению с контрольной группой животных. Определение ЛД₅₀ для мышей не представляется возможным. Дальнейшее увеличение дозы экстрактов нецелесообразно в связи с отсутствием токсичности в дозе 5000 мг/кг и со сложностью введения большего количества экстракта. Основываясь на полученных результатах можно сделать вывод о практической безвредности экстрактов льнянки обыкновенной и их принадлежности к 4 классу опасности (вещества малоопасные) по ГОСТ 12.1.007-76, (средняя смертельная доза при введении в желудок более 5000 мг/кг).

2. Изучение диуретической (мочегонной) активности.

Диуретическую активность экстракта травы льнянки обыкновенной оценивали в соответствии с «Методическими рекомендациями» (1989). Опыты проведены на белых крысах мужского пола линии Wistar массой 190-200 г. Экстракт травы льнянки обыкновенной без применения водной нагрузки вводили однократно перорально в дозе 50 мг/кг, растворенный в 5 мл воды дистиллированной. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество воды дистиллированной по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали хвощ полевой, приготовленный по ГФ XI с последующей отгонкой экстрагента (воды дистиллированной) до сухого состояния. Полученный экстракт вводили в дозе 50 мг/кг по вышеприведенной схеме. Сбор мочи осуществляли в обменных клетках в течение 6 часов после введения экстракта. Измеряли объем выделенной мочи. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Изучение диуретической активности сухого экстракта травы льнянки обыкновенной (Linaria vulgaris) Экстракт (экстрагент) Объем мочи Первые 3 часа Общий за 6 часов Контроль, мл Опыт, мл Изменение объема мочи, % Контроль, мл Опыт, мл Изменение объема мочи, % Травы хвоща полевого (вода) 1.22±0.44 2.0±0.046 64 1.30±0.45 2.61±0.16 100 Травы льнянки обыкновенной (60%этанол) 2.3±0.87 86 3.14±0.38 141

Как следует из данных, приведенных в таблице 2, однократное введение сухого экстракта в указанной дозе оказывало выраженное стимулирующее действие на экскрецию воды. При этом диуретическая активность испытываемого экстракта превосходила за 6 часов таковую на 41% у препарата сравнения.

3. Изучение антикоагулянтной активности.

Оценку антикоагулянтной активности проводили in vitro с помощью коагулометра «Minilab-701» в концентрации 1 мг/мл. Для исследования использовали кровь собаки, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. В качестве индуктора свертывания крови использовали 0,28% раствор хлорида кальция. Эталоном антикоагулянтной активности служил гепарин, который испытывали в концентрации 1 ЕД/мл в аналогичных условиях. Эффекты всех фармакологических испытаний считали достоверными при Р≤0,05 [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963]. Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3 Антикоагулянтная активность сухого экстракта льнянки обыкновенной № Экстракт, препарат сравнения Время свертывания Изменение свертываемости, % Р контроль опыт 1 Экстракт льнянки обыкновенной 21.9±0.91 25.2±0.65 -15.1 <0.01 2 гепарин 29.9±0.48 36.6±1.82 -22.4 <0.01

Как следует из данных таблицы 3, экстракт льнянки обыкновенной обладает антикоагулянтной активностью. Он достоверно замедляет время свертывания крови на 15%.

Установлено, что трава льнянки обыкновенной обладает высокой диуретической и антикоагулянтной активностью. Одновременное сочетание антикоагулянтных и диуретических свойств позволяет применять препарат для профилактики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, часто осложняющихся тромбообразованием и сопровождающихся повышением объема циркулирующей крови.

Сущность изобретения состоит в том, что предложен способ получения препарата из растения, обладающего диуретическим и антикоагулянтным действием, не применявшегося ранее в научной медицине.

Литература

1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963.

2. Денисенко О.Н., Фармакогностическое изучение растений диуретического действия видов груши и горца птичьего в условиях юго-востока Украины, автореф. дисс. на соиск. ученой степени канд. фарм. наук, 1991, Львов.

3. Машковский М.Д. «Лекарственные растения», Харьков, Торсинг, 1997, Изд. 13, т.1, с.498.

4. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективности дозы и ее ошибки. // Фармакол. и токсикол., 1978, №4, С.497-503.

5. Способ получения комплекса, обладающего фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной активностью Патент RU №93033687 А от 20.11.1995.

6. Способ получения средства, обладающего диуретической и противовоспалительной активностью Патент №2318531 С1 от 10.03.2008.

7. Средство, обладающее антикоагулянтным действием Патент RU 2085205 С1 от 27.07.1997.

8. Средство, обладающее диуретической и гипоазотемической активностью (варианты), и способ его получения Патент №2008142861 А от 10.05.2010.

9. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н., лекарственные растения СССР и их применение. М., 1982.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается создания средства растительного происхождения на основе биологически активных веществ льнянки обыкновенной, обладающего диуретическим и антикоагулянтным действием. Способ получения средства, обладающего диуретическим и антикоагулянтным действием, состоит в том, что проводят экстракцию измельченной травы льнянки обыкновенной этиловым спиртом при последовательном настаивании тремя частями экстрагента, методом ремацерации с нагреванием и подключением вакуума на стадии слива при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет получить средство, обладающее высокой диуретической и антикоагулянтной активностью. 3 табл., 1 пр.

Способ получения средства, обладающего диуретическим и антикоагулянтным действием, состоящий в том, что экстракцию измельченной травы льнянки обыкновенной проводят 60% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:10 при последовательном настаивании с 5, 2,5 и 2,5 частями экстрагента методом ремацерации с делением экстрагента на 3 части с нагреванием и подключением вакуума на стадии слива, причем время настаивания с каждой частью экстрагента 40 мин при температуре 42°С, и полученную вытяжку сгущают в роторном выпарном аппарате при температуре 60-70°С, а затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 60°С.