Средство растительного происхождения, обладающее непрямым антикоагулянтным, антибактериальным и противогрибковым действием Российский патент 2024 года по МПК A61K36/30 A61P7/02 A61P31/04 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к биологически активным суммарным комплексам растительного происхождения.

Высокая летальность от сердечно-сосудистых заболеваний обусловлена формированием тромбов: практически у каждого второго умершего от сердечной патологии на вскрытии был обнаружен тромбоз сосудов. В связи с этим специалисты-кардиологи рекомендуют начинать использовать антикоагулянты сразу после диагностирования заболеваний сердца и сосудов. Раннее их применение позволяет предотвратить формирование сгустка крови, его увеличение и закупоривание сосудов.

По механизму действия выделяют антикоагулянты быстрого прямого действия («прямые» антикоагулянты) и антикоагулянты непрямого длительного действия.

Антикоагулянты прямого действия инактивируют находящиеся в крови факторы свертывания крови (https://www.rlsnet.ru/library/books/farmakologiya.krylov.bobyrev.m1999/98-2.2.5.2.1.-antikoagulyanty). Они воздействуют непосредственно на активный тромбин, ингибируют тромбин-индуцируемый переход фибриногена в фибрин и тормозят процесс тромбообразования. Чтобы избежать внутренних кровотечений, необходимо контролировать показатели свертывающей системы крови (https://clinic-a-plus.ru/articles/gematologiya/16127-antikoagulyanty-deystvie-spisok-preparatov-vidy-pryamye.html).

Антикоагулянты прямого действия применяются, как правило, в острых состояниях. Они имеют ряд побочных действий: возможны кровотечения в ЖКТ и мочевых путях, кровотечение в месте введения, в областях, подвергающихся давлению, из операционных ран, а также кровоизлияния в других органах, гематурия, тромбоцитопения. Тромбоцитопения может быть тяжелой вплоть до летального исхода с последующим развитием некроза кожи, артериального тромбоза, сопровождающегося развитием гангрены, инфаркта миокарда, инсульта.

Такие эффекты обуславливают множество противопоказаний к применению антикоагулянтов прямого действия.

Ниже указаны известные из уровня техники источники, касающиеся антикоагулянтов, а также антибактериальных и противогрибковых средств.

1. Наиболее популярным представителем антикоагулянтов прямого действия является гепарин и его производные. Гепарин подавляет склеивание тромбоцитов и ускоряет ток крови в сердце и почках. В то же время он взаимодействует с макрофагами и белками плазмы, что не исключает возможности тромбообразования. Препарат снижает артериальное давление, оказывает гипохолестеринемическое действие, усиливает проницаемость сосудов, подавляет пролиферацию клеток гладкой мускулатуры, способствует развитию остеопороза, угнетает иммунитет и повышает диурез. https://clinic-a-plus.ru/articles/gematologiya/16127-antikoagulyanty-deystvie-spisok-preparatov-vidy-pryamye.html.

2. Известен антикоагулянт растительного происхождения, прототипом которого указан гепарин, представляющий собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, получаемый экстракцией водой при кипячении, с последующей многостадийной обработкой (патент RU 2399377 С1, опубл.20.09.2010).

3. В описании изобретения к патенту РФ №2601407 («Средство, обладающее антиагрегантной и антикоагулянтной активностью», опубл. 10.11.2016) указано на возможность прямой антикоагулянтной активности средства, которое представляет собой этанольный экстракт коры корней Maackia amurensis Rupr ct. Maxim, содержащий комплекс изофлавоноидов, состоящий из 7-О-гентиобиозидов даидзеина, генистеина, афромозина, псевдобаптигенина, формононетина и 5-О-метилдаидзеина, 7-O-P-D-глюкопиранозидов даидзеина и генистеина, 7-О-примверозидов псевдобаптигенина и формононетина, 3-О-гентиобиозидов маакиаина и медикарпина.

Антикоагулянты непрямого действия не влияют на активность уже образовавшихся факторов свертывания крови, их эффект развивается медленно. Механизм действия антикоагулянтов непрямого действия связан с торможением синтеза в печени факторов свертывания крови II (протромбина), VII (проконвертина), IX (кристмас-фактора) и X (стюарт-прауэр-фактора). Образование этих факторов зависит от витамина К₁, который необходим для пострибосомальной трансформации их предшественников. Витамин К₁ превращается в активную форму в микросомах печени под влиянием эпоксидредуктазы. Антикоагулянт непрямого действия блокируют данный фермент и вследствие этого препятствуют синтезу указанных выше факторов свертывания крови. Определенное значение в эффекте антикоагулянтов непрямого действия имеет также их способность активировать синтез антитромбина III (https://studfile.net/preview/4334051/page:3/).

Антикоагулянты как прямого, так и непрямого действия применяют для профилактики и лечения тромбозов, тромбофлебитов и эмболий при заболеваниях вен, сердечных заболеваниях, в том числе при операциях на сосудах (https://www.rlsnet.ru/library/books/rls-pacient-2003/172-3.6.2.-antikoagulyanty).

Созданию и разработке антикоагулянтов непрямого действия посвящены изобретения, на которые выданы следующие патенты (4-7):

4. патент РФ №2193559 (опубл. 27.11.2002) на изобретение «2,4-Ксилидид и м-фенетидид 2-ацетилиминокумарин-3-карбоновой кислоты, обладающие антикоагулянтной активностью»;

5. патент РФ №2671983 (опубл. 08.11.2018) на изобретение «Антикоагулянтное средство непрямого действия на основе диуманкала». Изобретение касается непрямого антикоагулянта на основе известного соединения из производных кумарина;

6. патент РФ №2672062 (опубл. 09.11.2018) на изобретение «Гибридные кумарины, обладающие непрямым антикоагулянтным действием» (предложены соединения гибридных молекул фенолокислота-кумарин приведенных в описании изобретения формул).

7. Основным антикоагулянтом непрямого действия, применяемым в настоящее время, является синтетический препарат «Варфарин» (https://zdorov.ru/catalog/344/364/527/varfarin-132441 ?utm_referrer=https%3 A%2F%2Fwww.google.com%2F).

Варфарин подавляет в печени синтез витамин-К-зависимых факторов свертывания крови (II, VII, IX и X) и белков С и S в печени. Оптимальное антикоагулянтное действие наблюдается на 3-5 день от начала применения и прекращается через 3-5 дней после приема последней дозы.

Поскольку заявляемое средство непрямого антикоагулянтного действия представляет собой извлечение из надземной части растения рода Nonea, ниже приведены сведения из уровня техники об антикоагулянтных свойствах извлечений из растений данного рода.

Род Nonea включает более 30-ти видов растений. В России широко распространены 5 видов: N. lutea DC., N. flavescens Fisch & C.A. Mey, N. Rosea Link., N. caspica G. Don, и N. rossica Steven., из которых нонея русская имеет самый большой ареал и достаточную ресурсную базу на территории России.

8. Во 2-м томе научной монографии Н.А. Николаева, М.А. Ливазана, Ю.П. Скирденко, А.И. Мартынова «Биологически активные растения и грибы Сибири в клинической медицине» (Омский гос.мед. ун-т. - М.: Издательский дом Академии Естествознания, 2019. - 388 с.; нонея - с. 91) содержатся сведения о том, что настой и отвар, т.е. водное извлечение из травы Nonea pulla DC (нонеи темно-бурой) оказывает антикоагулянтное действие, но не указано, какое именно - прямое или непрямое.

Вероятнее всего в этом случае имеет место прямое антикоагулянтное действие, характерное для пептидных соединений. Важно отметить общеизвестный факт, что этанол (а также ацетон и другие органические растворители) денатурирует белки. В результате происходит агрегация белковых частиц и их осаждение, что приводит к предположению, что в настое и отваре содержатся пептиды, а такие препараты обладают свойствами прямых антикоагулянтов.

9. Известно, что продукт извлечения из травы Nonea pulla (нонеи темной, или темно-бурой) 0,01 М раствором аммиака обладает прямым антикоагулянтным действием (Губаев А.Г. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная: автореф. дис. Челябинск, 1996. https://medical-diss.com/medicina/farmakologicheskie-svoystva-antikoagulyanta-pryamogo-deystviya-iz-travy-noneya-temnaya). Автор связывает прямое антикоагулянтное действие с веществами пептидной структуры.

Из уровня техники известен ряд нижеуказанных способов получения растительных экстрактов, обладающих комплексной активностью, в т.ч. антикоагулянтной.

10. Патент РФ №2504391 на изобретение «Способ получения растительного средства, обладающего антикоагулянтным, гипотензивным и диуретическим действием» (опубл. 20.01.2014). Экстракт из травы коровяка черного получают с помощью 60%-го этилового спирта.

11. Патент РФ №2199331 на изобретение «Способ получения средства, обладающего антикоагулянтным, фибринолитическим, антитромбоцитарным, антитромботическим и тромболитическим действием» (опубл. 27.02.2003). Экстракт из сухих корней пиона Paeonia officinalis получают с помощью дистиллированной воды.

12. Патент РФ №2143270 на изобретение «Способ получения препарата, обладающего фибринолитической, антитромбоцитарной, антикоагулянтной и антидиабетогенной активностями» (опубл. 27.12.1999). Целевой продукт выделяют из коры корней пиона Paeonia lutea, с помощью 40%-го этиловго спирта.

13. Патент РФ №2491951 на изобретение «Способ получения растительного средства, обладающего диуретической и антикоагулянтной активностью» (опубл. 10.09.2013). Проводят экстракцию из измельченной травы льнянки обыкновенной этиловым спиртом.

Вышеприведенные (10-13) источники не касаются растения нонея русская, а также не упоминают о непрямой антикоагулянтной активности полученных экстрактов.

Частота возникновения серьезных осложнений антибиотикотерапии -развитие аллергических реакций, нарушение колонизационной резистентности кишечника, формирование антибиотикорезистентных штаммов бактерий и грибов - определяет важность поиска альтернативных противомикробных и противогрибковых средств. Лекарственные растительные препараты выглядят особенно перспективно в этом отношении.

Высокопатогенным микроорганизмом является Candida albicans, возбудитель оппортунистических инфекций человека, для лечения которых используется широкий спектр антимикотических препаратов (нистатин, амфотерицин В, производные азола), но часто они имеют низкую эффективность по отношению к грибам, т.к. штаммы сформировали со временем устойчивость к данным препаратам.

Bacillus cereus ассоциирован с употреблением гамбургеров, сырого и жареного риса. Вызывает пищевые токсикоинфекции у человека (включая рвотный и диарейный синдром), продуцирует энтеротоксины. Отмечены случаи развития менингоэнцефалита у недоношенных младенцев (https://ru.wikipedia.org/wiki/Bacillus_cereus).

14. В работе «Сравнительная оценка антимикробной активности некоторых перспективных лекарственных растений» авторов И.С.Андреевой, И.Е. Лобановой, Г.И. Высочиной, Н.А. Соловьяновой (Растительный мир Азиатской России, 2018, №1(29), с. 91-99) приведены результаты исследования антимикробной активности водных и водно-этанольных экстрактов 14 видов лекарственных растений в отношении 9 тест-штаммов патогенных микроорганизмов.

Активностью относительно ряда грамположительных бактерий, в т.ч. Staphylococcus aureus, и штамма дрожжеподобного гриба Candida albicans, обладали экстракты пяти из четырнадцати исследованных растений, в числе которых отсутствовала нонея русская.

15. Изучена фунгистатическая активность экстрактов из некоторых растений (Фунгистатическая активность экстрактов из некоторых дикорастущих растений Якутии/ Сивцева С.В., Охлопкова Ж.М. //https://cyberleninka.ru/article/rL/fungistaticheskaya-aktivnost-ekstraktov-iz-nekotoryh-dikorastuschih-rasteniy-yakutii).

Однако в данной публикации не упоминается нонея русская, а фунгистатическая активность изучалась в отношении патогенных грибов рода Aspergillus.

16. Имеется публикация, касающаяся нонеи русской, из которой известно следующее: «Растение обладает антибактериальными и противовоспалительными свойствами. Настои и отвары нонеи обладают выраженным антикоагулянтным действием - замедляют свертываемость крови» (http://medonos-rasteniya.ru/HTML/1.4/Nonea_rossica.htm).

В публикации отсутствуют сведения о том, извлечение из каких частей растения (корней или надземной части) проявляет указанные эффекты, не указан характер антикоагулянтного действия водного экстракта - прямой или непрямой, не упоминаются спиртовые извлечения, а также в отношении каких бактерий растение обладает антибактериальной активностью. Не упоминается фунгистатическая активность извлечения.

Раскрытие сущности изобретения

Заявляемое средство представляет собой продукт извлечения 40-70% этиловым спиртом из надземной части растения вида Nonea rossica, обладающий непрямым антикоагулянтным, антибактериальным в отношении Bacillus cereus и противогрибковым в отношении Candida albicans действием.

Технические результаты:

реализация назначения, а именно, создание средства, обладающего:

• свойством антикоагулянта непрямого действия и дополнительно:

• антибактериальной активностью в отношении Bacillus cereus,

• противогрибковой активностью в отношении Candida albicans. Обнаруженная комплексная фармакологическая активность

заявляемого средства важна, например, при COVID-19, когда возникает риск тромбообразования и за счет ослабления иммунитета возрастает вероятность присоединения грибковой и бактериальной инфекции.

Получение этанольного экстракта из надземной части растения нонея русская

Для получения экстракта точные навески измельченного до размера частиц 1 мм воздушно-сухого сырья из травы (надземной части) нонеи русской помещали в колбу и заливали спиртом этиловым в весовом соотношении сырья и этилового спирта соответственно 1:(10-20). Использовали спирт этиловый различных концентраций: 70%, 40%. Колбу с присоединенным обратным холодильником выдерживали на водяной бане при температуре 55°С 60 минут, охлаждали при непрерывном перемешивании в течение 60 минут.После охлаждения экстракт центрифугировали со скоростью 8000 об/мин в течение 15 минут для удаления мелкодисперсных примесей. Надосадочную жидкость сливали.

Для исследования антикоагулянтной активности удаляли экстрагент конвективной сушкой при температуре 30-40°С и получали готовый сухой экстракт, который растворяли в воде перед внутрижелудочным введением животным, т.к. для животных нежелательно введение спирта.

В микробиологических исследованиях использовали жидкое спиртовое извлечение, т.е. экстракт вместе с экстрагентом.

Состав биологически активных соединений в экстрактах, полученных с помощью 40%-го и 70%-го этанолов, практически совпадает. Это видно из табл.1 и фиг.1.

На фиг.1 показаны УФ-спектры извлечений из травы нонеи русской, полученные с использованием экстрагентов: 1 - 70%-го этанола, 2 - 40%-го этанола. Приведенные графики показывают совпадение состава биологически активных соединений в экстрактах, полученных с помощью указанных экстрагентов.

Эксперименты, подтверждающие непрямое антикоагулянтное действие заявляемого средства

В качестве препарата сравнения был выбран синтетический препарат «Варфарин» - основной антикоагулянт непрямого действия, применяемый в настоящее время.

Исследование было проведено in vivo, в эксперименте задействовано 36 крыс-самцов линии Wistar массой 200-220 г.

Животные были разделены на четыре группы по 9 крыс в каждой.

Всем крысам один раз в сутки в течение 4-х дней внутрижелудочно вводили воду дистиллированную (1-я группа, контрольная) или нижеуказанные вещества (2-4 группы) в объеме дистиллированной воды, полученном из расчета 0,5 мл на 100 г веса животного.

Животные второй группы получали сухой водный экстракт из травы нонеи русской в дозе из расчета 1,7 г экстракта на 1 кг веса животного, животные третьей группы - сухой этанольный экстракт из травы нонеи русской в такой же дозе, в четвертой группе животные получали варфарин в дозе из расчета 0,215 мг/кг. Рассчитанные для каждого животного дозы веществ растворяли в вышеуказанном рассчитанном для каждого животного объеме дистиллированной воды и вводили соответствующим животным.

Оценку антикоагулянтного действия проводили с использованием протромбинового теста. Метод основан на определении времени свертывания цитратной плазмы крови под действием смеси тромбопластина и ионов кальция (Миронов А.Н., Бунятян Н.Д., Васильев А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К., 2012. - 944 с.). Протромбиновое время (ПВ) используют для контроля за лечением антикоагулянтами непрямого действия, его результаты зависят от активности факторов II, VII, X, V» из (Нетесин Е.С., Кузнецов С.М., Голуб И.Е. Клинико-лабораторный контроль антикоагулянтной терапии // Сибирский медицинский журнал, 2007, №3. С.109-113).

Определяли время от момента добавления тромбопластина и ионов кальция к исследуемой плазме до момента образования сгустка фибрина. Время образования сгустка фибрина зависит от активности факторов внешнего и общего пути свертывания (II, V, VII, X).

По результатам экспериментов вычисляли среднее значение протромбинового времени и стандартную ошибку среднего. Проверка нормальности распределения количественных признаков проведена с использованием критерия Шапиро-Уилка. Достоверность различий между группами оценивали по критерию Манна-Уитни.

Показано, что на 5-е сутки от начала эксперимента антикоагулянтная активность плазмы крови у животных второй группы не изменялась относительно контрольных значений. Данный факт объясняется отсутствием в водном экстракте фракции гидрофобных лактонных соединений, которые являются ведущими ингибиторами синтеза факторов свертываемости крови (антикоагулянтами непрямого действия) растительного происхождения.

У животных третьей группы протромбиновое время увеличилось в 2,3 раза по сравнению с контролем, эквивалентное действие обнаружилось в четвертой группе, в которой животным вводили синтетический препарат сравнения - варфарин.

Установленная антикоагулянтная активность спиртового извлечения обусловлена гидрофобными свойствами лактонных (кумаринподобных) соединений, отсутствующих в водных извлечениях. Но исследованная качественная реакция на содержание 4-оксикумарина (Способ качественного определения 4-оксикумарина //патент SU1182348, авторы Григорьев О.А., Хабаров А.А., Кобелев С.Н.), производные которого обладают непрямым антикоагулянтным действием, в полученном спиртовом извлечении была отрицательной.

На уровне значимости 0,99 спиртовый экстракт из растения нонея русская не отличается по своему антикоагулянтному действию от синтетического препарата варфарин, но при этом является менее дорогостоящим.

Эксперименты, подтверждающие антибактериальное и противогрибковое действие заявляемого средства

Антимикробную активность определяли методом серийных разведений (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.). При этом штаммы микроорганизмов культивировали на питательных средах, в которые добавляли исследуемый экстракт (извлечения из травы нонеи русской, полученные с использованием в качестве экстрагента спирта этилового указанных выше концентраций).

В качестве тест-культур использованы штаммы грамположительных бактерий Bacillus cereus АТСС 10702, а также грибов вида Candida albicans NCTC 885-653 из коллекции Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ), г. Оболенск.

Культивирование микроорганизмов проводили на агаровой и бульонной средах Мюллер-Хинтон в аэробных условиях при температуре +37°С. Микроорганизмы культивировали в течение двух суток, на 2-е сутки вносили спиртовое извлечение из травы нонеи русской. Анализ противомикробной активности проводили методом последовательных разведений в жидкой среде в общем объеме 1 мл. Вносимую дозу микроорганизмов определяли по Мс Farland и контролировали количество жизнеспособных клеток высевом на плотную питательную среду. Вносимые дозы культур составили (инокулюм КОЕ/0,1 мл) - (6,50±0,76)×10³ и (1,06±0,09)×10³ для B. cereus и С. albicans соответственно.

Отсутствие признаков роста в жидкой среде контролировали путем высева на поверхность агаровой среды с последующей инкубацией в стандартных условиях. В качестве отрицательного контроля для проверки жизнеспособности микроорганизмов тест-культуру без добавления извлечения вносили в 1 мл бульона и культивировали в тех же условиях с последующим посевом на агаровую питательную среду и учетом роста микроорганизмов.

Для исключения подавляющего влияния на рост микроорганизмов экстрагента (спирта этилового 40%-го, 70%-го) проводили контрольный опыт - 100 мкл этанола соответствующей концентрации добавляли к 900 мкл среды.

Для каждого извлечения, проявившего антимикробную активность, определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) - наименьшую дозу вещества, полностью подавляющую рост микроорганизмов.

Для количества колониеобразующих единиц были рассчитаны значения средних величин и стандартного отклонения.

Исследование антимикробной активности суммарных извлечений из надземной части нонеи русской показало их высокую бактериостатическую активность в отношении В.cereus и фунгистатическую активность в отношении C.albicans.

Жидкое спиртовое извлечение (экстракт вместе с экстрагентом) из травы нонеи русской, полученное с помощью 70%-го этанола, в объеме 100 мкл, содержало 3,5 мг (сухого) экстракта, в объеме 50 мкл - 1,75 мг экстракта. Извлечение, полученное с помощью 40%-го этанола, в объеме 100 мкл, содержало 3,2 мг экстракта, в объеме 50 мкл - 1,6 мг экстракта.

Жидкие спиртовые извлечения, полученные из травы нонеи русской как с помощью 70%-го, так и с помощью 40%-го этанола, в объеме 100 мкл полностью ингибировали рост культур В.cereus и C.albicans (табл.2).

При анализе влияния экстрагента обнаружено, что 70% этиловый спирт в дозе 100 мкл также подавляют рост В. cereus и С. albicans, а 40% этанол не оказывал ингибирующего влияния на рост культур. Поэтому для исключения влияния спирта этилового 70%-го на результаты эксперимента и подтверждения антимикробной активности суммы действующих веществ экстрактов было получено суммарное спиртовое извлечение с помощью 70%-го этанола, из которого полностью удалили экстрагент и растворили сухой остаток в эквивалентном количестве 40% этилового спирта.

МИК для В. cereus и C. albicans составили 3,5 мг/мл для экстракта, полученного с помощью 70%-го этанола, и 3,2 мг/мл - для экстракта, полученного с помощью 40%-го этанола.

Проведенная оценка влияния полученного экстракта на рост В. cereus и С. albicans подтвердила бактериостатическую и фунгистатическую активность извлечения (табл.3).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению продукта в качестве антикоагулянтного средства непрямого действия, обладающего антибактериальной активностью в отношении Bacillus cereus и противогрибковой активностью в отношении грибов вида Candida albicans. Применение продукта извлечения из надземной части растения Nonea rossica 40-70% этиловым спиртом в качестве антикоагулянтного средства непрямого действия, обладающего антибактериальной активностью в отношении Bacillus cereus и противогрибковой активностью в отношении грибов вида Candida albicans. Вышеописанное применение продукта эффективно в качестве антикоагулянтного средства непрямого действия, обладающего антибактериальной активностью в отношении Bacillus cereus и противогрибковой активностью в отношении грибов вида Candida albicans. 1 ил., 3 табл.

Применение продукта извлечения из надземной части растения Nonea rossica 40-70% этиловым спиртом в качестве антикоагулянтного средства непрямого действия, обладающего антибактериальной активностью в отношении Bacillus cereus и противогрибковой активностью в отношении грибов вида Candida albicans.