НАТРИЕВАЯ СОЛЬ 2-МЕТИЛ-6-ФТОР-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-с]-1,2,4-ТРИАЗИН-7(4Н)-ОНА ДИГИДРАТ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2013 года по МПК C07D487/04 A61K31/53 

1. Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается натриевой соли 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4H)-она дигидрата, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных и человека вирусной природы. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности вирусов гриппа, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью.

2. Уровень техники.

Имеются данные о противовирусном действии 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-онов (Синтез и противовирусная активность 6-нитро-7-оксо-4,7-дигидроазоло [5,1-c][1,2,4]триазинов. В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, О.Н.Чупахин, М.М.Зубаиров, А.Б.Капустин, Н.И.Митин и др. / Химико-фармацевтический журнал. №9, 1990, с.41-44).

В настоящее время известна натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4H)-она (1) дигидрат, которая принадлежит к ряду соединений, проявляющих противовирусное действие (О.Н. Чупахин, В.Л. Русинов, Е.Н. Уломский, В.Н. Чарушин, А.Ю. Петров, О.И. Киселев. Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4H)-она, дигидрат, обладающая противовирусной активностью. Патент РФ №2294936 от 10.03.2007) и может быть использована в медицинской практике, животноводстве, птицеводстве.

Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат (1) является близким структурным аналогом заявляемых соединений и потому использована в качестве прототипа.

3. Сущность изобретения.

Техническим результатом предлагаемого изобретение является новое химическое соединение, обладающее противовирусным действием в отношении вируса гриппа A(H1N1).

Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению предложено новое соединение - натриевая соль 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4H)-она, дигидрат формулы (2), обладающая противовирусным действием.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

4.1. Синтез натриевой соли 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло [5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрата (2)

Химическая схема синтеза заявляемого соединения

К раствору 9,8 г (0,1 моль) 3-амино-5-метил-1,2,4-триазола (3) (0,1 моль) в 50 мл воды добавили 22 мл (0,26 моль) концентрированной соляной кислоты. Реакционную массу охладили до - 10°C и прибавляли раствор нитрита натрия (7 г, 0.1 моль) в 10 мл воды при -10÷-5°C. После прибавления раствора нитрита натрия и выдержки (15+30 мин) реакционную массу добавили к раствору 12,5 мл (0,1 моль) этил 2-фторацетоацетата в смеси 93 мл (0,28 моль) 3 М ацетата натрия и 100 мл этанола, охлажденного до 0°C. Реакционную массу выдерживали 1 ч при 5°C и 2 ч при комнатной температуре. Выпавший в осадок продукт (5) отфильтровали, промыли водой и перекристаллизовали из этанола.

Полупродукт без сушки растворили в растворе 8,2 г (0,1 моль) ацетата натрия в 70 мл 70%-го водного этанола и кипятили 5 часов. По окончании реакции растворитель упарили, продукт сушили. Высушенный продукт растворили в 20 мл этанола и добавили 32 мл (0,1 моль) насыщенного раствора едкого натра в этаноле. Выпавший продукт после получасовой выдержки реакционной массы отфильтровали, кристаллизовали из воды, сушили. Выход: 12,1 г (47,6%).

Натриевая соль 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат (2) имеет следующие физико-химические характеристики: Т_пл>300°C; ¹H ЯМР спектр (ДМСО-d₆+CCl₄, внутренний стандарт - тетраметилсилан), δ, м.д.: 2,34 (3H, c, CH₃); ИК спектр, v, см^-1: 1652 см^-1 (CO), 1294 см^-1 (C-F). ¹⁹F ЯМР спектр (ДМСО-d⁶+CCl₄, внутренний стандарт - гексафторбензол) δ, м.д.: -114,98; Найдено, %: C - 23,37; H - 2,82; N - 32,82; C₅H₇N₆NaO₅; Вычислено, %: C - 23,63%; H - 2,78%; N - 33,07.

Заявляемое соединение представляет собой бледно-желтое кристаллическое высокоплавкое вещество (т. пл. более 300°C), растворимое в воде, метаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, нерастворимое в бензоле, хлороформе и большинстве апротонных растворителей.

4.2. Противовирусные свойства натриевой соли 2-метил-6-фтор-

1,2,4-триазоло [5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрата (2) Пример 1. Определение противовирусной активности соединений в отношении вируса гриппа A (H1N1)

Вирусы и клетки. Исследования проводились на первичной культуре клеток почек собаки (MDCK). Для оценки противовирусной активности препаратов использовали референс-вирус A(H1N1) А/Брисбен/59/07. Данный штамм обладает достаточной гемагглютинирующей (1:128) и инфекционной активностью (6,5 lg ИД 50/20 мкл).

Изучение токсичности препаратов. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты и культивировали при 37°C в среде MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота до состояния монослоя. Из исследуемых препаратов готовили маточные растворы концентрации 10 мг/мл в диметилсульфоксиде, после чего готовили серию двукратных разведений препаратов в среде MEM от 500 до 1,92 мкг/мл. Растворенные препараты вносили в лунки планшетов и инкубировали 48 часов при 37°C. Степень повреждения клеточного монослоя оценивали визуально.

На основании полученных данных определяли минимальную токсическую (1000 мкг/мл) и рабочую дозу препаратов.

Таблица 1 Снижение инфекционной активности вируса гриппа под действием изучаемых соединений № Формула Минимальная токсическая доза МТД, мкг/мл Рабочая концентрация, мкг/мл Противовирусная активность (снижение инфекционной активности в lg ИД50/20 мкл) 1. 1000 50 1,5 2. 1000 50 0,5

Оценка противовирусного действия соединений. Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса гриппа A(H1N1) A/Брисбен/59/07 проводили на клетках MDCK в 96-луночных планшетах для клеточных культур. Из исходной вируссодержащей аллантоисной жидкости готовили серию десятикратных разведений от 10^-1 до 10^-7 и вносили в соответствующие лунки с клеточным монослоем. После часового контакта при 36-37°C в лунки добавляли препарат в рабочей концентрации. Результаты учитывали через 48 часов по реакции гемагглютинации (ГА) со взвесью 0,5% куриных эритроцитов. Вирус ингибирующее действие препарата оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем. Результаты исследований представлены в табл.1.

Из данных, приведенных в табл.1 видно, что соединение-прототип (1) практически не активно в отношении вируса гриппа A(H1N1) A/Брисбен/59/07. В то же время, заявляемое соединение (2) обладает умеренной противовирусной активностью при токсичности, соизмеримой с Триазавирином.

Описывается натриевая соль 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат

проявляющая противовирусное действие в отношении вируса гриппа A(H1N1). 1 табл.

Натриевая соль 2-метил-6-фтор-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат

обладающая противовирусным действием.