НАТРИЕВАЯ СОЛЬ 2-ЭТИЛТИО-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]-1,2,4-ТРИАЗИН-7-ОНА ДИГИДРАТ Российский патент 2010 года по МПК C07D487/04 A61P31/12 A61P31/16 

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается нового соединения - дигидрата натриевой соли 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, обладающего противовирусным действием и предназначенного для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных и человека вирусной природы. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

Имеются данные о противовирусном действии 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-онов (Синтез и противовирусная активность 6-нитро-7-оксо-4,7-дигидроазоло [5,1-с][1,2,4]триазинов. В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, О.Н.Чупахин, М.М.Зубаиров, А.Б.Капустин, Н.И.Митин и др. / Химико-фармацевтический журнал. №9, 1990, с.41-44).

Известна натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат (1), которая принадлежит к ряду соединений, проявляющих противовирусное действие (О.Н.Чупахин, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, В.Н.Чарушин, А.Ю.Петров, О.И.Киселев. Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат, обладающая противовирусной активностью. Патент РФ № 2294936 от 10.03.2007) и может быть использована в медицинской практике, животноводстве, птицеводстве.

Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат (1) является близким структурным аналогом заявляемого соединения и потому выбрана в качестве прототипа. Указанное соединение (1) проявляет противовирусную активность в отношении вирусов ВЭЛ (венесуэльский энцефаломиэлит лошадей), ЛДР (лихорадка долины Рифт), Синдбис, ВБА (вирус болезни Ауески), вируса гриппа птиц, вируса ЗЭЛ (западный энцефаломиэлит лошадей).

Задачей изобретения является поиск нового соединения, обладающего более широким спектром действия и повышенной ингибирующей способностью.

Поставленная задача решается путем синтеза нового химического соединения - натриевой соли 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрата формулы (2)

которая обладает противовирусной активностью в отношении вируса Западного Нила, в отношении вируса ТОРС (тяжелый острый респираторный синдром), повышенной ингибирующей способностью в отношении вируса гриппа подтипа H5N1.

Пример 1. Синтез натриевой соли 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-с]-1,2,4-триазин-7 - она дигидрата (2)

Соль 3-этилтио-1,2,4-триазолил-5-диазония, полученную из 14,4 г (0,1 моль) 5-амино-3-этилтио-1,2,4-триазола действием 0,1 моль нитрита натрия или калия в присутствии 0,25 экв. кислоты, конденсируют 11 мл (0,1 моль) этилнитроацетата в 150 мл 2 М растворе карбоната натрия. Выпавший осадок отфильтровывают, последовательно кристаллизуют из 20%-ной уксусной кислоты, воды и сушат на воздухе. Выход: 16,8 г (56%).

Натриевая соль 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат имеет следующие физико-химические характеристики: Т_пл>300°C; ¹Н ЯМР спектр в ДМСО-d₆ δ, м.д.: 1,44 (3Н, т, С-СН₃), 3,21 (2Н, кв, SCH₂).

Найдено: С - 24.12, Н - 3,15, N - 27,82. Брутто-формула- C₆H₉N₆NaO₅S.

Вычислено: С - 24,00, Н - 3,02, N - 27,99, %.

Заявляемое соединение представляет собой желтое кристаллическое высокоплавкое (302-305°C) вещество, растворимое в воде, метаноле, ацетоне, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, малорастворимое в метаноле, нерастворимое в бензоле, хлороформе и большинстве апротонных растворителей.

Пример 2. Противовирусные свойства дигидрата натриевой соли 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она (2)

Изучение противовирусного действия заявляемого соединения проводили на культуре клеток MDCK, GMK-AH-1(Д).

Пример 2.1.

Изучение противовирусной эффективности заявляемого соединения в отношении вируса Западного Нила проводили на культуре клеток GMK-AH-1(Д). Для изучения противовирусной эффективности препарат вводили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 4 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса в течение 60 мин при температуре 36,5÷37,5°C монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, затем вносили свежую среду, содержащую исследуемые дозы препарата, и инкубировали в течение 2 суток при температуре 36,5÷37,5°C. По окончании инкубации клетки разрушали криодеструкцией. Уровень накопления возбудителя в пробах определяли титрованием проб методом получения негативных колоний вируса в монослое клеток ОМК-АН-1(Д) под твердым агаровым покрытием. Результаты испытаний приведены в табл.1. Соединение-прототип не проявляет ингибирующего действия в отношении вируса Западного Нила.

Таблица 1 Противовирусное действие заявляемого соединения в отношении вируса Западного Нила № Доза препарата, мкг/мл Уровень накопления вируса, lg БОЕ/мл Уровень подавления репродукции вируса, Δ, lg Коэффициент ингибирования, % 1. 100 6,4 0,5 68,8 2. 10 6,9 0 0 3. 1 6,9 0 0 4. 100 (прототип) 6,4 0 0

Пример 2.2.

Изучение противовирусной эффективности заявляемого соединения в отношении вируса гриппа подтипа H5N1 проводили в культуре клеток MDCK. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных развивающихся куриных эмбрионов с биологической активностью 6,5 lg ЦПД₅₀/мл. Для изучения противовирусной эффективности препарат вводили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 10 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,1 ЦПД₅₀/кл. После адсорбции вируса в течение 60 мин при температуре (37,0±5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, затем вносили свежую среду, содержащую исследуемые дозы препарата, и инкубировали в течение 3 суток при температуре 36,5÷37,5°C. По окончании инкубации оценивали цитопатический эффект, вызванный вирусом, титрованием проб по гибели развивающихся куриных эмбрионов. При уровне накопления вируса 4,3 lg ЭЛД₅₀/мл уровень подавления репродукции вируса составил 2,7 Δlg, что соответствует коэффициенту ингибирования 99,8%.

Коэффициент ингибирования вируса соединением-прототипом в этих условиях составил 90%.

Пример 2.3.

Оценку противовирусной эффективности заявляемого соединения в отношении возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) осуществляли с использованием культуры клеток GМК-АН-1(Д) при инфицирующей дозе вируса 0,01 БОЕ/кл. Результаты испытаний приведены в табл.2.

Таблица 2 Противовирусное действие заявляемого соединения в отношении вируса ТОРС № Доза препарата, мкг/мл Уровень накопления вируса, lg БОЕ/мл Уровень подавления репродукции вируса, Δ, lg Коэффициент ингибирования, % 1. 100 3,7 0,8 84,4 2. 10 3,7 0,1 18,8 3. 1 3,9 0 0 4. 100 (прототип) 3,7 0,1 18,8

Как видно из приведенных результатов испытаний, противовирусное действие предлагаемого соединения в сопоставимых с прототипом дозах оказалось в 4,5 раза выше в отношении вируса ТОРС, на 10% выше в отношении вируса гриппа подтипа H5N1 и оно проявило высокую противовирусную эффективность в отношении вируса Западного Нила.

Описывается новое соединение - натриевая соль 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат формулы (1)

обладающее противовирусным действием, которое может быть использовано в медицине, животноводстве и птицеводстве. 2 табл.

Натриевая соль 2-этилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин -7-она дигидрат формулы