ЛЕЧЕБНОЕ СРЕДСТВО С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ АКАДЕЗИНА Российский патент 2013 года по МПК A61K31/7056 A61K31/192 A61K31/405 A61K31/616 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, в частности онкологии и гематологии, а именно к лечебному средству для лечения В-клеточного лейкоза на основе 5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-рибофуранозида (АИКАР, акадезина) в комбинации с одним из нестероидных противовоспалительных препаратов (НСПВП).

Среди распространенных видов злокачественных опухолей - гемобластозы (опухоли кроветворной системы), в частности малигнизация В-лимфоцитов (В-клеточный лейкоз). В настоящее время практически единственным средством сохранения жизни и поддержания ее относительно высокого качества у больных В-клеточным лейкозом служит базисная полихимиотерапия (антрациклиновые антибиотики, алкилирующие агенты, антимитотические препараты и др.). При рецидивах заболевания используют препараты нового поколения - ингибиторы протеинкиназ дасатиниб и понатиниб. Указанные режимы лечения проводятся как многомесячные и многолетние курсы и, следовательно, дорогостоящи [Тrаре АР, Gonzalez-Angulo AM. Breast cancer and metastasis: on the way toward individualized therapy. Cancer Genomics Proteomics. 2012 9(5):297-310; Rodrigues G, Sanatani M. Age and comorbidity considerations related to radiotherapy and chemotherapy administration. Semin Radiat Oncol. 2012, 22(4):277-283)].

Особенность опухолевых клеток - приобретение устойчивости к практически любым препаратам. Это обусловлено нарушением механизмов гибели в опухолевых клетках и выживанию вариантов с нефункционирующими сигнальными путями программированной гибели (апоптоза). Эта важнейшая трудность противоопухолевой терапии делает необходимым поиск веществ, способных вызывать неапоптотические виды гибели опухолевых клеток. К таким веществам относят акадезин [Van Den Neste Е, Van den Berghe G, Bontemps F. AICA-riboside (acadesine), an activator of AMP-activated protein kinase with potential for application in hematologic malignancies. Expert Opin. Investig. Drugs. 2010, 19(4):571-578; Drew BG, Kingwell BA. Acadesine, an adenosine-regulating agent with the potential for widespread indications. Expert Opin. Pharmacother. 2008, 9(12):2137-2144].

Акадезин важен для противоопухолевой терапии благодаря уникальному механизму противоопухолевого действия: это соединение вызывает сложную гибель с участием механизма некроза [Глазунова и соавт., АИКАР - противоопухолевый препарат широкого спектра действия. Онкологический журнал общественного объединения "Белорусское онкологическое общество", 2012, том 6, стр.16]. Практическое применение акадезина сдерживается крайне высокой стоимостью субстанции, получаемой путем органического синтеза. Недавно разработан эффективный метод получения акадезина с помощью микробиологического синтеза с использованием рекомбинантного продуцента (RU 2405833). Цитотоксичность природной субстанции для культуры клеток В-лейкоза не отличается от активности синтетического акадезина [Глазунова и соавт., АИКАР - противоопухолевый препарат широкого спектра действия. Онкологический журнал общественного объединения "Белорусское онкологическое общество", 2012, том 6, стр.16].

Молекулярные механизмы противоопухолевого эффекта акадезина далеко не ясны, однако в настоящее время его рассматривают как перспективный противолейкозный препарат [Leukemia PLoS ONE, 2009,4(11), е2889, р.1-11; Expert Opin.Invest. Drugs. 2010,19(4),p.571-578; Blood. 2010., 116(16)3023-3032; Oncotarget. 2011, 2(12), p.1322-1328; Mol.Cancer Ther. 2011, 10(3), p.437-447].

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является акадезин - лечебное средство с противоопухолевой активностью, характеризующейся избирательным подавлением В-лимфоцитов, но не Т-лимфоцитов [WO 203/080076, Blood. 2003, 101, р.3674-3680; Leukemia. 2005, 19, р.292-294]. Недостатком акадезина как противоопухолевого средства является его быстрое превращение в пуриновые нуклеотиды, что снижает его внутриклеточное содержание. Вместе с тем известно, что некоторые НСПВП (ибупрофен, индометацин, аспирин) подавляют in vitro активность фермента трансформилазы-циклогидролазы, ответственного за превращение акадезина в пуриновые нуклеотиды [Baggott JE, Morgan SL, На Т, Vaughn WH, Hine RJ. Inhibition of folate-dependent enzymes by non-steroidal anti-inflammatory drugs. Biochem J. 1992, 15;282 (Pt l):197-202].

Задача настоящего изобретения - разработать лечебное средство на основе акадезина с более выраженной противоопухолевой активностью.

Задача решена путем разработки лечебного средства на основе акадезина, включающего дополнительно НСПВП: ибупрофен, или индометацин, или аспирин.

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Цитотоксичность акадезина и его комбинаций с НСПВП для клеток В-лимфоцитарного лейкоза мыши (линия Р388).

Клетки линии В-клеточного лейкоза (линия Р388) культивировали в питательной среде Игла, модифицированной Дульбекко (среда DMEM) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (культуральная среда) при 37°C, 5% CO₂ в увлажненной атмосфере. В день эксперимента клетки подсчитывали в камере Горяева и суспендировали в культуральной среде до концентрации 50000 клеток/мл. В лунки 96-луночного планшета (Nunc, Дания) вносили 190 мкл клеточной взвеси (-10 тыс. клеток) в культуральной среде и инкубировали 16 ч при 37°C, 5% CO₂. Приготавливали серийные разведения акадезина, ибупрофена, индометацина, аспирина и пироксикама из стоковых растворов (10 мМ в диметилсульфоксиде для каждого исследуемого соединения, кроме аспирина; 100 мг/мл для аспирина). Из каждого разведения получали требуемую конечную концентрацию препарата в лунке в объеме 5-10 мкл. В контрольные лунки вносили раствор диметилсульфоксида до конечной концентрации 0,5%. Клетки инкубировали с каждым соединением в отдельности или с комбинациями акадезина с остальными соединениями в течение 72 ч. Каждую концентрацию исследовали в трех повторностях. После окончания инкубации в лунки вносили 20 мкл водного раствора (5 мг/мл) бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия. Клетки инкубировали 2 ч до развития темно-фиолетовой окраски клеток (формазан), удаляли культуральную среду. К клеткам добавляли 100 мкл диметилсульфоксида и суспендировали. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 570 нм, вычитая оптическую плотность при 690 нм. Процент выживших клеток рассчитывали как отношение оптической плотности (OD_{570 нм}-OD_{690 нм}) контрольных (без препаратов) лунок к соответствующему показателю в лунках с той или иной концентрацией исследуемого соединения или комбинации исследуемых соединений.

Таблица 1 Цитотоксичность акадезина и НСПВП для клеток линии Р388. Соединение Концентрация Акадезин   0 1.5 3 7 15 30 мкМ Ибупрофен 0 мМ 100* 100 100 94 62 29   0,2 мМ 100 100 98 65 32 12   0,4 мМ 100 60 39 18 8 5 Индометацин 0 мМ 100 100 100 94 62 29   0,1 мМ 96 15 12 5 4 3 Аспирин 0 мМ 100 100 100 94 62 29   0,5 мг/мл 98 64 51 32 21 15   1 мг/мл 95 46 32 20 16 8

Примечания: *% выживших клеток (среднее 3-х независимых измерений). Подчеркнуты наиболее выраженные результаты синергизма акадезина с другими соединениями.

Из приведенных данных следует, что воздействие только акадезина на клетки В-лейкоза оказалось токсичным в диапазоне концентраций 15-30 мкМ. Соединения, с которыми исследованы комбинации акадезина, использованы в нетоксических или слаботоксических концентрациях. Эффект синергизма наблюдали для ибупрофена, или индометацина, или аспирина. Так, акадезин (3 мкМ) и ибупрофен (0.4 мМ) по отдельности не вызывали выраженной гибели клеток, а при комбинации двух соединений в тех концентрациях выживало только 39% клеток. Выраженный синергизм виден при совместном действии 1,5-3 мкМ акадезина и 0,1 мМ индометацина.

Таким образом, нестероидные противовоспалительные агенты: ибупрофен, или индометацин, или аспирин, усиливают цитотоксичность акадезина для культувируемых клеток В-лимфоцитарного лейкоза.

Пример 2. Противоопухолевая активность акадезина в комбинации с ибупрофеном на модели В-клеточного лейкоза Р388 у лабораторных мышей.

Клетки лимфоцитарного лейкоза Р388, индуцированного у мышей линии DBA/2 путем смазывания кожи метилхолантреном, перевивали мышам-гибридам первого поколения BDF₁ (C₅₇Bl/_6j×DBA/2) подкожно в правую подмышечную область. Клетки получали из асцитной жидкости мышей-опухоленосителей. Количество клеток для прививки - 10⁶ клеток в питательной среде 199. Лечение начинали через 24 часа после перевивки опухолевых клеток.

Группы животных формировали для получения статистически достоверных результатов: контрольная группа состояла из 12 мышей, опытные - из 8 животных.

Критерием оценки противоопухолевого эффекта служило торможение роста опухоли (ТРО, %). Для вычисления ТРО проводили измерение трех максимальных взаимно перпендикулярных размеров опухоли (длина, ширина, высота) у каждого животного и вычисляли ее объем, а затем средний объем опухоли в группе. Измерение объема опухоли проводили каждые 3 дня, начиная с 7-го дня опыта, когда опухоли у нелеченных животных становятся измеримыми.

Торможение роста опухоли вычисляется по формуле:

ТРО (%)=(Vk-Vo)/Vk×100, где

Vk - средний объем опухолей в контрольной группе (мм³);

Vo - средний объем опухолей в опытной группе (мм³).

Акадезин вводили внутрибрюшинно в терапевтической дозе 80 мг/кг, а также в неэффективной дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно в течение 10 дней. Ибупрофен вводили перорально в дозе 100 мг/кг в течение 10 дней.

При сочетанном применении акадезина в двух дозах и ибупрофена наблюдался синергический противоопухолевый эффект при взаимодействии двух препаратов. Сочетанное применение акадезина в дозе 80 мг/кг и неэффективной дозе ибупрофена 100 мг/кг противоопухолевый эффект выше: ТРО=87%-84%-68%, чем при использовании акадезина в неэффективной дозе 50 мг/кг и той же дозе ибупрофена: ТРО=64%-77%-58%. Эта разница в противоопухолевом действии двух групп статистически недостоверна (р>0,05). Однако при сочетанном применении акадезина (80 мг/кг) и ибупрофена (100 м/кг) наблюдалась гибель 3 мышей из 8, получавших такую комбинацию (37,5% случаев).

Таблица 2 Противоопухолевое действие акадезина в сочетании с ибупрофеном на В-клеточный лейкоз Р388. Группа Доза, мг/кг Дни введения Путь введения ТРО, % (дни от начала опыта) Гибель от токсичности*** 8 10 13 Акадезин 80 1-10 в/бр 55* 46 37 0/8 -“- 50 1-10 -“- 17 49 38 0/8 Ибупрофен 100 1-10 per os 35 20 4 0/8 Акадезин+ 80 1-10 в/бр per os 87** 84** 68** 3/8 Ибупрофен 100 Акадезин+ 50 1-10 в/бр per os 54** 77** 58** 0/8 Ибупрофен 100

Примечания: *р<0,05 по отношению к контролю; **р>0,05 между группой сочетанного введения акадезина в дозе 80 мг/кг с ибупрофеном в дозе 100 мг/кг и группой сочетанного применения акадезина в дозе 50 мг/кг с ибупрофеном в дозе 100 мг/кг; ***в числителе: число мышей, погибших от токсичности в первые 3 дня после окончания лечения, в знаменателе: общее число животных в группе.

Таким образом, акадезин в сочетании с НСПВП ибупрофен проявляет синергическое противоопухолевое действие на В-клеточный лейкоз Р388.

Пример 3. Противоопухолевая активность акадезина в комбинации с аспирином на модели В-клеточного лейкоза Р388 у лабораторных мышей.

Противоопухолевую активность акадезина в комбинации с аспирином определяли по схеме, приведенной в примере 2, но акадезин вводили внутрибрюшинно в терапевтической дозе 60 мг/кг, а аспирин в дозе 200 мг/кг перорально в течение 10 дней.

Таблица 3 Противоопухолевое действие акадезина в сочетании с аспирином на В-клеточный лейкоз Р388. Группа Доза, Дни Путь ТРО, % (дни от начала Гибель от   мг/кг введе- введе- опыта) токсич-     ния ния 8 10 13 ности*** Акадезин 60 1-10 в/бр 58* 62* 37** 0/8 Аспирин 200 1-10 per os 43 19 44 0/8 Акадезин+ 60 1-10 в/бр 58* 63* 73*^,** 1/8 Аспирин 200   per os        

Примечания: *р<0,05 по отношению к контролю; **р<0,05 между группой сочетанного введения акадезина в дозе 60 мг/кг с аспирином в дозе 200 мг/кг и группой применения акадезина в дозе 50 мг/кг в монотерапии; ***в числителе: число мышей, погибших от токсичности в первые 3 дня после окончания лечения, в знаменателе: общее число животных в группе.

Из данных, приведенных в таблице 3, следует, что акадезин в режиме монотерапии вызывал торможение роста опухоли (ТРО) через 8-10 дней после начала введения (58% и 62%). Величина ТРО не отличалась от таковой при комбинации акадезина и аспирина в указанные сроки (58% и 63%). Однако в последующем терапевтическое действие акадезина ослабевало: к 13-м суткам после начала монотерапии акадезином ТРО составил лишь 37%), тогда как при сочетанном воздействии акадезина и аспирина достигнут выраженный эффект: %ТРО=73 (таблица 3). Следовательно, комбинация акадезина с аспирином приводит к стойкому и выраженному противоопухолевому эффекту, тогда как эффективность только акадезина кратковременна. Аспирин в режиме монотерапии также проявлял противоопухолевое действие, и его эффект в комбинации с акадезином к 13-м суткам лечения следует считать аддитивным (ТРО 37% акадезин, 44% аспирин, 73% комбинация акадезина и аспирина).

Таким образом, из результатов, представленных в таблицах 2 и 3, следует, что заявляемое лечебное средство в соответствующих дозах проявляет более выраженную противоопухолевую активность, чем акадезин.

Предложено лечебное средство с повышенной противоопухолевой активностью на основе акадезина, включающее дополнительно к акадезину нестероидный противовоспалительный препарат: ибупрофен, или индометацин, или аспирин. Показано синергетическое противоопухолевое действие заявленного средства на модели В-клеточного лейкоза. 3 табл., 3 пр.

Лечебное средство с противоопухолевой активностью на основе акадезина, отличающееся тем, что дополнительно включает нестероидный противовоспалительный препарат: ибупрофен, или индометацин, или аспирин.