Способ повышения эффективности ингибиторов иммунных контрольных точек при помощи терапевтической композиции на основе производных индола и пробиотика Российский патент 2024 года по МПК A61K31/404 A61K35/745 A61K35/747 A61K45/06 A61P35/00 

Область техники: изобретение относится к области микробиологии, иммунологии и онкологии.

Описание уровня техники

Иммунотерапия на основе ингибиторов ИКТ является современным методом лечения злокачественных новообразований (ЗНО) и принципиально отличается от традиционного химиотерапевтического подхода (Pardoll D.M. //Nat Rev Cancer. - 2012 - Vol. 12. - No. 4. - P. 252-264). Однако несмотря на впечатляющие результаты применения ингибиторов ИКТ, только часть пациентов с ЗНО демонстрирует положительные результаты лечения (Johnson D.B., et. al. //Cancer. - 2017 - Vol. 123. - No. 11. - P. 1904-1911). Одной из причин приобретения устойчивости опухолевых клеток к ингибиторам ИКТ является нарушение функционирования лигандзависимых консервативных факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов, продукты которых, в свою очередь, вовлечены в реакции врожденного и адаптивного иммунитета (Каут Д.А., и др. // Медицинская Иммунология. - 2009 - Т. 11. №2-3. - С. 147-152).

Согласно современным представлениям, одним из важнейших факторов в иммуносупрессивном микроокружении опухоли является фермент индоламин-пиррол-2,3-диоксигеназа (IDO1). Он катализирует расщепление аминокислоты триптофана по кинурениновому пути, следствием чего является «триптофановый голод» и накопление кинуренина и его метаболитов, что приводит к угнетению клеточных факторов врожденного и адаптивного иммунитета (Konopelski P., et al // Int J Mol Sci. - 2022. Vol. - 23. - No. 3. - P. 1222). Арилгидрокарбоновые рецепторы (AhR) являются консервативными факторами транскрипции и некоторые метаболиты кинуренинового пути способны посредством взаимодействия с AhR активировать экспрессию гена, кодирующего рецептор PD-1 (англ. Programmed Cell Death 1; CD-279). Он локализован на плазматических мембранах CD8+Т-лимфоцитов и играет ряд ключевых ролей в дифференцировке иммунных клеток. PD-1 представляет собой хорошо изученную молекулярную мишень для одобренных для клинического применения ингибиторов ИКТ на основе моноклональных антител, которые блокируют связывание PD-1 с белком PD-L1, представленным на поверхности опухолевых клеток (Liu J, et al. // Front Pharmacol. - 2021. - Vol. 1. - No. 12. - P. 731798). Далее арилгидрокарбоновые рецепторы активируются также метаболитами, которые производит микробиота кишечника (Rothhammer V., et al // Sci Rep.2018. - Vol. 8. - No. 1. - P. 4970). Одним из таких метаболитов является индол-3-пропионат [Negatu D.A., et al. // Front Microbiol. - 2020. - Vol. 27. -No. 11. - P. 575586), соединение с молекулярной массой 189,21 г/моль и широким спектром благоприятных биологических эффектов.

Таким образом, формируется трехкомпонентная система: макроорганизм - опухоль - микробиота. Было показано, что некоторые виды опухолей (рак простаты, рак молочной железы, опухоли ЦНС, лимфомы и др.) продуцируют большое количество кинуренина, а его избыточное накопление коррелирует с неблагоприятным прогнозом ЗНО (Badawy А.А. // Biosci Rep.- 2022. - Vol. 42. - No. 11. - P. BSR20221682). Являясь активным продуцентом кинуренина и его метаболитов, опухоль оказывает влияние на состояние микробиоты, в том числе индуцирует изменения ее качественного состава. С другой стороны, появление определенных штаммов бактерий способно также усилить продукцию кинуренина, стимулируя процессы ускользания опухоли от иммунного надзора.

Противоопухолевую и иммуностимулирующую эффективность ингибитора ИКТ можно усилить: а) путем комбинирования нескольких ингибиторов ИКТ, например, ниволумаба и ипилимумаба (Nikoo М., et al. // Int Immunopharmacol. 2023. - Vol. 117: - No. n/d. - P. 109881), что, однако, сопряжено с нарастанием токсических эффектов; б) комбинацией ингибитора ИКТ с иммуномодуляторами различной природы и механизма действия (Zhang С, et al. // Cancer Lett. 2023. - Vol. 562. - No. n/d. - P. 216182); в) комбинацией ингибитора ИКТ с пробиотическими препаратами (Najafi S., et al. // Life Sci. - 2022. - Vol. 310. - No. n/d. - P. 121138; Zhou G., et al. // Front Immunol. - 2022. - Vol. 13. - No. n/d. - P. 1001623).

В настоящее время в России нет официально рекомендованных к применению терапевтических композиций на основе пробиотических препаратов и экзогенных биологически активных соединений, которые способны индуцировать противоопухолевый иммунитет у пациентов, получающих ингибиторы ИКТ, посредством модуляции состава микробиоты.

Среди аналогов из уровня техники известны следующие изобретения. Изобретение WO 2020079024 A1 раскрывает комбинированную терапевтическую композицию для лечения колоректального рака, отличающуюся тем что используется живой бактериальный штамм Bifidobacterium longum и один из ингибиторов ИКТ, например, nivolumab (ниволумаб), pembrolizumab (пембролизумаб), pidilizumab (пидилизумаб), АМР-224, АМР-514, STI-A11 10, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB-0020718C, AUR-012 и STI-A1010.

Изобретение US 20200268811 A1 раскрывает метод лечения физиологических нарушений в организме человека, включая онкологические заболевания, путем применения разных комбинаций полисахаридных пребиотиков и пробиотиков, в частности, живых штаммов микроорганизмов Bifidobacterium longum и Lactobacillus paracasei, которые обладают способностью модулировать продукцию метаболита индол-3-пропионата и ряда других метаболитов с антиоксидатной активностью. Техническое решение не предусматривает наличия в методе лечения ингибиторов ИКТ.

Изобретение US 20200405778 A1 раскрывает метод купирования или предотвращения состояний организма человека, вызванных противоопухолевой терапией (химиотерапия и иммунотерапия, в том числе ингибиторами ИКТ), путем трансплантации микробиоты от донора. В качестве терапевтической композиции используется, комбинация штаммов микроорганизмов, в том числе и Bifidobacterium longum, которые применяют до- или после начала противоопухолевой терапии в нескольких временных точках: 1 день, 3 дня, 5 дней, 1, 4 и 8 недель.

Изобретение US 20200129569 А1 раскрывает терапевтическую композицию для перорального применения в виде таблеток или капсул в кислотоустойчивой оболочке для лечения или предотвращения ЗНО кожи (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак, меланома, дерматофибросаркома, саркома Меркеля, саркома Капоши и другие нозологии) Формуляция может содержать разные штаммы микроорганизмов родов Ruminococcaceae, Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Micrococcaceae, Veilonellaceae, и применяется для повышения эффективности иммунотерапии на основе анти-PD-1 препаратов.

Изобретение WO 2020264390 A2 представляет собой терапевтическую композицию для продукции синтеза серотонина, при этом в ее состав могут входить разные штаммы микроорганизмов, в том числе Bifidobacterium longum, и другие штаммы, которые склонны, помимо серотонина, к гиперпродукции индол-3-пропионата. Терапевтическая композиция предназначена для лечения ряда системных, в основном, неврологических заболеваний, в том числе и рака, однако, как в формуле изобретения, так ив разделе описание отсутствуют упоминания о совместном применении композиции с ингибиторами ИКТ.

Известен патент US 20220040230 A1 (WO 2020123447 A1), в котором раскрывают терапевтическую композицию для лечения высоко- и низкодифференцированных опухолей головы и шеи, а также опухолей поджелудочной железы путем воздействия низкомолекулярными иммуномодуляторами, например, индол-3-карбинолом (indole-3-carbinol), живыми штаммами микроорганизмов, принадлежащих к разным родам, в том числе Bifidobacterium longum и Lactobacillus paracasei, химиопрепаратами, радиосенсибилизаторами или ингибиторами ИКТ, в том числе, нацеленными на PD-1 или PD-L1, или генетически стабильными клеточными препаратами на основе аллогенных и аутологичных NK-клеток (натуральные киллеры). Препараты дают испытуемому в биосовместимой формуляции. На мышиных моделях были продемонстрированы иммуностимулирующие эффекты разных терапевтических композиций, однако, из представленных примеров не очевидны изменения показателей противоопухолевой активности, таких как «торможение роста опухоли».

Наиболее близких аналогов не выявлено.

Достигаемым при использовании настоящего изобретения техническим результатом является увеличение противоопухолевой эффективности иммунотерапии ИКТ при лечении рака легкого путем добавления в схему терапии ИКТ комбинации индол-3-пропионата и штаммов микроорганизмов Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei 29n_21 (регистрационный номер VKM B-3711D) и Bifidobacterium longum subsp.longum 202/21 (регистрационный номер VKM B-3717D).

Технический результат достигается тем, что предлагаемый способ лечения ЗНО, осуществляемый посредством комбинированного применения индол-3-пропионата и пробиотического препарата на основе микроорганизмов Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei 29n_21 (регистрационный номер VKM B-3711D) и Bifidobacterium longum subsp.longum 202/21 (регистрационный номер VKM B-3717D) на фоне терапии анти-PD-1 препаратом

демонстрирует повышение противоопухолевой эффективности иммунотерапии.

По экспериментальным данным, действие индол-3-пропионата приводит к торможению роста первичной опухоли (ТРО) до 34-44% в сингенных моделях рака легкого мышей (культуры LLC1 и СМТ167). Введение комбинации индол-3-пропионата и пробиотического препарата невлияет на показатели ТРО, но приводит к увеличению продолжительности жизни животных на 12-16%. Применение комбинации индол-3-пропионата, пробиотического препарата и анти-PD-1 препарата позволяет увеличить показатель ТРО на 15% в сравнении с таковым при применении анти-PD-1 препарата в монорежиме. Применение этой комбинации оказывает более устойчивый во времени противоопухолевый эффект, а именно, средняя продолжительность жизни животных составляет 62 дня против 51 дня при введении анти-PD-1 препарата в монорежиме. При применении комбинации индол-3-пропионата, пробиотического препарата и анти-PD-1 препарата достигается биологически значимое увеличение продолжительности жизни животных на 63% по сравнению с контролем (без воздействия). Таким образом, предлагаемый способ применения терапевтической композиции индол-3-пропионата и микроорганизмов Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei и Bifidobacterium longum subsp.longum демонстрирует повышение противоопухолевой эффективности иммунотерапии на основе ингибиторов ИКТ (в частности, ингибитора рецептора PD-1).

Раскрытие сущности изобретения

Для лечения рака легкого и других типов ЗНО, а также для дополнительной активации Т-клеточного звена противоопухолевого иммунитета, предлагается терапевтическая композиция, которая включает в себя независимые и несмешиваемые друг с другом вне организма компоненты химического и биогенного происхождения:

1) биосовместимая форма биологически активного низкомолекулярного нерастворимого в воде индол-3-пропионата;

2) пробиотическое средство на основе штаммов микроорганизмов бактериальной природы естественного происхождения, принадлежащие к разным классификационным таксонам.

Применение терапевтической композиции показано на фоне терапии ингибиторами ИКТ, блокирующими, активность сигнального пути PD-L1/PD-1.

Индол-3-пропионат

Для растворения индол-3-пропионата было использовано этоксилированное касторовое масло (Cremophor El), который представляет собой неионный солюбилизатор, полученный путем смешивания касторового масла с окисью этилена (1:35). Для получения эмульсии индол-3-пропионата к навеске 10 мг добавляли заданный объем Cremophor El, интенсивно перемешивали на водяной бане при температуре 38-40°С втечение 10-15 мин, а далее вносили небольшими порциями при постоянном перемешивании 0,9% раствор хлорида натрия до достижения конечной концентрации соединения 5 мг/мл. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр «Millipore» с размером пор 0,22 мкм. Спектры поглощения раствора, содержащегоиндол-3-пропионат, определяли на спектрофотометре в диапазоне длин волн от 200 до 800 нм сразу после приготовления растворов в кварцевых кюветах с длиной оптического пути -10 мм (см. Пример 1). Для перорального или внутривенного введения препарат индол-3-пропионата (5 мг/мл) должен содержать 4% этоксилированного касторового масла (например, Cremophor El).

Пробиотические штаммы микроорганизмов бактериальной природы.

Для трансплантации пробиотических штаммов микроорганизмов использовали лиофилизаты пробиотических культур в средах оптимизированного состава:

Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei 29n_21 и Bifidobacterium longum subsp.longum 202/21 с добавлением лакто-N-биозы и хитозана, при этом одна доза содержит 7×10⁷ КОЕ Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei и 8×10⁷ КОЕ Bifidobacterium longum subsp.longum. Содержание лакто-N-биозы не менее 0,1 мг/мл среды лиофилизации, а содержание хитозана - 30 мг на 1 терапевтическую дозу пробиотического средства.

Сведения о депонировании штаммов.

Штамм Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei 29n_21 депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии Наук (г. Пущино, РФ), штамму присвоен регистрационный номер VKM В-3711D.

Штамм Bifidobacterium longum subsp.longum 202/21 депонирован в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии Наук (г. Пущино, РФ), штамму присвоен регистрационный номер VKM B-3717D.

Режим введения и дозировки терапевтической композиции

Препарат индол-3-пропионата вводили животным внутривенно трехкратно в разовой дозе 130 мг/кг с интервалом 4 дня - в День 1, День 5, День 9 (курсовая доза - 390 мг/кг), где День 1 - день начала лечения животных при достижении объема опухоли 50±20 мм³. Ингибитор ИКТ вводили трехкратно внутривенно в терапевтической дозе 10 мг/кг в День 2, День 6 и День 10 (курсовая доза - 30 мг/кг). Трансплантацию пробиотических штаммов микроорганизмов проводили путем ихперорального введения 6 раз (дважды по 3 раза ежедневно с интервалом между 3-х кратными введениями 4 суток) в Дни 1, 2, 3 и Дни 7, 8 и 9 по 100 мкл/животное.

Наличие фармакологической активности терапевтической композиции следует из проведенных исследований на клеточных и животных моделях.

Оценка цитотоксической активности индол-3-пропионата, и его близких структурных гомологов индолил-3-уксусной кислоты и индол-3-молочной кислоты продемонстрировала, что все три соединения обладали цитотоксической активностью в отношении опухолевой линий клеток человека NCI-h358 и NCI-h23 и мыши LLC1 и СМТ167. Была выявлена четкая зависимость цитотоксической активности от времени инкубации опухолевых клеток с соединениями: максимальный эффект был реализован через 72 часа инкубации. Цитотоксическая активность соединений снижалась в ряду: индол-3-пропионат>индол-3-уксусная кислота>индол-3-молочная кислота (см. Пример 2). Таким образом, индол-3-пропионат был выбран для дальнейших исследований.

Изучение острой токсичности субстанции индол-3-пропионата при пероральном и внутривенном путях введения (см. Пример 3) позволило рассчитать количественные критерии острой токсичности и определить степень опасности субстанций при их однократном применении животным. Для субстанции индол-3-пропионата (суспензия, 50 мг/мл в 0,9% растворе натрия хлорида) при пероральном пути введения а также для серии растворов, содержащих индол-3-пропионата в финальной концентрации 5,0 мг/мл с добавлением 2,5% или 4% или 1% Cremophor EL) при их пероральном и внутривенном ведении не удалось с высокой точностью определить класс опасности ввиду особенностей лекарственной формы и ряда ограничений: ограничение по объему вводимой животному жидкости и неполной растворимости субстанции (3 или 4 класс опасности, умеренно-токсичное - малотоксичное соединение). На основании полученных данных, при пероральном введении суспензии индол-3-пропионата и внутривенном введении раствора индол-3-пропионата были установлены предельно-допустимые дозы:

- доза субстанции индол-3-пропионата в виде суспензии (50 мг/мл в 0,9% растворе натрия хлорида) при однократном пероральном введении не должна превышать 2000 мг/кг, а при многократном ежедневном применении суммарная курсовая доза не должна превышать 2000 мг/кг;

- доза субстанции индол-3-пропионата в виде раствора (5,0 мг/мл в 2,5% или 4,0% или 1,0% растворе Cremophor EL) при однократном пероральном ивнутривенном введении не должна превышать 400 мг/кг, а при многократном применении суммарная курсовая доза не должна превышать 400 мг/кг.

Исследование противоопухолевой активности индол-3-пропионата на моделях перевиваемых опухолей мышей LLC1 и СМТ167 позволило установить режим введения индол-3-пропионата (внутривенное трехкратно введение с интервалом 4 дня в разовой дозе 130,0 мг/кг (курсовая доза 390 мг/кг)), что позволило достичь высокой противоопухолевой активности (по интегральной шкале) в отношении опухолей LLC1 и СМТ167 (см. Пример 4).

Оценку противоопухолевой эффективности при применении индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов на фоне лечения анти-PD-1 препаратом проводили на мышах с опухолями LLC1 (см. Пример 5). Трансплантация пробиотических микроорганизмов приводила к торможению роста первичной опухоли в течение 12 дней после окончания лечения на 58,0%-59,2% при увеличении продолжительности жизни животных на 41,0%. Результаты морфологического и иммуногистохимического анализа свидетельствовали об отсутствии каких-либо изменений в ткани карциномы легкого LLC1 на введение индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов на фоне анти-PD-1 препарата.

Оценку противоопухолевой эффективности применения индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов на фоне анти-PD-1 препарата проводили также на мышах с опухолями СМТ167 (см. Пример 5). Была отмечена не только существенная задержка и торможение роста опухоли, но и биологически значимое увеличение на 63,4% продолжительности жизни животных. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование ткани карциномы легкого СМТ167 после проведенного комбинированного лечения позволило выявить значимое увеличение представленности CD4⁺Т-лимфоцитов среди клеток воспалительного инфильтрата, расположенного в перитуморальной зоне и паренхиме опухолевых образований, по сравнению с контролем (без внешних воздействий). Аналогичный эффект, но с меньшей степенью выраженности, наблюдали в группах, где мыши получали анти-PD-1 препарат в монорежиме.

Таким образом, в вышеприведенных примерах результатов доклинических исследований была доказана дополнительная активация противоопухолевого иммунитета при использовании терапевтическойкомпозиции на фоне введения в организм ингибитора ИКТ - ингибитора рецептора PD-1.

Примеры осуществления изобретения

Общее описание материалов и методов

В качестве тестируемых соединений использовали индолил-3-уксусную кислоту, 175,19 г/моль, чистота не менее 98% (ДИА-М, Россия), индол-3-пропионовую кислоту, 189,21 г/моль, чистота не менее 99% (Sigma-Aldrich, США), индол-3-молочную кислоту, 205,21 г/моль, чистота не менее 98% (Merck KGaA, США),

В качестве противоопухолевого анти-PD-1 препарата использовали моноклональные антитела к PD-1 (InVivoMAb anti-PD-1, CD279, Bxcell), адаптированные для применения у мышей.

В качестве клеточных культур рака легкого использовали NCI-h358 -бронхоальвеолярный рак легких человека (АТСС); NCI-h23 -аденокарцинома легкого человека (АТСС); LLC1 - карцинома легкого Льюис мыши (ЕСАСС); СМТ167 - карцинома легкого мыши (ЕСАСС).

В исследованиях были использованы следующие линии экспериментальных животных:

а) мыши линии F1 (CBA×C57B1/6j), самки, масса тела к моменту введения препаратов - 21-23 г, источник получения животных - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА, филиал «Андреевка»;

б) мыши линии C57Black/6, самки, масса тела к моменту введения препаратов - 19-21 г, источник получения животных - ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН.

Прибывшие животные до начала исследования были помещены в отдельные комнаты на период адаптации/карантина (14 суток). Животные без признаков отклонений в состоянии здоровья были распределены по группам случайным отбором по массе тела так, чтобы индивидуальный вес тела входил в диапазон вариации ±10% от среднего значения показателя для каждого пола. Опытные группы и контрольные группы состояли из 10-16 мышей. Мыши содержались в разных комнатах экспериментально-биологической клиники (виварий) в контролируемых условиях окружающей среды (температура - плюс 22°С-24°С и относительная влажность - 30-57%). Температура и влажность в комнате постоянно контролировалась с помощью термометров (температура) и психрометров (влажность). В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения и, по крайней мере, 10-кратная смена объема воздуха комнаты в час. Мыши содержались по 10 особей в пластиковых клетках ИВК GM500 Sealsafe PLUS (Tecniplast, Италия). Размеры клетки 391×199×160/172 мм (Д×Ш×В). Все клетки для мышей оборудованыстальными решетчатыми крышками с углублением для корма и бутылочек с водой. В качестве подстила у мышей использовали специальный сертифицированный подстил REHOFIX (J-Rettenmaer-Sohne, Германия). Мыши получали стандартный сертифицированный сбалансированный по питательным веществам апатогенный автоклавированный гранулированный корм «Чара» (ЗАО «Ассортимент АГРО», Россия). Животные получали корм без ограничения. Научные исследования с использованием животных были проведены в соответствии с национальными и международными стандартами.

Для проведения исследований in vitro клетки NCI-h358 и NCI-h23 культивировали в среде RPMI1640 (ПанЭко, Россия), клеточные линии LLC1 и СМТ167 - в среде ДМЕМ (ПанЭко, Россия) с добавлением 2 мM-L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 10% сыворотки крови эмбриональной телячьей (ЭТС) (Corning, США) в культуральных флаконах 25 см² и 75 см² (Corning, США) при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа. Клетки открепляли от поверхности флакона путем добавления раствора Версена (ПанЭко, Россия). Для проведения исследований in vitro использовали клетки 3-8 пассажей с оптимальной посевной концентрацией 5-7×10⁴ клеток/мл. Для проведения исследований in vivo клеточные линии LLC1 и СМТ167 поддерживали в среде ДМЕМ (ПанЭко, Россия) с добавлением 2 мМ-L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 10% сыворотки крови эмбриональной телячьей (ЭТС) (Corning, США) в культуральных флаконах 25 см² и 75 см² (Corning, США) при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа.

Перед инокуляцией мышам клетки открепляли от поверхности флакона с помощью добавления раствора Версена (ПанЭко, Россия). Для прививки животным использовали клетки 3-5 пассажей. Клетки линии LLC1 инокулировали мышам-самкам линии C57Black/6 (категория SPF) подкожно на поверхность бедра по 1,2×106 клеток/мышь. Клетки линии СМТ167 перевивали мышам-самкам линии C57Black/6 (категория SPF) подкожно на правую боковую поверхность тела по 0,8×106 клеток/мышь.

Оценку цитотоксичности соединений проводили согласно следующему протоколу. Клеточные линии NCI-h358, NCI-h23, LLC1 и СМТ167 рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 5×10³ клеток на лунку в объеме 100 мкл (при времени инкубации соединений с клетками 48 и 72 часа) и 7×10³ клеток на лунку в объеме 100 мкл (при времени инкубации 24 часа). Воздействие соединений проводили в экспоненциальной фазе роста клеток через 24 часа после посева. Растворы соединений в полной культуральной среде вносили в лунки в конечной концентрации от 3 мкг/млдо 200 мкг/мл. Длительность инкубации клеток с соединениями составила 24, 48 и 72 часа. В качестве контроля использовали культуральную среду и 4%-ный водный раствор Cremophor El.

Оценку выживаемости клеток проводили при помощи колориметрического МТТ-теста. Перед началом теста клетки отмывали от среды, далее добавляли 0,5%-ный раствор 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5 дифенилтетразолия бромида в лунки и инкубировали в течение 3 ч. После завершения инкубации среду с МТТ-реагентом удаляли, а кристаллы формазана растворяли диметилсульфоксидом в течение 10 минут. Оптическую плотность измеряли на многоканальном планшетном фотометре Multiscan FC (Thermo scientific) при длине волны 550 нм.

Уровень ингибирования роста (ИР) клеток в культуре вычисляли по формуле (1):

где ODo - оптическая плотность формазана в опытных лунках, ODk - оптическая плотность формазана в контрольных лунках планшета.

Пример 1

Эксперименты по подбору условий растворения производных индола

Производные индола практически не растворимы в водных растворах. При разработке биосовместимой композиции для внутривенного введения производных индола использовали несколько растворителей (диметилсульфоксид, 95%-ный этиловый спирт, Pluronic® F127 и Cremophor El). В результате были подобраны оптимальные условия растворения для получения растворов с финальной концентрацией соединений 5 мг/мл: 2,5%-ный водный раствор Cremophor El (индол-3 -уксусная кислота); 4,0%-ный водный раствор Cremophor El (индол-3-пропионат), 1,0%-ный водный раствор Cremophor El (индол-3-молочная кислота). Растворимость производных индола приведена в Таблице 1. Спектры поглощения индола и его производных характеризуются наличием основного максимума поглощения при длине волны 288 нм и локального максимума поглощения при длине волны 220 нм. Спектрофометрическая оценка растворов индолил-3-уксусной кислоты, индол-3-пропионовой кислоты и индол-3-молочной кислоты приведены на фигурах 1, 2 и 3, соответственно. В водных растворах, содержащих Cremophor El и соединения были зарегистрированы пики поглощения производных индола при длинах волн 220±1 нм и 288±1 нм, которые соответствуют базовой структуре индола.

Пример 2

Эксперименты по оценке цитотоксической активности производных индола

Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста культуры клеток более чем на 50% (ингибирующая концентрация - ИК-50). При сравнительном анализе цитотоксической активности in vitro производных индола была выявлена высокая зависимость эффекта от времени инкубации опухолевых клеток соединениями. Результаты представлены в таблице 2. Водный раствор Cremophor El, используемый в качестве контроля, не оказывал цитотоксического действия на клетки. Проведенные эксперименты показали, что все производные индола обладают цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток человека NCI-h358 и NCI-h23, а также мыши - LLC1 и СМТ167. Была установлена четкая зависимость эффекта от времени инкубации опухолевых клеток с соединениями, максимальный эффект достигался через 72 ч после начала инкубации. Таким образом, цитотоксическая активность производных индола снижается в ряду: индол-3-пропионат>индол-3-уксусная кислота>индол-3-молочная кислота.

Пример 3

Оценка острой токсичности индол-3-пропионата при разных способах введения в организм животных

Пероральное введение суспензии индол-3-пропионата

Суспензию, содержащую 50 мг/мл индол-3-пропионата и 0,9% натрия хлорида, вводили мышам перорально в виде однократно или дробно (с интервалом в 2 часа) в дозах, равных 2000 мг/кг (дробно: 2-кратно с интервалом в 2 часа), 1500 мг/кг (дробно: 2-кратно с интервалом в 2 часа), 1000 мг/кг (однократно), 750 мг/кг (однократно) и 500 мг/кг (однократно). Результаты исследования представлены в таблице 3.

Пероральное введение индол-3-пропионата мышам в указанных дозах не приводило к гибели животных от токсичности, клинические признаки интоксикации отсутствовали в течение всего срока наблюдения за животными (15 суток): мыши были активны, реакция на человека, тактильные и болевые раздражители были выражены (таблица 3). Признаков поражения внутренних органов и тканей у животных опытных и контрольной группах выявлено не было.

Пероральное введение раствора индол-3-пропионата

Раствор, содержащий 4,0% Cremophor EL, 0,9% натрия хлорида и 5,0 мг/мл индол-3-пропионата вводили мышам перорально однократно или дробно (с интервалом в 2 часа) в дозах, равных 400 мг/кг (дробно: 4-кратно с интервалом в 2 часа), 200 мг/кг (дробно: 2-кратно с интервалом в 2 часа), 100 мг/кг (однократно) и 50 мг/кг (однократно).

Пероральное введение субстанции индол-3-пропионата мышам в указанных дозах не приводило к гибели животных от токсичности. После дробного введения индол-3-пропионата в дозе, равной 400 мг/кг, у мышей после 3-го введения раствора отмечали снижение двигательной активности и заторможенность, которые сохранялись в течение суток после последнего введения субстанции индол-3-пропионата (таблица 4). При использовании более низких доз индол-3-пропионата (200 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг) у мышей внешние признаки интоксикации отсутствовали (таблица 4).

При дробном введении 4,0%-ного раствора Cremophor EL, у мышей наблюдали такие же внешние проявления интоксикации, как и в случае дробного введения субстанции индол-3-пропионата в дозе, равной 400 мг/кг. Таким образом, при пероральном дробном введении субстанции индол-3-пропионата в виде раствора в дозе, равной 400 мг/кг, у мышей наблюдали обратимое (в течение 24 ч) снижение двигательной активности и заторможенность, которые были обусловлены токсическими свойствамирастворителя - Cremophor EL. Признаков поражения внутренних органов и тканей у животных в опытной и контрольной группах выявлено не было.

Таким образом, при однократном пероральном введении соединения доза индол-3-пропионата в виде суспензии (концентрация - 50 мг/мл; растворитель - 0,9% раствор хлористого натрия) не должна превышать 2000 мг/кг; при многократном ежедневном применении субстанции суммарная курсовая доза не должна превышать 2000 мг/кг. При однократном пероральном введении индол-3-пропионата в виде раствора (концентрация -5,0 мг/мл; растворитель - 2,5%, 4,0% и 1,0% раствор Cremophor EL, соответственно) разовая доза субстанции не должна превышать 400 мг/кг; при многократном применении суммарная курсовая доза не должна превышать 400 мг/кг.

Внутривенное введении раствора индол-3-пропионата

Раствор, содержащий 4,0% Cremophor EL, 0,9% натрия хлорида и 5,0 мг/мл индол-3-пропионата вводили мышам внутривенно однократно или дробно (с интервалом в 2 часа) в дозах, равных 400 мг/кг (дробно: 4-кратно с интервалом в 2 часа), 200 мг/кг (дробно: 2-кратно с интервалом в 2 часа), 100 мг/кг (однократно) и 50 мг/кг (однократно).

Результаты исследования представлены в таблице 5. Внутривенное введение субстанции индол-3-пропионата мышам в указанных дозах не приводило к гибели животных от токсичности. После дробного введения субстанции индол-3-пропионата в дозе, равной 400 мг/кг, у мышей после 4-го введения раствора субстанции отмечали снижение двигательной активности, заторможенность и каталепсию I степени, которые сохранялись в течение суток после последней инъекции субстанции (таблица 5). При использовании более низких доз субстанции индол-3-пропионата, равных 200 мг/кг, 100 мг/кг и 50 мг/кг, у мышей внешние признаки интоксикации отсутствовали в течение всего периода времени наблюдения за животными: мыши были активны, реакция на человека, тактильные и болевые раздражители были выражены (таблица 5).

При дробном введении растворителя - 4,0% раствора Cremophor EL, у мышей наблюдали такие же внешние проявления интоксикации, как и в случае дробного введения субстанции индол-3-пропионата в дозе, равной 400 мг/кг.

При аутопсии и макроскопическом исследовании внутренних органов и тканей мышей, получавших однократно (или дробно в течение дня) перорально субстанцию индол-3-пропионата в дозах, равных 400 мг/кг, 200мг/кг, 100 мг/кг и 500 мг/кг, и контрольных мышей, получавших перорально 4,0% раствор Cremophor EL и 0,9% раствор натрия хлорида (подвергнутых эвтаназии на 15 сутки после введения субстанции и контрольных веществ), различий у животных опытных и контрольных группах выявлено не было.

Пример 4

Оценка противоопухолевой активности индол-3-пропионата при пероральном и внутривенном введении мышам

Предметом исследования является оценка влияния индол-3 -пропионата на рост карцином легкого мышей LLC1 и СМТ167. Из данных литературы известно, что индол-3-пропионат нецелесообразно рассматривать как прямой цитостатический агент. В подавляющем большинстве случаев такого типа соединения проявляют слабое ингибирующее действие в отношении роста карциномы, причем проявляют его очень избирательно, замедляя рост только одной или ограниченного количества гистологических форм ЗНО.

Для оценки влияния индол-3-пропионата на рост перевиваемых опухолей целесообразно использовать широкий набор критериев, позволяющих оценить противоопухолевую эффективность. В случае солидных опухолей используют оценку динамики роста опухоли, торможение роста опухоли и продолжительность жизни животных. Оценку лечебных эффектов индол-3-пропионата проводили на основании полученных в экспериментах числовых значений используемых критериев по интегральной шкале, где «О» - отсутствие эффекта, «+/-» - тенденция к положительному эффекту (тенденция к ингибированию роста), «+» -положительный эффект (ингибирование роста опухоли), «-/+» - тенденция к отрицательному эффекту (тенденция к стимуляции роста), «-» -отрицательный эффект (стимуляция роста опухоли).

Для перорального введения применяли суспензию, содержащую50 мг/мл индол-3-пропионата в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Суспензию вводили перорально в разовых дозах 30 мг/кг и 3 мг/кг ежедневно в течение 13 дней в Дни 1-13 (курсовые дозы - 390 мг/кг и 39 мг/кг, соответственно).

Для внутривенного введения применяли раствор, содержащий 4,0% Cremophor EL, 0,9% натрия хлорид и 5,0 мг/мл индол-3-пропионата. Раствор вводили мышам внутривенно в разовых дозах 130 мг/кг и 13 мг/кг трехкратно с интервалом 4 дня - в День 1, День 5, День 9 (курсовые дозы -390 мг/кг и 39 мг/кг, соответственно), где День 1 - день начала лечения животных при достижении объема опухоли 50±20 мм³.

Результаты оценки противоопухолевого действия индол-3-пропионата на модели перевиваемой опухоли мышей LLC1 приведена в таблице 6, из которого следует, что при пероральном приеме индол-3-пропионат оказывал слабое, но биологически значимое противоопухолевое действие (по интегральной шкале «+» - положительный эффект). С 12 по25-й день наблюдения, торможение роста опухоли достигало до 30%, без существенного влияния на показатели выживаемости мышей - СПЖ и УПЖ.

Оценка динамики роста LLC1 под влиянием индол-3-пропионата свидетельствует о том, что его внутривенное введение в разовых дозах 130 мг/кг и 13 мг/кг приводит к слабому ингибирующему действию в отношении первичной опухоли: ТРО в группах «(130 мг/кг)» и «(13 мг/кг)» составляло 37,1-35,0% и 35,1-34,1%, соответственно. На модели LLC1 наблюдали улучшение результатов лечения по показателям выживаемости животных с опухолями по сравнению с контролем при внутривенном введении индол-3-пропионата в максимальной дозе 130 мг/кг (таблица 6).

Сравнение средней продолжительности жизни животных при воздействии индол-3-пропионата в этих дозах выявило преимущество терапии в режиме внутривенного введения в максимальной дозе - 130 мг/кг.

Результаты оценки противоопухолевого действия индол-3-пропионата на модели перевиваемой опухоли мышей СМТ167 приведена в таблице 7, из которой следует, что индол-3-пропионата при пероральном приеме оказывал слабое, но биологически значимое противоопухолевое действие в отношении перевиваемой опухоли СМТ167 (по интегральной шкале «+» - положительный эффект). Эффект по интегральной шкале можно оценить как «+» - положительный эффект (ингибирование роста опухоли). С 12 по 30-й день наблюдения, торможение роста опухоли стабильно поддерживалось на уровне 30%, достигая 43%, без существенного влияния на показатели выживаемости мышей - СПЖ и УПЖ. При внутривенном введении статистически достоверных различий по объему опухолевых очагов в группах животных, которым внутривенно вводили индол-3-пропионат в разовых дозах 130 мг/кг и 13 мг/кг достигнуто не было: показатели ТРО на 15 сутки наблюдения составили 44,0% и 42,5%, на 30 сутки - 31,3% и 28,8%, а на 35 сутки наблюдения показатель ТРО снижался до 29,8% и 24,7%, соответственно (таблица 7).

Сравнение эффективности двух режимов лечения по показателю ТРО показало, что оптимальным является внутривенное введение индол-3-пропионата в разовой дозе 130 мг/кг (курсовая доза - 390 мг/кг). Эффект по интегральной шкале можно оценить как «+» - положительный эффект (ингибирование роста опухоли).

Таким образом, вариант режима внутривенного введения индол-3-пропионата в разовой дозе 130,0 мг/кг позволил достичь максимального терапевтического эффекта по интегральной шкале в отношении перевиваемых опухолей СМТ167 и LLC1, и может быть использован висследованиях по оценки противоопухолевой эффективности индол-3 -пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов на фоне применения моноклонального антитела к PD-1.

Пример 5

Исследование противоопухолевого действия комбинации индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов на фоне ингибитора ИКТ

Исследования по оценке противоопухолевой эффективности комбинации индол-3-пропионата, трансплантации пробиотических микроорганизмов {Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei 29n_21 и Bifidobacterium longum subsp.longum 202_21) на фоне анти-PD-1 препарата проводили на мышах с перевитыми опухолями LLC1 и СМТ167. Для исследования были сформированы 12 экспериментальных групп, включая основные, контрольную и группы сравнения, для каждой модели перевиваемой опухоли. Дизайн исследования по оценке противоопухолевой эффективности комбинированного применения IPA, трансплантации пробиотических микроорганизмов и анти-PD-1 препарата на мышах с перевитыми опухолями представлен на фигуре 4.

Индол-3-пропионат вводили животным трехкратно в разовой дозе 130 мг/кг с интервалом 4 дня - в День 1, День 5, День 9 (курсовая доза - 390 мг/кг), где День 1 - день начала лечения животных при достижении объема опухоли 50±20 мм³. Анти-PD-1 препарат вводили трехкратно внутривенно в терапевтической дозе 10 мг/кг в День 2, День 6 и День 10 (курсовая доза -30 мг/кг). Трансплантацию пробиотических штаммов микроорганизмов проводили путем их перорального введения 6 раз (дважды по 3 раза ежедневно с интервалом между 3-х кратными введениями 4 суток) в Дни 1, 2, 3 и Дни 7, 8 и 9 по 100 мкл/мышь. После проведенного лечения на 14 сутки наблюдения у 8 животных из каждой группы производили забор биоматериала (фекалии и сыворотка крови). На этот срок наблюдения производили забор опухолевых узлов во всех группах животных для проведения морфологического и иммуногистохимического анализа.

Оценка противоопухолевой эффективности комбинации индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов мышам с опухолями LLC1 на фоне ингибитора ИКТ

Результаты исследования представлены в таблице 8. Как видно из •представленных данных, эффективность внутривенного введения индол-3-пропионата в разовой дозе 130 мг/кг (курсовая доза - 390 мг/кг) по показателю ТРО варьировала от 41,4% до 31,4% в течение 5 дней после окончания лечения, снижаясь до 21,4% к 29 дню наблюдения. Выживаемость животных и их средняя продолжительность жизни была на уровне контрольной группы: показатель УПЖ составил всего 7,7%.

Проведенные исследования показали, что трансплантация пробиотических микроорганизмов путем перорального трехкратного введения в дозе 100 мкл/мышь с интервалом в 4 сут на ранней или поздней стадии развития опухоли LLC1 не оказывала существенного влияния на течение опухолевого процесса.

Применение комбинации индол-3-пропионата и пробиотических штаммов микроорганизмов не приводило к увеличению эффективности лечения мышей с опухолями LLC1: динамика роста опухоли и показатели ТРО не отличались от таковых у мышей, которым вводили только индол-3-пропионат.В то же время была отмечена отчетливая тенденция к увеличению продолжительности жизни животных, хотя и биологически незначимому: показатель УПЖ составил 12,5% и 11,2%, соответственно (таблица 8).

Трехкратное введение моноклонального антитела к PD-1 в разовой дозе 10 мг/кг (курсовая доза - 30 мг/кг) на ранней стадии развития опухоли не отражалось на росте первичной опухоли, но вызывало достоверное уменьшение объема опухоли на 8 день после окончания лечения (ТРО=46,6%). Однако эта тенденция не сохранялась, так как к 12 дню наблюдения показатель ТРО составил 42,6%, но при этом было зарегистрировано увеличение продолжительности жизни животных на 21,1%.

Применение комбинации анти-PD-1 препарата и пробиотическимх штаммов микроорганизмов не приводило к статистически значимому увеличению эффективности по показателю ТРО, значения которого колебались в течение всего срока наблюдения в тех же пределах, что и в группе животных, получавших ингибитор ИКТ в монотерапии. Выживаемость животных и их средняя продолжительность жизни была выше, чем в группе животных, получавших анти-PD-1 препарат: показатель УПЖ составил 28,9% и 27,6%, соответственно, против 21,1%. Важно отметить, что эффективность комбинации анти-PD-1 препарата и пробиотических штаммов микроорганизмов по показателю ТРО была немного выше (47,1-51,7%), чем в группе животных с трансплантацией пробиотических микроорганизмов. Однако отмеченные различия нивелировались данными о продолжительности жизни животных в этих группах, которые достоверно не различались.

Полученные данные по комбинированному применению анти-PD-1 препарата и индол-3-пропионата свидетельствуют об отсутствии терапевтической выгоды этой комбинации: показатели ТРО были сходны по значениям с вариантом применения анти-PD-1 препарата в монорежиме.

Оценка противоопухолевого действия комбинации индол-3 -пропионата и моноклонального антитела к белку PD-1 на фоне трансплантации пробиотических микроорганизмов выявила преимущество схемы лечения с пробиотическим штаммом микроорганизмов, которое выражалось в торможении роста первичной опухоли. Показатель ТРО составил 58,0%-59,2% к 12-ому дню наблюдения после окончания лечения, что было сопоставимо с повышением продолжительности жизни животных: показатель УПЖ составил 41,0% в группе животных с приемом индол-3-пропионата, анти-PD-l препарата и трансплантацией пробиотических микроорганизмов (таблица 8).

Иммуногистохимический анализ представленности иммунокомпетентных клеток в опухолях LLC 1 мышей контрольной группы указал на наличие единичных позитивно окрашенных CD4⁺ и CD8⁺Т - клеток, а также CD86⁺ макрофагов, диффузно рассеянных среди волокон соединительной ткани в перитуморальной зоне и по периферии опухолей. При микроскопическом исследовании гистологических препаратов карцином LLC1 выделенных от животных, получавших индол-3-пропионат, или пероральное введение пробиотических препаратов в монорежиме, а также в комбинациях, представленность и распределение субпопуляций иммунокомпетентных клеток не отличались от контроля. При введении в схему лечения анти-PD-1 препарата как в монорежиме, так и в комбинации с индол-3-пропионатом и трансплантацией пробиотических микроорганизмов, морфологический ответ опухолей отсутствовал, а распределение субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺Т - клеток и CD86⁺ макрофагов не отличалось от контроля.

Оценка противоопухолевой эффективности сочетанного применения индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических микроорганизмов мышам с опухолями СМТ167 на фоне ингибитора ИКТ

Результаты исследования противоопухолевой активности представлены в таблице 9. Было показано, что внутривенное введение индол-3-пропионата в разовой дозе 130 мг/кг (курсовая доза - 390 мг/кг) приводило к торможению роста опухоли на 39,7% (5 сутки после окончания лечения), которое снижалось до 20,8% (35 день наблюдения). Выживаемость животных и их средняя продолжительность жизни была на уровне контрольной группы. Трехкратное пероральное введение пробиотических штаммов микроорганизмов с интервалом в 4 дня не оказывало влияния на течение опухолевого процесса.

Комбинированное применение индол-3-пропионата и пробиотических штаммов микроорганизмов не приводило к увеличению эффективности лечения мышей: динамика роста опухоли не отличались от таковых у мышей, которым вводили только индол-3-пропионата. Была отмечена тенденция к увеличению показателя УПЖ на 15,5% у животных, получавших индол-3-пропионат и пробиотические штаммы микроорганизмов.

Трехкратное введение моноклонального антитела к PD-1 в разовой дозе 10 мг/кг (курсовая доза - 30 мг/кг) на ранней стадии развития опухоли не оказывало влияние на рост первичной опухоли; эффект был отмечен только по окончанию лечения - на 4-9 сутки: показатель ТРО составил около 50% и далее снижался до 32,7% к 16 дню наблюдения; показатель УПЖ составил 34,7%.

Применение комбинации анти-PD-1 препарата с пробиотическими штаммами микроорганизмов не приводило к статистически значимому увеличению эффективности лечения по показателю ТРО. Выживаемость животных и их средняя продолжительность жизни была выше, чем в группе животных, получавших анти-PD-1 препарат: показатель УПЖ составил около 28% против 21%. Важно отметить, что эффективность комбинации анти-PD-1 препарата и пробиотических штаммов микроорганизмов по показателю ТРО была выше (ТРО=47-52%), чем в группе животных, которым были трансплантированы пробиотические микроорганизмы по аналогичной схеме.

Полученные данные по комбинации анти-PD-1 препарата и индол-3-пропионата свидетельствуют об отсутствии терапевтической выгоды этой комбинации: показатели ТРО были сходны по значениям этого показателя в группе животных, получавших анти-PD-1 препарат.

Применение комбинации индол-3-пропионата, анти-PD-1 препарата и трансплантации пробиотических микроорганизмов показало, что показатели ТРО превышали таковые в группах животных, которые получали анти-PD-1 препарат. Показатели ТРО достигали 58-61%против 49-52% в группе с применением анти-PD-1 препарата на 20-25 день наблюдения. При этом комбинированное воздействие вызывало более устойчивый противоопухолевый эффект: средняя продолжительность жизни животных составила 62 сут против 51 сут в группе с применением анти-PD-1 препарата.

На основании полученных данных можно заключить, что применение комбинации, состоящей из индол-3-пропионата, анти-PD-1 препарата и трансплантации пробиотических микроорганизмов на животных моделяхможет быть признано эффективным, поскольку отмечали не только задержку и торможение роста перевитых опухолей, но и биологически значимое увеличение продолжительности жизни животных на 63,4%.

Иммуногистохимическое исследование не выявило изменений в представленности субпопуляций иммунокомпетентных клеток CD4⁺, CD8⁺ и CD86⁺, инфильтрирующих опухоли, при применении индол-3-пропионата и пробиотического препарата как в монорежимах, так и в комбинации друг с другом.

Исследование гистологической структуры опухолевых узлов мышей с введением в схему лечения анти-PD-1 как в монорежиме, так и в комбинации с индол-3-пропионатом и трансплантаций пробиотических микроорганизмов показало, что по всем морфологическим критериям состояние карцином СМТ167 не отличалось от контроля.

При изучении на качественном уровне содержания и состава иммунокомпетентных клеток в перитуморальной зоне опухолевых узлов указанных групп обращало на себя внимание увеличение представленности воспалительного инфильтрата лимфоцитов, по сравнению с контролем. В опухолевой паренхиме иособенно в периферических ее участках встречались диффузно рассеянные лимфоциты, располагавшиеся периваскулярно и одиночно в тонких прослойках стромы. В поле зрения объектива ×40 эти клетки встречались гораздо чаще, чем в опухолевых узлах на контроле.

Иммуногистохимический анализ подтвердил эти наблюдения. В гистологических препаратах опухолевых узлов от животных, которые получали анти-PD-1 препарат отмечено увеличение представленности CD4⁺ Т-клеток в перитуморальной зоне и в паренхиме опухолей, по сравнению с контролем.

Таким образом, проведенные исследования на моделях рака легкого мышей LLC1 и СМТ167 показали, что комбинация индол-3-пропионата и трансплантации пробиотических штаммов микроорганизмов Lacticaseibacillus paracasei subsp.Paracasei и Bifidobacterium longum subsp.Longum на фоне введения анти-PD-l препарата приводит к повышению противоопухолевой эффективности иммунотерапевтической схемы.

Изобретение направлено на увеличение противоопухолевой эффективности иммунотерапии ингибиторами рецептора программируемой клеточной гибели 1 (PD-1). Способ повышения эффективности ингибиторов PD-1 включает введение низкомолекулярного соединения индол-3-пропионата и пробиотического средства на основе штаммов микроорганизмов Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 29n_21 (регистрационный номер VKM B-3711D) и Bifidobacterium longum subsp. longum 202/21 (регистрационный номер VKM B-3717D), причем индол-3-пропионат и пробиотическое средство не смешиваются перед введением. Индол-3-пропионат вводят в форме раствора, содержащего до 4% этоксилированного касторового масла и пригодного для перорального или внутривенного пути введения, причем доза индол-3-пропионата в виде раствора при однократном пероральном и внутривенном введении не должна превышать 400 мг/кг, а при многократном применении суммарная курсовая доза не должна превышать 400 мг/кг. Одна доза пробиотического средства содержит лакто-N-биозу, хитозан, 7×10⁷ КОЕ Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и 8×10⁷ КОЕ Bifidobacterium longum subsp. Longum. Изобретение обеспечивает повышение противоопухолевой эффективности иммунотерапевтической схемы. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 табл., 5 пр.

1. Способ повышения эффективности ингибиторов рецептора программируемой клеточной гибели 1 (PD-1), включающий введение низкомолекулярного соединения индол-3-пропионата и пробиотического средства на основе штаммов микроорганизмов Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 29n_21 (регистрационный номер VKM B-3711D) и Bifidobacterium longum subsp. longum 202/21 (регистрационный номер VKM B-3717D), причем индол-3-пропионат вводят в форме раствора, содержащего до 4% этоксилированного касторового масла и пригодного для перорального или внутривенного пути введения; при этом одна доза пробиотического средства содержит лакто-N-биозу, хитозан, 7×10⁷ КОЕ Lactobacillus paracasei subsp. paracasei и 8×10⁷ КОЕ Bifidobacterium longum subsp. longum; доза индол-3-пропионата в виде раствора при однократном пероральном и внутривенном введении не должна превышать 400 мг/кг, а при многократном применении суммарная курсовая доза не должна превышать 400 мг/кг, причем индол-3-пропионат и пробиотическое средство не смешиваются перед введением.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что терапевтическая композиция предназначена для применения, в первую очередь, в схеме иммунотерапии рака легкого, а также других типов злокачественных новообразований, для лечения которых назначают ингибиторы PD-1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве ингибиторов PD-1 используют моноклональные антитела или пептиды, или низкомолекулярные соединения, которые, связываясь с PD-1, ингибируют активность сигнального пути с участием PD-1 и его лиганда PD-L1.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что индол-3-пропионат вводят трехкратно в разовой дозе 130 мг/кг с интервалом 4 дня (день 1, 5 и 9), а пробиотическое средство вводят шестикратно (день 1, 2 и 3, и день 7, 8 и 9) на фоне ингибитора PD-1, который вводят трехкратно в дозе 10 мг/кг (день 2, 6 и 10).