НОВЫЕ ГИДРОГЕНАЗЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ THERMOCOCCUS SPP., ГЕНЫ, КОДИРУЮЩИЕ ЭТИ ГИДРОГЕНАЗЫ, И СПОСОБЫ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВОДОРОДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ, СОДЕРЖАЩИХ УКАЗАННЫЕ ГЕНЫ Российский патент 2013 года по МПК C12N9/04 C12N15/52 C12P3/00 

Предпосылки создания изобретения

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым гидрогеназам, выделенным из новых штаммов, принадлежащих к роду Thermococcus; к генам, кодирующим указанные гидрогеназы; и к способам получения водорода с использованием штаммов, имеющих указанные гены.

Предшествующий уровень техники

Энергетическая ценность водорода привлекает внимание специалистов как источник энергии нового поколения, который может заменить ископаемое топливо, поскольку его теплотворная способность на единицу массы по меньшей мере в три раза превышает теплотворную способность нефтяного топлива, но при этом указанное топливо не выделяет веществ, которые могут оказывать негативное воздействие на окружающую среду, например, таких как двуокись углерода, NOx и SOx.

Традиционные способы получения водорода включают электролиз воды и термокрекинг или конверсию природного газа или сырой нефти (лигроина) с водяным паром. Однако осуществление этих способов сталкивается с определенными проблемами, заключающимися в том, что обработка ископаемого топлива должна проводиться при высоких температурах и высоком давлении. Кроме того, при осуществлении этих методов образуются смешанные газы, содержащие монооксид углерода, что требует применения сложных технологий по удалению монооксида углерода из смешанных газов.

С другой стороны, биологические способы получения водорода с использованием микроорганизмов имеют преимущества, заключающиеся в том, что они могут быть осуществлены в условиях, не требующих высоких температур и высокого давления, путем подведения отдельной энергии, а также в том, что вырабатываемые при этом газы не содержат монооксида углерода. Такие биологические способы получения водорода могут быть грубо разделены на способы на основе фотосинтезирующих микроорганизмов и способы на основе нефотосинтезирующих микроорганизмов (главным образом, анаэробных микроорганизмов). Примеры вышеупомянутых способов включают способ, описанный в Корейском патенте рег. No. 10-0680624, озаглавленном «Способ получения водорода с использованием фотосинтезирующих бактерий штамма Rhodobacter sphaeroides, обладающего высокой продуктивностью водорода при высокой концентрации соли».

Однако технология культивирования фотосинтезирующих бактерий при высокой концентрации соли с использованием света в качестве источника энергии пока еще недостаточно разработана, и используемые ранее фотосинтезирующие бактерии имеют тот недостаток, что в них ингибирование субстрата затрудняется при высоком парциальном давлении субстрата. Кроме того, указанные бактерии имеют тот недостаток, что их способность продуцировать водород может поддерживаться только под действием света.

Поэтому до сих пор продолжают предприниматься попытки разработать способ получения водорода с использованием микроорганизмов, которые могут продуцировать водород, используя органический углерод, и примеры таких способов описаны в Корейском патенте рег. No. 10-0315663, озаглавленном «Citrobacter sp. Y19 и получение водорода с использованием этого микроорганизма», и в Корейском патенте рег. No. 10-0315662, озаглавленном «Rhodopseduomonas palustris P4 и получение водорода с использованием этого микроорганизма».

Ранее, то есть 5 сентября 2008 года, авторами настоящего изобретения была подана патентная заявка (заявка на патент Кореи рег. No. 10-2008-0087794), относящаяся к новым белкам, выделенным из новых гипертермофильных Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: КСТС 10859ВР), и к генам, кодирующим такие белки, и настоящее изобретение, в частности, относится к тем генам и белкам из числа уже описанных в настоящей заявке, которые связаны с продуцированием водорода. Авторами настоящего изобретения были проведены эксперименты по оценке способности вышеописанного штамма продуцировать водород, и в результате этих экспериментов было обнаружено, что вышеуказанный штамм продуцирует большое количество водорода даже в условиях высоких температур и, кроме того, были обнаружены новые гидрогеназы, которые в высокой степени экспрессируются, в частности, в условиях культивирования с добавлением монооксида углерода (СО) или формиата, что послужило основой для создания настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является получение гидрогеназ, выделеных из гипертермофильных микроорганизмов Thermococcus spp., которые могут продуцировать водород даже в условиях высоких температур, и генов, кодирующих указанные гидрогеназы, а также разработка эффективных способов получения водорода с использованием штаммов, имеющих указанные гены.

Для достижения этих целей было разработано настоящее изобретение, которое относится к гидрогеназам, выделенным из штамма Thermococcus spp., способного продуцировать водород в аэробных условиях культивирования, и к генам, кодирующим указанные гидрогеназы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода путем культивирования указанного штамма и к способу получения водорода с использованием указанных генов.

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к гидрогеназам, продуцируемым новым гипертермофильным штаммом Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: KCTC 10859BP). T. onnurineus NA1 имеет восемь новых кластеров генов гидрогеназы, и аминокислотные последовательности гидрогеназ, принадлежащих этим кластерам, представлены в SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8.

Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к генам, кодирующим указанные аминокислотные последовательности. Такими генами, предпочтительно, являются, но не ограничиваются ими, гены, представленные в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19 (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8 соответствуют генам, представленным в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, соответственно).

В третьем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения водорода путем культивирования Thermococcus spp. Этот способ включает стадии: 1) приготовления среды в сосуде для культивирования; 2) культивирование Thermococcus spp. в сосуде для культивирования; 3) извлечения водорода из сосуда для культивирования. Микроорганизмом Thermococcus spp., предпочтительно, является Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: КСТС 10859ВР).

Кроме того, указанной средой может быть среда, в которую были добавлены один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из монооксида углерода, формиата и крахмала. Культивирование может быть осуществлено при высокой температуре 80°С в анаэробных условиях.

В четвертом аспекте, настоящее изобретение относится к дегидрогеназе, содержащей по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 11.

В пятом аспекте, настоящее изобретение относится к гену, кодирующему дегидрогеназу. Предпочтительно, указанный ген имеет последовательность оснований, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 20 - SEQ ID NO: 22 (аминокислоты SEQ ID NO: 9-11 соответствуют SEQ ID NO: 20-22, соответственно).

В шестом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназные кластеры CODH-MCH-MNH3 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительно гены включают, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO: 21 (CODH-дегидрогеназы) и SEQ ID NO: 16 (MCH-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления среды в сосуде для культивирования; подачи монооксида углерода в газовую фазу, присутствующую в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В седьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназный кластер FDH2-MFH2-MNH2 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительно гены включают, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:22 (FDH2-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:18 (MFH2-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления, содержащей формиат среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В восьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназный кластер FDH1-MFH1-MNH1 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительно гены включают, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:20 (FDH1-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:13 (MFH1-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления содержащей крахмал среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

Способы получения водорода, в отличие от применяемых ранее химических способов получения водорода, имеют те преимущества, что они не требуют создания специальных условий, а именно высоких температур и высокого давления, и позволяют получать водород при температуре окружающей среды и при атмосферном давлении, а также не приводят к образованию вредных побочных продуктов. Кроме того, способы согласно изобретению имеют то преимущество, что, в отличие от известных способов получения водорода с использованием микроорганизмов, они являются гораздо более эффективными и позволяют получать водород высокой чистоты даже при высокой температуре.

Поэтому настоящее изобретение является экономически выгодным, поскольку оно позволяет исключить монооксид углерода при высокой температуре в процессе очистки нефти и т.п. и может быть непосредственно использовано для получения водорода без проведения отдельной стадии охлаждения после поглощения монооксида углерода. Кроме того, настоящее изобретение может быть использовано для кондиционирования воздуха.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

На фиг.1 представлена диаграмма Венна, иллюстрирующая общие и уникальные части протеома (совокупоности белков) четырех штаммов Thermococcales, T. onnurineus NA1 (NA1), T. kodakaraensis, P. furiosus и P. abyssi. Набор белков для этих штаммов был взят из коллекции RefSeq в NCBI.

На фиг.2A представлена репрезентативная карта восьми кластеров генов гидрогеназы в T. onnurineus NA1. А, В, С и D: мембраносвязанные гидрогеназы и цитоплазматические NiFe-гидрогеназы. S1, S2 и S3: T. onnurineus NA1. Гены были окрашены в соответствии с функциональными категориями COG. TON_0051-0055 представляют собой SEQ ID NO: 1-5; TON_0486-0498 представляют собой SEQ ID NO: 35-47; TON_0533-0544 представляют собой SEQ ID NO: 48-59; TON_1583-1595 представляют собой SEQ ID NO: 100-112; TON_0261-0289 представляют собой SEQ ID NO: 6-34; TON_1016-1031 представляют собой SEQ ID NO: 60-75; а TON_1559-1582 представляют собой SEQ ID NO: 76-99.

На фиг.2B представлена организация генов из трех кластеров генов гидрогеназ (fdh1-mfh1-mnh1, fdh2-mfh2-mnh2 и codh-mch-mnh), имеющих 3-модульный генный кластер в геноме T. onnurineus NA1. Гены, принадлежащие к тем же самым субкластерам, показаны одним и тем же цветом.

На фиг.3 показаны паттерны распределения и консервативности кластеров генов гидрогеназы в 31 архегеноме. В синие скобки (первая скобка, третья скобка, пятая скобка снизу) заключены CDS, обнаруживающие низкое сходство (<25%) с любыми CDS из 31 архегенома. В черных скобках показаны CDS, аналогичные гидрогеназе 4 от P. abyssi. 31 археген представлен ниже:

№. Ген № Ген 1 Aeropyrum_pernix 17 Pyrococcus_abyssi 2 Pyrobaculum_aerophilum 18 Pyrococcus_furiosus 3 Sulfolobus_acidocaldarius_DSM_639 19 Pyrococcus_horikoshii 4 Sulfolobus_solfataricus 20 Thermococcus_kodakaraensis_KOD1 5 Sulfolobus_tokodaii 21 Archaeogiobus_fulgidus 6 Haloarcula_marismortui_ATCC_43049 22 Methanosarcina_barkeri_fusaro 7 Natronomonas_pharaonis 23 Methanosarcina_mazei 8 Halobacterium_sp 24 Metnanosarcina_acetivorans 9 Haloquadratum_walsbyi 25 Methanospirillum_hungatei_JF-1 10 Methanococcoides_burtonii_DSM_6242 26 Methanobacterium_thermoautotrophicum 11 Picrophilus_torridus_DSM_9790 27 Methanococcus_jannaschii 12 Thermoplasma_acidophilum 28 Methanococcus_maripaludis_S2 13 Thermoplasma_volcanium 29 Methanosphaera_stadtmanae 14 Methanosaeta_thermophila_PT 30 Methanopyrus_kandleri 15 Pyrobaculum_islandicum DSM_4184 31 Nanoarchaeum_equitans 16 Thermofilum_pendens_Hrk_5    

На фиг.4 и 5 проиллюстрировано сравнение α-субъединиц CODH- и F420-гидрогеназных белков. На фиг.4 представлено филогенетическое дерево CODH, а на фиг.5 представлено филогенетическое дерево α-субъединицы F420-гидрогеназы. Гомологи белков на филогенетическом дереве были взяты из базы данных NCBI.

На фиг.6 показан график роста T. onnurineus NA1 в зависимости от CO. T. onnurineus NA1 культивировали в среде 1, в которую были добавлены CO (дорожка 2; треугольники), сера (3; квадраты) или то и другое (дорожка 4; перевернутые треугольники). Были включены контроли без добавок (дорожка 1; кружки) и культура в среде YPS (C). DAPI-окрашенные клетки были непосредственно подсчитаны на фильтрах под флуоресцентным микроскопом. a: Влияние состава среды при различных концентрациях дрожжевого экстракта (YE). b: Кривые роста Т. onnurineus NA1 в среде 1 с другими добавками. c: Анализ транскрипции гена CODH.

На фиг.7 проиллюстрирован рост микроорганизма T. onnurineus NA1 и продуцирование водорода указанным микроорганизмом в YPS (A) или в CO-содержащей среде. Незаштрихованные кружки: рост; и заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

На фиг.8 проиллюстрирован анализ, проводимый с использованием микромассивов (microarray) (A), и ОТ-ПЦР-анализ (B) экспрессии кластеров генов гидрогеназы T. onnurineus NA1 в YPS (A) или в CO-содержащей среде (B). На фиг.8 (A) проиллюстрирован анализ восьми кластеров генов гидрогеназы в T. onnurineus NA1, проводимый с использованием микромассивов. Изменения в иерархической кластеризации мРНК в присутствии CO сравнивали с кластеризацией в культуральной среде YPS, используемой в качестве контроля. Стимуляция и ингибирование показаны красным и зеленым цветом, соответственно. Условия роста показаны в верхней части картины кластеризации. На правой стороне картины кластеризации, ОРС для каждого из codh-mch-mnh3, fdhl-mfhl-mnhl или fdh2-mfh2-mnh2 показаны в виде горизонтальных полос. YE: дрожжевой экстракт. На фиг.8 (B) представлены результаты количественного ОТ-ПЦР-анализа в присутствии CO или YPS, проводимого для каждой из крупных субъединиц гидрогеназ mbh (TON_1593), mbx (TON 0489), frh (TON_1560), sulf I (TON_0534), mch (TON_1023), mfh2 (TON_1569) и mfhl (TON_0276). Ген, кодирующий шаперонин (cha), использовали в качестве контроля для нормализации уровней экспрессии.

На фиг.9 представлено нарушение гена-мишени крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mch (TON_1023) и mfh2 (TON_1569). На фиг.9 (A) представлена организация гена каждого из кластеров codh-mch-mnh3 и fdh2-mfh2-mnh2 в T. onnurineus NA1. P_gdh: промоторная область, расположенная слева (выше) от 5'-конца гена глутамат-дегидрогеназы T. kodakaraensis KOD1; и hmg_Pfu: ген 3-гидрокси-метилглутарил-кофермент A-редуктазы Pyrococcus furiosus. На фиг.8(B) проиллюстрирована идентификация нарушения гена с помощью ПЦР. На левой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для области кассеты сверхэкспрессии (P_gdh-hmg_Pfu). На правой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mch _TNA1 и mfh2 _TNA1. M: маркер размера (l т.п.н.-лэддер); W: дикого типа; дорожки 1 и 2: мутантные штаммы.

На фиг.10 проиллюстрирован рост мутантных штаммов ^Δ mch _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 и продуцирование ими водорода в среде, содержащей YPS или CO. Незаштрихованные кружки: рост; заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

На фиг.11 проиллюстрирован рост T. onnurineus NA1 и продуцирование им водорода в среде, содержащей YPS (А) или формиат (В). Незаштрихованные кружки: рост; заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

На фиг.12 проиллюстрирован анализ, проводимый с использованием микромассивов (A) и ОТ-ПЦР-анализ (B) экспрессии кластеров гидрогеназы T. onnurineus NA1 в среде, содержащей YPS, (A) или в формиатсодержащей среде (B). На фиг.12 (A) проиллюстрирован анализ 8 кластеров генов гидрогеназы в T. onnurineus NA1, проводимый с использованием микромассивов. Изменения в иерархической кластеризации мРНК в присутствии формиата сравнивали с кластеризацией в культуральной среде YPS, используемой в качестве контроля. Стимуляция и ингибирование показаны красным и зеленым цветом, соответственно. Условия роста показаны в верхней части картины кластеризации. На правой стороне картины кластеризации, ОРС для каждого из кластеров mbh, codh-mch-mnhЗ, fdh1-mfh1-mnh1 и fdh2-mfh2-mnh2 показаны в виде горизонтальных полос. YE: дрожжевой экстракт. На фиг.12 (B) представлены результаты количественного ОТ-ПЦР-анализа в присутствии YPS, проводимого для каждой из крупных субъединиц гидрогеназ mbh (TON_1593), mbx (TON 0489), frh (TON_1560), sulf I (TON_0534), mch (TON_1023), mfh2 (TON_1569) и mfh1 (TON_0276). Ген T. onnurineus NA1, кодирующий шаперонин (cha), использовали в качестве контроля для нормализации уровней экспрессии.

На фиг.13 представлено нарушение гена-мишени крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mfh1 (TON_0276) и mfh2 (TON_1569). На фиг.13 (A) представлена организация гена каждого из кластеров fdh1-mfh1-mnh1 и fdh2-mfh2-mnh2 в T. onnurineus NA1. P_gdh: промоторная область, расположенная слева от 5'-конца гена глутамат-дегидрогеназы T. kodakaraensis KOD1; и hmg_Pfu: ген 3-гидрокси-метилглутарил-кофермент A-редуктазы Pyrococcus furiosus. На фиг.13 (B) проиллюстрирована идентификация нарушения гена с помощью ПЦР. На левой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для области кассеты сверхэкспрессии (P_gdh-hmg_Pfu). На правой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mfh1 _TNA1 и mfh2 _TNA1. M: маркер размера (1 т.п.н.-лэддер); W: дикого типа; дорожки 1 и 2: мутантные штаммы.

На фиг.14 проиллюстрирован рост мутантных штаммов ^Δ mch _TNA1, ^Δ mfh1 _TNA1 или ^Δ mfh2 _TNA1 и продуцирование ими водорода в среде, содержащей YPS или формиат. Незаштрихованные кружки: рост; и заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к гидрогеназам, продуцируемым новым гипертермофильным штаммом Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: KCTC 10859BP), который продуцирует водород в анаэробных условиях. Этот штамм был выделен из гидротермальной глубоководной дренажной зоны в регионе островов Манус в Тихом океане, а именно в бассейне восточных островов Манус. Выделенный штамм был депонирован в Корейской коллекции типовых культур (KCTC) при Корейском научно-исследовательском институте биологии и биотехнологии (KRIBB) 7 октября 2005, а 20 октября 2005 ему был присвоен рег. №: KCTC 10859BP. Свойства этого штамма и методы его культивирования описаны в заявке на патент Кореи No. 10-2007-0127255, на основе которой было разработано настоящее изобретение.

T. onnurineus NA1 имеет восемь новых кластеров генов гидрогеназы. Гидрогеназы являются ключевыми ферментами, которые имеют отношение к метаболизму молекулярного водорода (H₂), и действуют как катализаторы в следующей обратимой реакции: 2H⁺ + 2e^- ⇔ H₂. Предпочтительно, гидрогеназы, принадлежащие к вышеописанным кластерам, продуцируют белки и их функциональные эквиваленты, содержащие одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8. Используемый в настоящем документе термин «функциональный эквивалент» включает варианты аминокислотной последовательности, имеющие аминокислотные замены в некоторых или во всех белках, или аминокислотные добавления или делеции в некоторых из этих белков. Аминокислотными заменами, предпочтительно, являются консервативные замены. Примерами консервативных замен являются замены следующих природных аминокислот, таких как алифатические аминокислоты (Gly, Ala и Pro), гидрофобные аминокислоты (Ile, Leu и Val), ароматические аминокислоты (Phe, Tyr и Trp), кислотные аминокислоты (Asp и Glu), основные аминокислоты (His, Lys, Arg, Gln и Asn) и серусодержащие аминокислоты (Cys и Met). Делеции аминокислот, предпочтительно, присутствуют в области, которая не оказывает непосредственного влияния на активность гидрогеназ.

Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к генам, кодирующим вышеописанные аминокислотные последовательности. Такими генами, предпочтительно, являются, но не ограничиваются ими, гены, представленные в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19 (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8 соответствуют генам, представленным в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, соответственно).

В третьем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения водорода путем культивирования Thermococcus spp. Этот способ включает стадии: 1) приготовления среды в сосуде для культивирования; 2) культивирования Thermococcus spp. в сосуде для культивирования; и 3) извлечения водорода из сосуда для культивирования. Микроорганизмом Thermococcus spp., предпочтительно, является Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: КСТС 10859ВР).

Кроме того, указанной средой может быть среда, в которую были добавлены один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из монооксида углерода, формиата и крахмала. Культивирование может быть также осуществлено при высокой температуре 80°С в анаэробных условиях.

В четвертом аспекте, настоящее изобретение относится к дегидрогеназе, содержащей по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 11. Дегидрогеназы Fdh1 (SEQ ID NO: 20), Fdh2 (SEQ ID NO: 22) и CODH(SEQ ID NO: 21), соответственно, могут образовывать кластеры с гидрогеназами MFH1, MFH2 и MCH.

В пятом аспекте, настоящее изобретение относится к гену, кодирующему указанную дегидрогеназу. Предпочтительно, указанный ген выбран из генов, представленных в SEQ ID NO: 20 - SEQ ID NO: 22 (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9-11 соответствуют SEQ ID NO: 20-22, соответственно).

В шестом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназные кластеры CODH-MCH-MNH3 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительными генами являются, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:21 (CODH-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:16 (MCH-гидрогеназы). Используемый в настоящем документе термин «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая может иметь другую присоединенную к ней молекулу нуклеиновой кислоты.

В качестве экспрессионного вектора, который может синтезировать белок, кодируемый рекомбинантным геном, присутствующим в указанном векторе, могут быть использованы плазмида, космида или фаг. Предпочтительным вектором является вектор, который может самореплицироваться и экспрессировать нуклеиновую кислоту, связанную с этим вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным рекомбинантным вектором. Рекомбинантный вектор может быть использован для трансформации клеток, таких как прокариотические клетки, клетки грибов, клетки растений и клетки животных, в целях получения трансформированных клеток, которые могут продуцировать водород с высокой эффективностью. Используемый в настоящем документе термин «трансформация» означает абсорбцию чужеродной ДНК или РНК в клетки для изменения их генотипа. Для получения такой клетки-хозяина может быть использован общеизвестный метод трансформации каждой из указанных клеток.

Настоящее изобретение также относится к способу получения водорода с использованием указанных трансформантов, включающему стадии: приготовления среды в сосуде для культивирования; подачи монооксида углерода в газовую фазу, присутствующую в среде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В седьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназные кластеры FDH2-MFH2-MNH2 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительными генами являются, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:22 (FDH2-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:18 (MFH2-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному рекомбинантным вектором.

Подробное описание «вектора», «трансформации» и «клеток-хозяев» приводится выше в шестом аспекте.

Настоящее изобретение также относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления формиатсодержащей среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В восьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в FDH1-MFH1-MNH1-гидрогеназные кластеры в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительными генами являются, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:20 (FDH1-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:13 (MFH1-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному рекомбинантным вектором.

Подробное описание «вектора», «трансформации» и «клеток-хозяев» приводится выше в шестом аспекте.

Настоящее изобретение также относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления крахмалсодержащей среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения со ссылкой на примеры. В этой связи следует отметить, что эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема настоящего изобретения.

Пример 1: Анализ генов гидрогеназы штамма Thermococcus onnurineus NA1

(1) Тест-методы

1) Условия культивирования

Для осуществления рутинного культивирования клетки выращивали в анаэробных условиях при 80°С в среде, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-серу (YPS) (Holden et al. 2001). Физиологические тесты осуществляли с использованием модифицированной среды 1 (Sokolova, T. G., C. Jeanthon, N. A Kostrikina, N. A. Chernyh, A. V. Lebedinsky, E. Stackebrandt and E. A. Bonch-Osmolovskaya. 2004. «The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H₂ production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent». Extremophiles 8:317-323), в которую было добавлено 1 мл смеси микроэлементов, 1 мл раствора витамина (Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbio 1. Rev. 43:260-296), NaCl (30 г/л), и дрожжевой экстракт (0,5 г/л). pH доводили до 8,0 с использованием NaOH. Среду, полученную в анаэробных условиях, распределяли по 25-миллилитровым бутылям с сывороткой, и газовую фазу (15 мл) заменяли на N₂/CO₂ (80:20; 1 бар) или 100% CO. Если клетки культивировали в присутствии формиата или крахмала, то в среду добавляли 10 г/л формиата натрия (Sigma) или 5 г/л растворимого крахмала (Sigma), а затем автоклавировали. Все культуры для проведения физиологических тестов выращивали при 80°С в течение 2 дней.

2) Секвенирование генов

Последовательность генома T. onnurineus NA1 определяли путем секвенирования всего генома методом «дробового ружья» (shotgun) и пиросеквенирования. Для капиллярного секвенирования конструировали библиотеку со вставками размером 2 т.п.н.-3 т.п.н. (11028 клонов), библиотеку со вставкой размером 40 т.п.н. (1870 клонов) и библиотеку со вставкой размером 35 т.п.н. (288 клонов), и эти библиотеки секвенировали на секвенаторе ABI 3730XL (Applied Biosystems, CA). Для осуществления пиросеквенирования, 581990 фрагментов ДНК секвенировали на секвенаторе GS-20 (454 Life Sciences). Контиги, полученные на обоих секвенаторах, объединяли, и «закрытие» пропусков секвенирования осуществляли методом «прогулки по клонам» и методом ПЦР-секвенирования. Гены ОРС и РНК определяли с использованием комбинации программ Glimmer 3.0 (Универистет в шт. Мэриленд), GSFinder и RBSFinder, с последующей подгонкой ОРС вручную. После определения всех ОРС проводили дополнительный анализ последовательности белка с помощью поисковой программы BLASTP на последовательности белка в неизбыточных базах данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), в энциклопедии генов и геномов Киото (KEGG) и COG (базе данных кластеров ортологичных групп белков) (Tatusova, R. L., D. A. Natale, I. V. Garkavtsev, T. A. Tatusova, U. T. Shankavaram, B. S. Rao, B. Kiryutin, M. Y. Galperin, N. D. Fedorova and E. V. Koonin. 2001. The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29:22-28). Для определения тРНК использовали программу tRNAScan-SE (Lowe, Т. М., and S. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25:955-964).

3) Анализ белков

Клетки Т. onnurineus NA1 суспендировали в 100 мМ трис-HCl-буфере (pH 6,8), содержащем 4% додецилсульфат натрия (ДСН) и 4 мМ EDTA, и кипятили в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 22000g в течение 20 минут. Клеточный лизат отделяли с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), и получали 30 фракций исходя из размера их молекул. Затем эти фракции гидролизовали в геле с использованием трипсина (Promega, USA) (Kim, Y. H., K. Cho, S. H. Yun, J. Y. Kim, K. H. Kwon, J. S. Yoo, and S. I. Kim. 2006. Analysis of aromatic catabolic pathways in Pseudomonas putida KT 2440 by combined proteomic approach: 2-DE/MS and cleavable ICAT analysis. Proteomics 6:1301-1318), и трипсиновые гидролизаты растворяли в 0,5% растворе трифторуксусной кислоты для проведения масс-спектрометрического анализа (Thermo Finnigan LTQ IT). Идентичность пептидов определяли с помощью программы Sequest (Thermo Finnigan, San Jose, CA).

4) Выделение всей РНК и ОТ-ПЦР-анализ

50-миллилитровую культуру Т. onnurineus NA1 выращивали до средней экспоненциальной фазы роста в модифицированной среде 1, в которую были добавлены различные концентрации дрожжевого экстракта в газовой фазе, состоящей из N₂/CO₂ (80:20, 1 бар) или 100% CO. Клетки собирали путем центрифугирования при 6000g в течение 30 минут. Осадок ресуспендировали в 50 мкл 50 мМ трис-HCl-буфера (pH 7,5), в который было добавлено 500 мкл реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетки подвергали лизису путем замораживания и оттаивания, а затем образцы экстрагировали 200 мкл хлороформа. Водную фазу, содержащую всю РНК, дополнительно обрабатывали путем преципитации этанолом, а затем ресуспендировали в дистиллированной воде. Концентрацию и целостность РНК определяли путем измерения оптической плотности на 260 и 280 нм, а также с помощью анализа в 0,8% агарозном геле. Обратную транскрипцию и ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием обратной транскриптазы Superscript™ II (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей. Для амплификации CODH (окись углерода-дегидрогеназы) и Hsp60 (шаперонина), используемого в качестве контроля, применяли два набора нижеследующих праймеров:

Ген CODH (прямой праймер: 5'-GGACCATGTAGAATCGAYCCGTTY-3' (SEQ ID NO: 23) и обратный праймер 5'-TTCRTTTCCGGTACAGCA-3' (SEQ ID NO: 24)); и ген Hsp60 (прямой праймер: 5'-ATGGCACAGCTTAGTGGACAG-3' (SEQ ID NO: 25) и обратный праймер, 5'-CAAGGATTTCCTGGGCTTTCTC-3' (SEQ ID NO: 26)).

5) Компьютерный анализ

Поиск гомологии аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием программы BLAST в не-избыточной базе данных белков NCBI. Поиск мотива белков, имеющих сигнал L1 (C[GS][ILV]C[AGNS]xxH, где x означает любую аминокислоту) в гидрогеназах группы 4, осуществляли с использованием программы ProteinFinder (Ensoltek, Korea) в не-избыточной базе данных белков NCBI. Выравнивание множества последовательностей белков осуществляли с использованием программы ClustalW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680), и конструировали филогенетическое дерево с использованием компьютерной программы для молекулярно-эволюционного генетического анализа (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)(Mega 4.1) (Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599). Филогенетическое дерево для последовательностей рРНК 16S строили на основе последовательностей, подвергнутых предварительному выравниванию и взятых из базы данных для рибосом на сайте (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp).

6) Создание сигнатур logo-данных

Logo-представления данных использовали для визуализации объема информации, ассоциированного с каждым положением данного мотива, который является общим для родственных последовательностей. В графическом представлении, общая высота для каждого положения коррелирует с консервативностью в данном положении (выражено в битах), где относительные размеры символов в данном положении указывают на их относительную частоту. Logo-анализы осуществляли в Центре структурной геномики Беркли (http://weblogo.berkeley.edu/).

(2) Результат анализов

1) Общие признаки генов T. onnurineus NA1

Для получения какого-либо представления относительно факторов, которые вносят свой вклад в явно успешную конкуренцию Thermococcus spp. с другими микроорганизмами, обитающими в гидротермальной дренажной зоне, геномную последовательность T. onnurineus NA1 определяли комбинированным методом рандомизированного секвенирования всего генома, проводимым методом «дробовика» и пиросеквенирования. В результате было обнаружено, что T. onnurineus NA1 имеет одну кольцевую хромосому (1847607 п.н.), не содержащую каких-либо внехромосомных элементов, и было идентифицировано всего 1976 кодирующих последовательностей ДНК (CDS) (Таблица 1 и фиг.1). Из них 1104 CDS (55,8%) было выявлено путем поиска гомологии и доменов, но функция остальных 872 CDS не могла быть предсказана исходя из их первичной структуры. При поиске сходства белков в масштабе всего генома 82,7% белков T. onnurineus NA1 обнаруживали сходство с другими членами Thermococcales.

Таблица 1 Общие признаки генома T. onnurineus NA1 и штаммов T. kodakaraensis KOD1 и Pyrococcus   NA1 KOD1 P.abyssi P.horikoshii P.furiosus Размер генома (п.н.) 1847607 2088737 1765118 1738505 1908256 Белоккодирующие области 90,1% 92,1% 91,1% 91,2% 92,5% Содержание GC 51,0% 52,0% 44,7% 41,9% 40,8% CDS^a 1976 2306 1784 2064 2065 тРНК 46 46 46 46 46 рРНК 5S(x2), 7S,16S,32S 5S(x2),
7S,16S,32S 5S(x2), 7S,16S,32S 5S(x2),
7S,16S,32S 5S(x2),
7S,16S,32S ^a: Наборы белков для этих штаммов были получены из коллекции RefSeq в NCBI.

2) Кластеры гидрогеназ

В геноме T. onnurineus NA1 было обнаружено очень высокое содержание гидрогеназ и родственных белков (5,5%), что указывает на повышенную консервативность или рециклизацию восстановительного потенциала в отношении оксидоредуктаз, включая CO-дегидрогеназу и формиатдегидрогеназу.

Гидрогеназы могут быть разделены на следующие три основные группы, исходя из их каталитического металлического центра: [NiFe]-гидрогеназы, [FeFe]-гидрогеназы и [Fe]-гидрогеназы. На основании уникального функционального центра, который является консервативным для каждой из групп гидрогеназ, был сделан вывод, что все гидрогеназы в T. onnurineus NA1, за исключением одной гидрогеназы, принадлежат к [NiFe]-гидрогеназам. В соответствии с системой классификации гидрогеназ Vignais et al., [NiFe]-гидрогеназы в T. onnurineus NA1 принадлежат к группе 3 (одна F420-восстанавливающая гидрогеназа и две NADP-восстанавливающие гидрогеназы) или к группе 4 (четыре мембраносвязанные гидрогеназы) (Silva, P.J., van den Ban, E.C., Wassink, H., Haaker, H., de Castro, В., Robb, F.T. and Hagen, W.R. (2000) Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus. Eur. J. Biochem. 267, 6541-6551). Гидрогеназы, принадлежащие к группе 4, называются преобразующими энергию гидрогеназами (Ech), и такие гидрогеназы широко распространены в бактериях и архебактериях.

Для выявления молекулярной основы метаболизма гидрогеназ генные кластеры гидрогеназ подвергали сравнительному анализу. Указанные гидрогеназы подвергали филогенетическому анализу и на основе полученных данных гидрогеназы группы 4 могут быть подразделены на две подгруппы, 4a и 4b, и во всех последовательностях подгруппы 4b можно обнаружить общие паттерны пар мотивов.

Как показано на фиг.2, в геноме T. onnurineus NA1 были обнаружены три дополнительных кластера гидрогеназ (FDH1-MFH1-MNH1 (Hyg4-I, S1:TON_0279-0274, MFH1: SBQ ID NO: 2), CODH-MCH-MNH3 (Hyg4-II, S2:TON_1021-1024, MCH: SEQ ID NO: 5) и FDH2-MFH2-MNH2 (Hyg4-III, S3:TON_1565-1571, MFH2: SEQ ID NO: 7)) и Frh (TON_1559-1562, SEQ ID NO: 6) вместе с двумя мембраносвязанными гидрогеназами (Mbh (TON_1590-1595, SEQ ID NO: 8) и Mbx (TON_0489-0486, SEQ ID NO: 3)), и двумя цитоплазматическими NiFe-гидрогеназами (Sulf-I (TON_0533-0544, SEQ ID NO: 4) и Sulf-II (TON_0051-0055, SEQ ID NO:1), которые, как сообщалось, присутствуют в Pyrococcus spp. и T. kodakaraensis KOD1. Анализ генного кластера гидрогеназ с CDS от 31 архегенома явно показал, что FDH1-MFH1-MNH1 (Hyg4-I), CODH-MCH-MNH3 (Hyg4-II) и FDH2-MFH2-MNH2 (Hyg4-III) являются уникальными по своей первичной последовательности, что указывает на низкое сходство с 4 компонентами гидрогеназ от P. abyssi и R. rubrum (фиг.3). Аналогично дополнительным гидрогеназам кластер FDH2-MFH2-MNH2 (Hyg4-III) (TON_1559-1582, SEQ ID NO: 76-99) включает субъединицы α/β/γ F420-гидрогеназы (TON_1559-1561, SEQ ID NO: 76 - 78) в геноме. Субъединицы F420-гидрогеназы имеют уникальные первичные последовательности, что указывает на сходство с кофермент F420-восстанавливающей гидрогеназой (YP_001097176) от Methanococcus maripaludis (33%) и кофермент F420-восстанавливающей гидрогеназой (NP_987940) от M. maripaludis S2 (33%) (фиг.3 и фиг.5). При этом в литературе отсуствуют какие-либо сообщения о гомологах F420-гидрогеназы Thermococcales.

3) Конструирование 3-модульных генных кластеров

Было обнаружено, что каждая из трех гидрогеназ Ech (MFH1, MFH2 и MCH), принадлежащих к группе 4 [NiFe]-гидрогеназ, представляет собой часть крупных 17- или 18-генных кластеров (fdh1-mfh1-mnh1, fdh2-mfh2-mnh2 и codh-mch-mnh3), состоящих из ОРС (открытых рамок считывания) TON_266-TON_282, TON_1563-TON_1580 и TON_1016-TON_1031 (фиг.2B). ОРС в кластерах могут быть подразделены на три подкластера. Первая часть кодирует оксидоредуктазу, такую как формиатдегидрогеназа (Fdh1 (SEQ ID NO: 9) или Fdh2 (SEQ ID NO: 11)), или монооксид углерода-дегидрогеназа (Codh (SEQ ID NO: 10)). Вторая часть кодирует мультимерные мембраносвязанные гидрогеназы (MFH1, MFH2 или MCH), имеющие 5-7 субъединиц. Последняя часть кодирует катионные/протонные антипорты, такие как Na⁺/H⁺-антипорт. При этом в литературе отсутствуют какие-либо сообщения о 3-модульных генных кластерах.

Пример 2: Анализ состава газа

(1) Метод проведения анализа

Состав газа водорода определяли на газовом хроматографе HP 5890 серии II (Hewlett Packard), снабженном колонкой с молекулярными ситами HP-PLOT (Agilent) и детектором TCD. В качестве газа-носителя использовали аргон. Для количественной оценки состава газа водорода использовали газовый калибровочный эталон (Supleco), содержащий 1% (масс./масс.) каждого из компонентов (CO, CO₂, H₂, CH₄ и О₂) в азоте.

(2) Получение водорода с использованием различных веществ

Для того чтобы определить, могут ли различные гидрогеназы в T. onnurineus NA1 осуществлять эффективное продуцирование водорода в различных средах, скорость продуцирования водорода анализировали с использованием различных источников энергии (таблица 2). В результате было обнаружено, что штамм NA1 может продуцировать водород с использованием крахмала, CO и формиата даже в отсутствие серы. В частности, CO и формиат являются наиболее подходящими источниками энергии для эффективного продуцирования водорода.

Таблица 2 Сравнение продуцирования водорода штаммом T. onnurineus NA1
в различных условиях Среда Продуцирование водорода (ммоль/л) М + СО 30,7 М + формиат 49,7 М + крахмал 15,6 M: модифицированная среда 1

Уровень продуцирования водорода штаммом NA1 в периодической культуре был аналогичен уровню продуцирования, наблюдаемому в непрерывной культуре T. kodakaraensis KOD1 и Pyrococcus furiosus. Гипертермофильные архебактерии, несмотря на их низкую волюметрическую продуктивность, имеют ряд преимуществ, заключающихся в том, что они обнаруживают определенную скорость продуцирования водорода, превышающую скорость продуцирования водорода при сбраживании мезофильных бактерий, или скорость продуцирования водорода в фотобактериях, и продуцируют водород высокой чистоты. Описанная здесь высокая скорость продуцирования водорода может быть еще больше увеличена путем оптимизации условий культивирования, способов обработки и технологии получения продуктов метаболизма.

Пример 3: СО-зависимое продуцирование H ₂ штаммом Thermococcus onnurineus NA1: идентификация СО-чувствительных гидрогеназ

(1) Генный кластер CODH и рост в карбоксидотропных условиях

Как описано выше, было обнаружено, что T. onnurineus NA1 имеет уникальный генный кластер (CODH-MCH-MNH3), который состоит из предполагаемого регулятора транскрипции (TON_1016), вспомогательного белка CODH (CooC, TON_1019), каталитической субъединицы CODH (CooS, TON_1018) и белка-переносчика электронов (CooF, TON_1017), а также гидрогеназы (mch, TON_1021-1024, SEQ ID NO: 5) (фиг.2B). CooS (TON_1018), фермент, играющий центральную роль в метаболизме монооксида углерода (CO) в микробах, обнаруживает значительное сходство с ферментами CODH, происходящими от СО-окисляющих метаногенных архебактерий, такими как CODH (AAM06652) от Methanosarcina acetivorans C2A (60%) и CODH (AAM29817) от Methanosarcina mazei Gol (59%) (фиг.3 и 4). Предполагается, что монофункциональный CODH (Bonam, D., L. Lehman, G. P. Roberts and P. W. Ludden., 1989, Regulation of carbon monoxide dehydrogenase and hydrogenase in Rhodospirillum rubrum: effects of CO and oxygen on synthesis and activity. J. Bacteriol. 171:3102-3107; и Wu, M. Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. С Nelson, L. J. Tallon, К. М. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005, Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:e65) не обладает активностью бифункциональной CODH/ацетил-кофермент А-синтетазы, заключающейся в синтезе/расщеплении ацетил-кофермента А. Как описано в публикации Fox et al. (Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden, 1996, Characterization of the CO-induced, СО-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524), монофункциональный комплекс CODH/гидрогеназы, происходящий от Rhodospirillum rubrum, участвует в СО-индуцируемом поглощении протонов, что приводит к сохранению энергии в форме протонного градиента, создаваемого по всей клеточной мембране. В этой связи, чтобы убедиться в том, что CODH-кластер может играть аналогичную роль в сохранении энергии посредством окисления CO, авторами настоящего изобретения был проведен тест на утилизацию СО штаммом T. onnurineus NA1. В результате было обнаружено, что этот штамм действительно способен лучше расти в среде 1 в атмосфере СО в отсутствие и в присутствии серы, чем в базовой среде (фиг.6a и b), даже в том случае, когда выход культивирования был меньше, чем в среде с YPS (фиг.6a). Рост в атмосфере CO ассоциируется с транскрипцией гена CooS, что указывает на то, что это ген может быть индуцирован в присутствии CO (фиг.6c). Заслуживает внимания тот факт, что добавление серы приводит к снижению уровня транскрипции гена CooS. Полученные результаты подтвердили гипотезу, что штамм T. onnurineus NA1 генерирует энергию из CO. Ниже описаны конкретные методы тестирования и результаты, подтверждающие данную гипотезу.

(2) Методы тестирования

1) Условия культивирования

T. onnurineus NA1 культивировали в анаэробных условиях при 80°С в среде, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-серу (YPS). Для оценки параметров роста мутантного штамма в качестве базовой среды использовали модифицированную среду 1, в которую было добавлено 30,0 г/л NaCl (Uffen, R. L., 1976, Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302). Среду автоклавировали, а затем в модифицированную среду 1 в аэробной камере добавляли 1,0 мл/л раствора витамина (Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296) и 0,5 г/л дрожжевого экстракта. pH доводили до 8,0 путем добавления 1 н. NaOH в базовую среду. 30 мл полученной среды распределяли по 150-миллилитровым бутылям с сывороткой, и газовую фазу (120 мл) заменяли на 100% CO (10⁵ Па). Все культуры для проведения физиологических тестов выращивали при 80°С в анаэробных условиях в течение 24 часов, и эти тесты проводили в дубликате.

2) Экстракция РНК и конструирование микромассивов

Культуры центрифугировали при 4°C при 3500g в течение 10 минут, и всю РНК экстрагировали из культур с использованием реагента Тризола в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями (Invitrogen, Carlsbad, California). Все РНК-образцы количественно и качественно анализировали на спектрофотометре NanoDrop (ND-1000, Thermo Scientific) и с помощью электрофореза. Микромассив, используемый в этом эксперименте, представляет собой микромассив Roche NimbleGen. Вкратце, было сконструировано всего 31994 уникальных 60-мерных олигонуклеотидов, и эти олигонуклеотиды были синтезированы in situ химическим методом снятия защиты под действием света. Каждый уникальный олигонуклеотид был повторен на массиве дважды (всего ~72000 элементов).

3) Синтез кДНК и условия гибридизации

Тест на микромассивах осуществляли в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Каждый образец полноразмерной РНК (5 мкг) метили Cy5-dCTP (Amersharm, Piscataway, NJ) путем проведения реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, California). Затем смесь меченой кДНК концентрировали путем преципитации этанолом. 30 мкл концентрированных Cy5-меченых кДНК суспендировали в растворе для гибридизации (GenoCheck, Korea). Меченые кДНК локализовали на микромассиве, а затем помещали в камеру для гибридизации MAUI Mixer X4 (BioMicro Systems, Salt Lake 32 City, UT). Гибридизацию на предметных стеклах осуществляли с использованием 12-секционных систем MAUI (BioMicro Systems, Salt Lake City, UT) при 42°C в течение 12 часов. Гибридизованные предметные стекла промывали при комнатной температуре в 2 X SSC, 0,1% ДСН в течение 2 минут, 1X SSC в течение 3 минут, а затем 0,2 X SSC в течение 2 минут. Предметные стекла центрифугировали при 1000g в течение 20 секунд, а затем сушили.

4) Сканирование предметных стекол, нормализация и анализ данных

Массивы сканировали с использованием сканера GenePix 4000B (Molecular Devices Corporation, Union City, CA), и данные получали с помощью компьютерной программы NimbleScan 2.4. Нормализацию массивов осуществляли методом уточнения среднего и нормализации квантилей (Amaratunga, D., and J. Cabrera. 2001. Statistical analysis of viral microchip data. J. Am. Stat. Assoc. 96:1161-1170). Нормализованные величины экспрессии для отдельных зондов использовали в целях получения величин экспрессии для данной ОРС методом RMA (надежным методом вычисления средних с использованием множества массивов), ранее описанным Irizarry et al. (Karl, D. M. 1995. The microbiology of deep-sea hydrothermal vents. CRC Press, Boca Raton, FL). И наконец, n-кратные изменения отношений (R) определяли с использованием RMA-обработанных величин экспрессии (RMA-запрос), полученных для конкретного гена в образце. Анализ данных осуществляли с использованием программы GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent Technologies, CA). Программы-фильтры для кратных изменений требуют, чтобы стимулируемые гены составляли по меньшей мере 200% от контролей, а ингибируемые гены составляли менее чем 50% от контролей. Данные были объединены в группы генов с аналогичным поведением в экспериментах, проводимых с использованием GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA). Для разделения генов с аналогичными паттернами был использован алгоритм, разработанный на основе евклидова расстояния и усреднения связей.

5) Количественная ОТ-ПЦР

Геноспецифические праймеры были сконструированы на основе геномной последовательности T.onnurineus NA1 (Genbank рег. №: CP000855). Праймерные последовательности представлены ниже в таблице 3.

кДНК синтезировали из 350 нг всей РНК с использованием обратной транскриптазы, SuperScrip II (Invitrogen, Carlsbad, California), в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. ПЦР-реакции осуществляли с использованием ДНК-полимеразы rTaq (Takara) в термоячейке T1 (Biometra). Реакции проводили в 50 мкл смеси, содержащей кДНК для реакции первой цепи, 10 пмоль праймеров, 250 мкМ dNTP и буфер от производителя. Кроме того, реакции ПЦР-амплификации проводили в следующих условиях: денатурация в течение 2 минут при 94°С, а затем 25 циклов денатурации (30 секунд при 94°С), отжига (30 секунд при 56°С) и удлинения (1 минута при 72°С). ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. Уровень экспрессии измеряли с использованием GelPro32.EXE v4.6 (Media Cybernetics, Inc.). Шаперонинкодирующий ген, обозначенный “cha”, использовали в качестве контроля для нормализации уровней экспрессии.

Таблица 3 Олигонуклеотиды, используемые в данном примере Название гена Смысловой праймер (5'→ 3') Антисмысловой праймер (5'→ 3') Праймеры, используемые в ОТ-ПЦР mbh Cacgacataggctacgacacgg (SEQ ID NO: 27) Ctggcttaactcctaggtcagg (SEQ ED NO: 28) mbx Gcgattcggtatgataccggac (SEQ ID NO: 29) Ccatccttcgccgaagagctcg (SEQ ID NO: 30) frh Gtaagctcgacgagtacgacgtg (SEQ ID NO: 31) Gcaccacaacctatgcagaggcc (SEQ ID NO: 32) sulfI Gcagtacgaggaagtcgagggg (SEQ ID NO: 33) Gagggcctcgtcgataaggtcg (SEQ ID NO: 34) mch Ctaccggacgattggccagaagg (SEQ ID NO: 35) Ccttatatactgtgctctctccg (SEQ ID NO: 36) mfhl Gcgaccggtacggcaaccttcg (SEQ ID NO: 37) Cttgtcagtcatgacgtagtgg (SEQ ID NO: 38) mfh2 Gacccgaggttcacctcgatagc (SEQ ID NO: 39) Gcagacctggtcgtaggttagcc (SEQ ID NO: 40) Праймеры, используемые для нарушения генов Flk-mch cgttgtctttgcccttggggcagggatatatc
(SEQ ID NO: 41) ggcaattgcttggactgccgaaaagccaatggc
(SEQ ID NO: 42) Flk-mfh1 gaagaaatcgcagagggcgcctatgactatcag
(SEQ ID NO: 43) gctcctcgcttactcaagcgttggacaaatgg
(SEQ ID NO: 44) Flk-mfh2 ggactgctcttcctgtcgacgggctcaatattc
(SEQ ID NO: 45) ggacgcacttaaagtcggcgtagccctttgcc
(SEQ ID NO: 46) Ivs-mch aatttaccaccccaccactcccaaaatccaac
(SEQ ID NO: 47) aatggggaggctgaaactactgggcaaggc
(SEQ ID NO: 48) Ivs-mfh1 tggcccaggcgatttccttcaccgacagg
(SEQ ID NO: 49) aattcaccaccccaccagcgctattatcagg
(SEQ ID NO: 50) Ivs-mfh2 gagcaccacctcaccatcccagggaagctatc
(SEQ ID NO: 51) gatggccgtgacgctgaagtaccccttcgtga
(SEQ ID NO: 52) Праймеры, используемые для идентификации нарушения генов P_gdh-hmg_pfu gaacggtagttttcgacaaaagacg
(SEQ ID NO: 53) gctcaccagccaaaaccgcaccagc
(SEQ ID NO: 54) mch_TNA1 gcaatgtaccacatattcaactgcgatac
(SEQ ID NO: 55) ccgataccgagtttgaatggaggaatctc
(SEQ ID NO: 56) Mfh1_TNA1 tcaggccacccccttgcccttctgt
(SEQ ID NO: 57) atggagtgcagcgtgtgtgcgggtg
(SEQ ID NO: 58) mfh2_TNA1 atgtctgaagttatcaagtttaacg
(SEQ ID NO: 59) tgaggcctttatggagagcttgttg
(SEQ ID NO: 60)

6) Нарушение гена-мишени

Для анализа функции гидрогеназ in vivo T. onnurineus, мутанты инсерционной инактивации крупной субъединицы гидрогеназы mch или mfh2 конструировали с использованием системы нарушения генов для гипертермофильных архебактерий T. kodakaraensis KOD1 (Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams, 2003, A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550). В частности, ДНК-фрагменты, содержащие фланкирующую область крупных субъединиц ((TON_023 и TON_1569) каждой из гидрогеназ mch и mfh2, амплифицировали из геномной ДНК T. onnurineus NA1 с использованием наборов праймеров (таблица 3) для Flk-mch или Flk-mfh2. Каждый из амплифицированных фрагментов лигировали в pUC118, гидролизованный ферментом HincII. Затем матрицу (рекомбинантную плазмиду Flk-mch_pUC118 или Flk-mfh2_pUC118) подвергали обратной ПЦР с использованием наборов праймеров (Ivs-mch или Ivs-mfh2) (таблица 3), а затем лигировали в кластер P_gdh-hmg_Pfu (Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550). Лигированный продукт переносили в клетки Escherichia coli DH5α. Рекомбинантные плазмиды (mch::P_gdh-hmg_Pfu и mfh2::P_gdh-hmg_Pfu) получали с использованием мининабора для плазмид (Qiagen, Hilden, Germany). И наконец, плазмиды переносили в T. onnurineus NA1 с применением слегка модифицированного метода Sato et al. (Sato, Т., Т. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, Т., Т. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899). Трансформанты скринировали в среде ASW-YT-S в присутствии 10 мкМ симвастатина (Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691), и группы-кандидаты, в которых, как предполагается, были делетированы гены-мишени, подтверждали путем оценки присутствия кластера P_gdh-hmg _Pfu в области-мишени.

7) Влияние кинетики на рост микроорганизмов и продуцирование водорода

Рост микроорганизмов наблюдали визуально. Образцы разводили в стерильной воде, содержащей морскую соль (30,0 г/л), формалин (2,5%) и 4',6'-диамидино-2-фенилиндол (0,01%) (Sato, Т., Т. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899). Разведенные образцы фильтровали через черный поликарбонатный фильтр (размер пор: 0,2 мкм; Whatman), а затем анализировали на оптическом фазово-контрастном микроскопе (Zeiss Axioplan). Состав газа водорода определяли на газовом хроматографе HP 5890 серии II (Hewlett Packard), снабженном колонкой с молекулярными ситами HP-PLOT (Agilent) и детектором TCD. В качестве газа-носителя использовали аргон. Температура печи составляла 40°C. 10 мкл газового образца для анализа брали с помощью газонепроницаемого шприца через бутилкаучуковую пробку. Состав детектируемого газа водорода определяли путем сравнения площади пика с площадью пика калибровочной кривой, построенной с помощью регрессионного анализа с использованием стандартного газа, содержащего 40% водорода в азоте.

(3) Результаты теста

1) In silico анализ гидрогеназы T. onnurineus NA1

Предварительный геномный анализ Т. onnurineus NA1 указывал на присутствие восьми кластеров генов гидрогеназы (Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948), которые включают пять мембраносвязанных [NiFe]-гидрогеназ (Mbh, TON_1583-1595; Mbx, TON_0486-0498; Mfh1, TON_0273-0278; Mfh2, TON_1566-1573; и Mch, TON_1021-1024), и три цитоплазматические [NiFe]-гидрогеназы (Fru, TON_1559-1562; Sulf I, TON_0533-0544; и Sulf II, TON_0051-0055). В результате проведения сравнительного анализа кластеров генов гидрогеназы и штаммов Thermococcales, секвенирование генома которых было завершено, было обнаружено, что кластеры, гомологичные кластерам Mfh1, Mfh2 и Mch, встречаются очень редко, и такие кластеры были обнаружены в штаммах Thermococcales, у которых были недавно определены последовательности геномов, а именно, такие как T. barophilus MP (гомологи Mfh1 и Mch), Thermococcus sp. AM4 (гомологи Mfh1 и Mch) (неопределенная последовательность, GenBank рег. № ABXN00000000), и T. gammatolerans (гомологи Mfh1 и Mfh2) (GenBank рег. № CP001398). Секвенирование кластера fdh1-mfh1-mnh1 (обозначенного “Hyg4-I” в работах Lee, H. S., S. G. Kang, S. S. Bae, J. K. Lim, Y. Cho, Y. J. Kim, J. H. Jeon, S.-S. Cha, K. K. Kwon, H.-T. Kim, C.-J. Park, H.-W. Lee, S. I. Kim, J. Chun, R. R. Colwell, S.-J. Kim, and J.-H. Lee. 2008. The complete genome sequence of Thermococcus onnurineus NA1 reveals a mixed heterotrophic and carboxydotrophic metabolism. J. Bacteriol. 190:7491-7499), кластера fdh2-mfh2-mnh2 (обозначенного “Hyg4-III”) и кластера codh-mch-mchЗ (обозначенного “Hyg4-II”) в T. onnurineus NA1 показало, что каждый из этих кластеров включал оксидоредуктазы, такие как формиатдегидрогеназа (FDH) и CO-дегидрогеназа (Codh). В частности, карбоксидотропный метаболизм, наблюдаемый при культивировании в СО-содержащей среде, позволяет предположить, что кластер Codh-Mch-Mnh3 играет функциональную роль в вырабатывании энергии в реакциях продуцирования водорода путем окисления СО.

2) Экспрессия генов гидрогеназы в условиях СО-индуцированного роста

Был проведен тест для того, чтобы определить, может ли T. onnurineus NA1 продуцировать водород при культивировании в СО-содержащей среде. Как показано на фиг.7, в среде YPS, продуцирование водорода не может быть детектировано, однако в среде 1, в которую был добавлен CO, общее количество газа водорода и число клеток увеличивалось по мере увеличения времени культивирования.

Для того чтобы определить, какие из гидрогеназ участвуют в продуцировании водорода в процессе карбоксидотропного роста, были проанализированы уровни экспрессии генов гидрогеназы в CO-содержащей среде для культивирования или в комплексной среде (YPS). Как показано в таблице 4 и 5 и на фиг.8A, уровни экспрессии некоторых ОРС (10 из 16 ОРС) в кластере codh-mch-mnh3 в СО-содержащей среде для культивирования были по меньше мере в два раза выше уровней экспрессии в среде с YPS. Кроме того, уровни экспрессии нескольких OPC (TON_1563 и TON_1569-1571) в кластере fdh2-mfh2-mnh2 были также выше в СО-содержащей среде для культивирования, включающей 1 г дрожжевого экстракта. Уровни экспрессии ОРС в кластере codh-mch-mnh3 варьировались в зависимости от количества дрожжевого экстракта, что дает основание предположить, что дрожжевой экстракт ассоциируется с ингибированием или активацией катаболизма при СО-индуцированном метаболизме (таблицы 4 и 5). С другой стороны, уровень экспрессии других кластеров генов гидрогеназы значительно не изменялся, а экспрессия генов (20 генов из 29 ОРС) в кластере fdh1-mfh1-mnh1 снижалась. Данные количественного ОТ-ПЦР-анализа для крупной субъединицы каждой из гидрогеназ также совпадают с данными, полученными с использованием микромассивов. Экспрессия крупных субъединиц (TON_1023 и T0N_1569) гидрогеназ mch и mfh2 возрастала по меньшей мере в два раза (фиг.8B), а экспрессия крупной субъединицы (TON_0276) гидрогеназы mfh1 ингибировалась; а что касается экспрессии других крупных субъединиц (mbh, mbx, frh и sulf1), то она поддерживалась на постоянном уровне в обоих состояниях. Полученные результаты позволяют предположить, что кластеры codh-mch-mnh3 или fdh2-mfh2-mnh2 могут быть индуцированы CO и могут участвовать в процессах продуцирования водорода, ассоциированных с карбоксидотропным метаболизмом.

Таблица 4 Уровни экспрессии ОРС каждого из кластеров генов гидрогеназы в СО-содержащей среде для культивирования по сравнению с уровнями экспрессии в среде YPS Генный кластер и ОРС Аннотация М+СО+0,5 г YE/YPS M+CO+1 г YE/YPS M+CO+3 г YE/YPS Кластер гидрогеназы sulfII TON_0051 Гипотетический белок 1,273306 3,1454 2,569546 TON_0052 Альфа-субъединица гидрогеназы 1,085002 0,652365 0,550585 TON_0053 Дельта-цепь сульфгидрогеназы II 0,896129 1,898148 1,337585 TON_0054 Гамма-субъединица гидрогеназы 0,606088 0,517724 0,630549 TON_0055 Бета-цепь сульфгидрогеназы II 0,84527 1,44889 1,452254 Кластер fdh1-mfh1-mnh1 TON_0261 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypA 0,658409 0,78969 0,746964 TON_0262 АТФаза, участвующая в распределении семейства ParA/MinD, Mrp-гомолога в хромосоме 0,640277 0,776389 0,619674 TON_0263 Протеаза, участвующая в созревании гидрогеназы HycI 0,775719 1,531337 1,090123 TON_0264 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, участвующий в биосинтезе белка А 0,538102 0,957335 0,826924 TON_0265 Нуклеотидилтрансфераза, предполагаемая 0,421398 0,554433 0,503557 TON_0266 Компонент F или формиат-водород-лиаза 0,38336 0,338185 0,333459 TON_0267 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,296945 1,215972 0,838087 TON_0268 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 0,648077 0,424896 0,386235 TON_0269 Предполагаемая субъединица MnhB антипорта мультисубъединицы Na⁺/H⁺ 0,591411 0,571996 0,600235 TON_0270 Гипотетический белок 0,827927 0,85379 0,581906 TON_0271 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,410417 0,328062 0,51901 TON_0272 Предполагаемая субъединица MnhF антипорта Na⁺/H⁺ 0,194663 0,411647 0,331549 TON_0273 Гипотетический белок 0,269222 0,652722 0,482705 TON_0274 Компонент I или формиат-водород-лиаза 0,385799 0,627629 0,614487 TON_0275 Субъединица 6 формиат-водород-лиазы 0,313283 0,621333 0,511819 TON_0276 Компонент G или формиат-водород-лиаза 0,275138 0,724228 0,692331 TON_0277 Компонент С или формиат-водород-лиаза 0,460646 0,357836 0,387126 TON_0278 Компонент В или формиат-водород-лиаза 0,720779 0,623875 0,510273 TON_0279 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 0,80929 0,515429 0,54289 TON_0280 Оксидоредуктаза, содержащая железо-серу 0,3913 0,690322 0,647104 TON_0281 Формиат-дегидрогеназа fdhA, альфа-субъединица 0,584576 0,446401 0,44946 TON_0282 Предполагаемый регулятор транскрипции 1,340444 1,195043 0,883294 TON_0283 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypC 1,007318 1,853137 2,021914 TON_0284 Гипотетический белок hypD, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы длиной 367 аминокислот 1,036497 1,385466 1,182663

TON_0285 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypD 0,904687 1,066448 0,758981 TON_0286 Белок, участвующий в созревании гидрогеназы HypF 0,685606 0,778307 0,719973 TON_0287 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы HypE 0,851301 1,399569 1,257059 TON_0288 Гипотетический белок 1,004008 1,964442 2,27641 TON_0289 Цистеин-десульфураза 0,666768 1,534991 1,148004 Кластер гидрогеназы mbx TON_0486 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 0,821271 0,718277 0,504388 TON_0487 NADH-дегидрогеназа I, nuoD, субъединица D 0,606823 0,730138 0,517528 TON_0488 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,703506 0,618352 0,49939 TON_0489 NADH-дегидрогеназа I, nuoB, субъединица В 0,797159 0,618863 0,547462 TON_0490 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,372425 0,469467 0,278163 TON_0491 Гипотетический белок длиной 617 аминокислот 0,459201 0,532164 0,388201 TON_0492 Субъединица MbxH 0,862715 0,484349 0,423606 TON_0493 Предполагаемый антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы 0,70216 1,591408 1,138149 TON_0494 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,765286 0,716126 0,711304 TON_0495 Субъединица MbxD 0,658086 0,817339 0,749402 TON_0496 Субъединица MbxC 0,609819 1,200655 0,995067 TON_0497 Субъединица MbxB 0,860304 0,889029 0,810902 TON_0498 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая мультисубъединица 0,675578 0,564247 0,483617 Кластер гидрогеназы sulfI TON_0533 Ответственная за созревание гидрогеназо-специфическая эндопептидаза 0,977803 0,516234 0,73084 TON_0534 NiFe-гидрогеназа цитозоля, альфа-субъединица 1,283309 1,334781 1,071667 TON_0535 NiFe-гидрогеназа цитозоля, дельта-субъединица 0,652099 1,080516 0,800955 TON_0536 Гидрогеназа (гамма-субъединица) 1,100959 1,192121 0,759086 TON_0537 Бета-субъединица сульфгидрогеназы 1,025726 1,458113 1,160718 TON_0538 Предполагаемый переносчик формиата 0,989789 1,113613 0,960108 TON_0539 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 1,158997 1,791123 1,314525 TON_0540 Белок оксидоредуктазы, содержащий железо-серу 0,987581 1,525167 0,82485 TON_0541 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 1,112648 1,320761 0,855465 TON_0542 Оксидоредуктаза, родственная бета-цепи глутамат-синтазы 0,842213 1,602828 0,936949 TON_0543 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 0,9185 1,257283 1,019564 TON_0544 Алкоголь-дегидрогеназа 0,87473 0,419323 0,605934 Кластер codh-mch-mnh3 TON_1016 Предполагаемый регулятор транскрипции семейства ModE 1,187798 0,634394 0,731218 TON_1017 Домен, связывающийся с 4Fe-4S-ферроредоксином, содержащим железо-серу 1,713085 4,46107 3,621394 TON_1018 Монооксид углерода-дегидрогеназа, каталитическая субъединица 1,474238 2,204944 1,785437 TON_1019 Предполагаемый АТФ-связывающий белок 0,824732 2,016924 0,974466 TON_1020 Гипотетический белок 3,375546 9,366047 5,425704 TON_1021 Компонент В или формиат-водород-лиаза 1,112538 1,711122 1,250867 TON_1022 NADH-дегидрогеназа дыхательной цепи, субъединица 1 0,877363 1,428883 0,57715 TON_1023 Компонент G или формиат-водород-лиаза 1,927395 6,118015 4,270288 TON_1024 NADH-дегидрогеназа (убихинон), 20 кДа-субъединица 1,816315 3,578841 2,009973

TON_1025 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 2,443938 3,389037 1,333503 TON_1026 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 1,337719 0,605839 0,623499 TON_1027 Гипотетический белок 0,991048 1,43866 0,778446 TON_1028 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 1,019583 1,203407 0,836452 TON_1029 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 2,648286 2,171138 1,123898 TON_1030 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 3,779798 4,956998 1,592196 TON_1031 Компонент F или формиат-водород-лиаза 1,030507 2,788588 1,982091 Кластер frh(F ₄₂₀ -восстанавливающая гидрогеназа)гидрогеназы TON_1559 Альфа-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 0,695408 0,64447 0,726535 TON_1560 Гамма-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 0,56769 0,715513 0,635236 TON_1561 Нитрит/сульфит-редуктаза, связывающаяся с 4Fe-4S-ферредоксином, содержащим железо-серу 0,824149 0,834127 0,807754 TON_1562 Формиат-дегидрогеназа, субъединица FdhD 0,908701 1,54082 1,468288 Кластер fdh2-mfh2-mnh2 TON_1563 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 1,008259 3,037865 3,330042 TON_1564 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 1,178705 1,221574 1,445098 TON_1565 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 0,811937 1,787894 2,088693 TON_1566 NADH-дегидрогеназа (хинон) 1,011779 0,736029 0,787627 TON_1567 Компонент В или формиат-водород-лиаза 1,091992 1,057076 1,184573 TON_1568 Компонент С или формиат-водород-лиаза 1,471267 1,365925 1,382301 TON_1569 Компонент G или формиат-водород-лиаза 1,204795 2,281342 1,780033 TON_1570 Формиат-водород-лиаза, субъединица 6 1,257649 2,427962 1,99559 TON_1571 Компонент I или формиат-водород-лиаза 1,030626 2,15871 1,806722 TON_1572 Гипотетический белок 0,844948 0,504955 0,692272 TON_1573 Предполагаемый переносчик формиата 1,451628 1,459657 1,158131 TON_1574 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 1,53015 1,602287 1,244315 TON_1575 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,752784 0,646406 0,578467 TON_1576 Гипотетический белок 1,168966 0,564328 0,60819 TON_1577 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,726511 0,655031 0,556386 TON_1578 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 0,989286 1,061599 0,900044 TON_1579 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,903028 0,812346 0,816319 TON_1580 Компонент F или формиат-водород-лиаза 1,015786 0,756283 0,529199 TON_1581 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, ответственный за биосинтез белка А 0,61468 1,708744 1,243367 TON_1582 Гипотетический белок 0,753301 0,998059 0,952751 Кластер гидрогеназы mbh TON_1583 Субъединица MbhB 1,038442 0,519366 0,533773 TON_1584 Субъединица MbhC 0,947559 0,514932 0,5099 TON_1585 Субъединица MbhD 0,774604 1,015909 0,670497 TON_1586 Субъединица MbhE 1,101069 0,811262 0,659266 TON_1587 Субъединица MbhF 1,129566 0,811366 0,872572 TON_1588 Субъединица MbhG 1,027148 0,563686 0,510924 TON_1589 Субъединица MbhH 1,362042 0,948034 0,71984 TON_1590 Субъединица MbhI 1,334732 1,227655 0,904813 TON_1591 NiFe-гидрогеназа, небольшая субъединица 1,627315 1,158127 0,856929

TON_1592 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 1 0,940698 1,573248 0,956935 TON_1593 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 2 1,609483 2,286207 1,354849 TON_1594 Субъединица MbhM 0,982323 0,742211 0,458623 TON_1595 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 1,589684 1,280298 0,491906 М - среда 1; СО - монооксид углерода; YE - дрожжевой экстракт

Таблица 5 Иерархическая кластеризация 112 ОРС, включая кластеры гидрогеназы
от T. onnurineus NA1 Генный кластер ОРС Аннотация М+СО+0,5 г YE/YPS М+СО+1 г YE/YPS М+СО+3 г YE/YPS fdh1-mfh1-mnh1 TON_0272 Предполагаемая субъединица MnhF антипорта Na⁺/H⁺ 0,194663 0,411647 0,331549 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0267 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,296945 1,215972 0,838087 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0273 Гипотетический белок 0,269222 0,652722 0,482705 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0275 Субъединица 6 формиат-водород-лиазы 0,313283 0,621333 0,511819 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0276 Компонент G или формиат-водород-лиаза 0,275138 0,724228 0,692331 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0274 Компонент I или формиат-водород-лиаза 0,385799 0,627629 0,614487 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0280 Оксидоредуктаза, содержащая железо-серу 0,3913 0,690322 0,647104 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0271 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,410417 0,328062 0,51901 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0266 Компонент F или формиат-водород-лиаза 0,38336 0,338185 0,333459 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0277 Компонент С или формиат-водород-лиаза 0,460646 0,357836 0,387126 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0268 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 0,648077 0,424896 0,386235 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0281 Формиат-дегидрогеназа fdhA, альфа-субъединица 0,584576 0,446401 0,44946 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0265 Нуклеотидилтрансфераза, предполагаемая 0,421398 0,554433 0,503557 mbx TON_0491 Гипотетический белок длиной 617 аминокислот 0,459201 0,532164 0,388201 mbx TON_0490 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,372425 0,469467 0,278163 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0261 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypA 0,658409 0,78969 0,746964 mbx TON_0495 Субъединица MbxD 0,658086 0,817339 0,749402 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0286 Белок, участвующий в созревании гидрогеназы HypF 0,685606 0,778307 0,719973 mbx TON_0494 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,765286 0,716126 0,711304 frh TON_1559 Альфа-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 0,695408 0,64447 0,726535 mbx TON_0487 NADH-дегидрогеназа I, nuoD, субъединица D 0,606823 0,730138 0,517528

fdh1-mfh1-mnh1 TON_0262 АТФаза, участвующая в распределении хромосом, Mrp-гомолог 0,640277 0,776389 0,619674 frh TON_1560 Гамма-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 0,56769 0,715513 0,635236 SufII TON_0054 Гамма-субъединица гидрогеназы 0,606088 0,517724 0,630549 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0269 Предполагаемая субъединица MnhB антипорта мультисубъединицы Na⁺/H⁺ 0,591411 0,571996 0,600235 mbx TON_0486 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 0,821271 0,718277 0,504388 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0278 Компонент В или формиат-водород-лиаза 0,720779 0,623875 0,510273 mbx TON_0488 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,703506 0,618352 0,49939 mbx TON_0498 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая мультисубъединица 0,675578 0,564247 0,483617 mbx TON_0489 NADH-дегидрогеназа I, nuoB, субъединица В 0,797159 0,618863 0,547462 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1575 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,752784 0,646406 0,578467 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1577 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,726511 0,655031 0,556386 sulfI TON_0544 Алкоголь-дегидрогеназа 0,87473 0,419323 0,605934 sulfI TON_0533 Ответственная за созревание гидрогеназо-специфическая эндопептидаза 0,977803 0,516234 0,73084 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1572 Гипотетический белок 0,844948 0,504955 0,692272 mbx TON_0492 Субъединица MbxH 0,862715 0,484349 0,423606 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0279 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 0,80929 0,515429 0,54289 mbh TON_1584 Субъединица MbhC 0,947559 0,514932 0,5099 mbh TON_1583 Субъединица MbhB 1,038442 0,519366 0,533773 mbh TON_1588 Субъединица MbhG 1,027148 0,563686 0,510924 sufII TON_0052 Альфа-субъединица гидрогеназы 1,085002 0,652365 0,550585 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1580 Компонент F или формиат-водород-лиаза 1,015786 0,756283 0,529199 mbh TON_1594 Субъединица MbhM 0,982323 0,742211 0,458623 codh-mch-mnh3 TON_1016 Предполагаемый регулятор транскрипции семейства ModE 1,187798 0,634394 0,731218 codh-mch-mnh3 TON_1026 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 1,337719 0,605839 0,623499 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1576 Гипотетический белок 1,168966 0,564328 0,60819 codh-mck-mnkl TON_1022 NADH-дегидрогеназа дыхательной цепи, субъединица 1 0,877363 1,428883 0,57715 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0264 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, участвующий в биосинтезе белка А 0,538102 0,957335 0,826924 sulfI TON_0535 NiFe-гидрогеназа цитозоля, дельта-субъединица 0,652099 1,080516 0,800955 mbx TON_0496 Субъединица MbxC 0,609819 1,200655 0,995067 fdh2-mfn2-nmh2 TON_1582 Гипотетический белок 0,753301 0,998059 0,952751 fdh1-mfn1-mnh1 TON_0270 Гипотетический белок 0,827927 0,85379 0,581906 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0285 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypD 0,904687 1,066448 0,758981

mbh TON_1585 Субъединица MbhD 0,774604 1,015909 0,670497 mbx TON_0497 Субъединица MbxB 0,860304 0,889029 0,810902 frh TON_1561 Нитрит/сульфит-редуктаза, связывающаяся с 4Fe-4S- ферредоксином, содержащим железо-серу 0,824149 0,834127 0,807754 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1579 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,903028 0,812346 0,816319 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1566 NADH-дегидрогеназа (хинон) 1,011779 0,736029 0,787627 mbh TON_1587 Субъединица MbhF 1,129566 0,811366 0,872572 mbh TON_1586 Субъединица MbhE 1,101069 0,811262 0,659266 sufII TON_0051 Гипотетический белок 1,273306 3,1454 2,569546 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1563 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 1,008259 3,037865 3,330042 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0283 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypC 1,007318 1,853137 2,021914 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0288 Гипотетический белок 1,004008 1,964442 2,27641 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1571 Компонент I или формиат-водород-лиаза 1,030626 2,15871 1,806722 fdh2-mch2-mnh2 TON_1565 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 0,811937 1,787894 2,088693 codh-mch-mnh3 TON_1031 Компонент F или формиат-водород-лиаза 1,030507 2,788588 1,982091 codh-mch-mnh3 TON_1018 Монооксид углерода-дегидрогеназа, каталитическая субъединица 1,474238 2,204944 1,785437 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1569 Компонент G или формиат-водород-лиаза 1,204795 2,281342 1,780033 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1570 Формиат-водород-лиаза, субъединица 6 1,257649 2,427962 1,99559 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0287 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы HypE 0,851301 1,399569 1,257059 sufII TON_0055 Бета-цепь сульфгидрогеназы II 0,84527 1,44889 1,452254 frh TON_1562 Формиат-дегидрогеназа, субъединица FdhD 0,908701 1,54082 1,468288 sufII TON_0053 Дельта-цепь сульфгидрогеназы II 0,896129 1,898148 1,337585 sufI TON_0539 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 1,158997 1,791123 1,314525 codh-mch-mnh3 TON_1021 Компонент В или формиат-водород-лиаза 1,112538 1,711122 1,250867 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0263 Протеаза, участвующая в созревании гидрогеназы HycI 0,775719 1,531337 1,090123 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0289 Цистеин-десульфураза 0,666768 1,534991 1,148004 mbx TON_0493 Предполагаемый антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы 0,70216 1,591408 1,138149 fdh2-mfn2-mnh2 TON_1581 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, ответственный за биосинтез белка А 0,61468 1,708744 1,243367 codh-mch-mnh3 TON_1019 Предполагаемый АТФ-связывающий белок 0,824732 2,016924 0,974466

sulfI TON_0542 Оксидоредуктаза, родственная бета-цепи-глутамат-синтазы 0,842213 1,602828 0,936949 mbh TON_1592 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 1 0,940698 1,573248 0,956935 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0284 Гипотетический белок hypD, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы длиной 367 аминокислот 1,036497 1,385466 1,182663 sulfI TON_0537 Бета-субъединица сульфгидрогеназы 1,025726 1,458113 1,160718 sulfI TON_0534 NiFe-гидрогеназа цитозоля, альфа-субъединица 1,283309 1,334781 1,071667 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1564 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 1,178705 1,221574 1,445098 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1567 Компонент В или формиат-водород-лиаза 1,091992 1,057076 1,184573 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1568 Компонент С или формиат-водород-лиаза 1,471267 1,365925 1,382301 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1573 Предполагаемый переносчик формиата 1,451628 1,459657 1,158131 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1574 антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 1,53015 1,602287 1,244315 sulfI TON_0541 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 1,112648 1,320761 0,855465 sulfI TON_0536 Гидрогеназа (гамма-субъединица) 1,100959 1,192121 0,759086 codh-mch-mnh3 TON_1028 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 1,019583 1,203407 0,836452 sulfI TON_0540 Белок оксидоредуктазы, содержащий железо-серу 0,987581 1,525167 0,82485 codh-mch-mnh3 TON_1027 Гипотетический белок 0,991048 1,43866 0,778446 sulfI TON_0543 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 0,9185 1,257283 1,019564 sulfI TON_0538 Предполагаемый переносчик формиата 0,989789 1,113613 0,960108 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1578 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 0,989286 1,061599 0,900044 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0282 Предполагаемый регулятор транскрипции 1,340444 1,195043 0,883294 mbh TON_1590 Субъединица MbhI 1,334732 1,227655 0,904813 mbh TON_1591 NiFe-гидрогеназа, небольшая субъединица 1,627315 1,158127 0,856929 mbh TON_1589 Субъединица MbhH 1,362042 0,948034 0,71984 mbh TON_1595 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 1,589684 1,280298 0,491906 codh-mch-mnh3 TON_1030 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 3,779798 4,956998 1,592196 codh-mch-mnh3 TON_1024 NADH-дегидрогеназа (убихинон), 20 кДа-субъединица 1,816315 3,578841 2,009973 codh-mch-mnh3 TON_1025 антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 2,443938 3,389037 1,333503

codh-mch-mnh3 TON_1029 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 2,648286 2,171138 1,123898 mbh TON_1593 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 2 1,609483 2,286207 1,354849 codh-mch-mnh3 TON_1020 Гипотетический белок 3,375546 9,366047 5,425704 codh-mch-mnh3 TON_1017 Домен, связывающийся с 4Fe-4S-ферроредоксином, содержащим железо-серу 1,713085 4,46107 3,621394 codh-mch-mnh3 TON_1023 Компонент G или формиат-водород-лиаза 1,927395 6,118015 4,270288

3) Нарушение гена и анализ фенотипов мутантов по нарушению

Транскриптомный анализ дает основание предположить, что гидрогеназный кластер mch, который является близкородственным кластеру codh (фиг.9A), может играть важную роль в карбоксидотропном гидрогенезе в T. onnurineus NA1. Однако в связи с активацией кластера fdh2-mfh2-mnh2 и образованием большого числа копий мРНК других кластеров возникает вопрос, может ли сам кластер codh-mch-mnh3 участвовать в карбоксидотропном гидрогенезе и могут ли другие гидрогеназы действовать по альтернативному пути для mch посредством образования комплексов в комбинации с дегидрогеназами или рециклинга электронных носителей, таких как FADH₂ или NADH. Таким образом, авторами настоящего изобретения были сконструированы мутанты по нарушению крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mch и mfh2 (Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691). Метод конструирования мутантов по нарушению проиллюстрирован на фиг.9A. Крупную субъединицу кластера гена гидрогеназы Mch или Mfh2 подвергали нарушению путем инсерционной инактивации кластера P_gdh-hmg _Pfu посредством гомологичной рекомбинации в области мишени, что приводило к сверхэкспрессии гена hmg-CoA. Нарушение гена-мишени подтверждали путем анализа на присутствие кластера P_gdh-hmg _Pfu с помощью ПЦР-амплификации после скрининга групп-кандидатов в среде YPS, в которую было добавлено 10 мкМ симвастатина (фиг.9B). P_gdh-hmg _Pfu может быть амплифицирован в группах-кандидатах с нарушением ( ^Δ mch _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 ), тогда как амплификация крупных субъединиц mch или mfh2 не происходила. Полученные результаты показали, что система нарушения генов, сообщаемая для T. kodakaraensis KOD1 (Sapra, R., K. Bagramyan и M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550), может быть также применена к T. onnurinues NA1.

Поскольку мутанты с нарушением ( ^Δ mch _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 ) могут быть получены в среде YPS, то очевидно, что Mch или Mfh2 не играют важной роли в метаболическом поглощении среды YPS. Как видно на фиг.10, изменения в росте и морфологии мутантных штаммов ^Δ mch _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 подтвердили, что эти гены необязательно должны присутствовать в среде YPS. Кроме того, штамм ^Δ mfh2 _TNA1 обладает способностью расти и продуцировать водород в СО-содержащей среде для культивирования на уровне, аналогичном уровню, наблюдаемому для штамма дикого типа (фиг.7 и 10). С другой стороны, мутант ^Δ mch _TNA1 не обладает способностью расти в СО-содержащей среде для культивирования и не способен продуцировать водород в данной среде (фиг.10). Полученные данные показали, что отсуствие крупной субъединицы Mch приводит к полному подавлению способности штамма T. onnurineus NA1 выживать в карбоксидотропных условиях в присутствии СО. Полученные результаты в целом показали, что при подаче CO в качестве субстрата в росте и продуцировании водорода участвует только гидрогеназа Mch.

Пример 4: Формиатзависимое продуцирование H ₂ штаммом Thermococcus onnurineus NA1: идентификация восприимчивых к формиату гидрогеназ

(1) Методы тестирования

1) Условия культивирования

T. onnurineus NA1 культивировали в анаэробных условиях при 80°С в среде, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-серу (YPS). Для оценки параметров роста мутантного штамма в качестве базовой среды использовали модифицированную среду 1, в которую было добавлено 30,0 г/л NaCl (Uffen, R. L., 1976, Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302). Среду автоклавировали, а затем в модифицированную среду 1 в аэробной камере добавляли 1,0 мл/л раствора витамина (Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296) и 0,5 г/л дрожжевого экстракта. pH базовой среды доводили до 8,0 путем добавления 1 н. NaOH в базовую среду. 30 мл полученной среды распределяли по 150-миллилитровым бутылям с сывороткой, и газовую фазу (120 мл) заменяли на 80% N₂-20% CO₂ (10⁵ Па). Все культуры для проведения физиологических тестов выращивали при 80°С в анаэробных условиях в течение 24 часов, и эти тесты проводили в дубликате.

2) Экстракция РНК и конструирование микромассивов

Культуры центрифугировали при 4°C при 3500g в течение 10 минут, и всю РНК экстрагировали из культур с использованием реагента Тризола в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями (Invitrogen, Carlsbad, California). Все РНК-образцы количественно и качественно анализировали на спектрофотометре NanoDrop (ND-1000, Thermo Scientific) и с помощью электрофореза. Микромассив, используемый в этом эксперименте, представляет собой микромассив Roche NimbleGen. Вкратце, было сконструировано всего 31994 уникальных 60-мерных олигонуклеотидов, и эти олигонуклеотиды были синтезированы in situ химическим методом путем снятия защиты под действием света. Каждый уникальный олигонуклеотид был повторен на массиве дважды (всего ~72000 элементов).

3) Синтез кДНК и условия гибридизации

Эксперименты с использованием микромассивов осуществляли в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Каждый образец полноразмерной РНК (5 мкг) метили Cy5-dCTP (Amersharm, Piscataway, NJ) путем проведения реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, California). Затем смесь меченой кДНК концентрировали путем преципитации этанолом. 30 мкл концентрированных Cy5-меченых кДНК суспендировали в растворе для гибридизации (GenoCheck, Korea). Меченые кДНК локализовали на микромассиве, а затем помещали в камеру для гибридизации MAUI Mixer X4 (BioMicro Systems, Salt Lake City, UT). Гибридизацию на предметных стеклах осуществляли с использованием 12-секционных систем MAUI (BioMicro Systems, Salt Lake City, UT) при 42°C в течение 12 часов. Гибридизованные предметные стекла промывали при комнатной температуре в 2 X SSC, 0,1% ДСН в течение 2 минут, 1X SSC в течение 3 минут, а затем 0,2 X SSC в течение 2 минут. Предметные стекла центрифугировали при 1000g в течение 20 секунд, а затем сушили.

4) Сканирование предметных стекол, нормализация и анализ данных

Массивы сканировали с использованием сканера GenePix 4000B (Molecular Devices Corporation, Union City, CA), и данные получали с помощью компьютерной программы NimbleScan 2.4. Нормализацию массивов осуществляли методом уточнения среднего и нормализации квантилей (Amaratunga, D., and J. Cabrera. 2001. Statistical analysis of viral microchip data. J. Am. Stat. Assoc. 96:1161-1170). Нормализованные величины экспрессии для отдельных зондов использовали в целях получения величин экспрессии для данной ОРС методом RMA (надежным методом вычисления средних с использованием множества массивов), ранее описанным Irizarry et al. (Karl, D. M. 1995. The microbiology of deep-sea hydrothermal vents. CRC Press, Boca Raton, FL). И наконец, n-кратные изменения отношений (R) определяли с использованием RMA-обработанных величин экспрессии (RMA-запрос), полученных для конкретного гена в образце. Анализ данных осуществляли с использованием программы GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent Technologies, CA). Программы-фильтры для кратных изменений требуют, чтобы стимулируемые гены составляли по меньшей мере 200% от контролей, а ингибируемые гены составляли менее 50% от контролей. Данные были объединены в группы генов с аналогичным поведением в экспериментах, проводимых с использованием GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA). Для разделения генов с аналогичными паттернами был использован алгоритм, разработанный на основе евклидова расстояния и усреднения связей.

5) Количественная оценка, проводимая с помощью ОТ-ПЦР

Геноспецифические праймеры были сконструированы на основе геномной последовательности T.onnurineus NA1 (Genbank рег. №: CP000855). (см. выше таблицу 3).

кДНК синтезировали из 350 нг всей РНК с использованием обратной транскриптазы, SuperScrip II (Invitrogen, Carlsbad, California), в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. ПЦР-реакции осуществляли с использованием ДНК-полимеразы rTaq (Takara) в термоячейке T1 (Biometra). Реакции проводили в 50 мкл смеси, содержащей кДНК для реакции первой цепи, 10 пмоль праймеров, 250 мкМ dNTP и буфер от производителя. Кроме того, реакции ПЦР-амплификации проводили в следующих условиях: денатурация в течение 2 минут при 94°С, а затем 25 циклов денатурации (30 секунд при 94°С), отжига (30 секунд при 56°С) и удлинения (1 минута при 72°С). ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза на 0,8% агарозном геле. Уровни экспрессии измеряли с использованием GelPro32.EXE v4.6 (Media Cybernetics, Inc.). Шаперонинкодирующий ген, обозначенный “cha”, использовали в качестве контроля для нормализации уровней экспрессии.

6) Нарушение гена-мишени

Для анализа функции гидрогеназ in vivo T. onnurineus мутанты инсерционной инактивации крупной субъединицы гидрогеназы Mfh конструировали с использованием системы нарушения генов, используемой для гипертермофильной архебактерии Т. kodakaraensis KOD1 (Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550). В частности, ДНК-фрагменты, содержащие фланкирующую область крупных субъединиц ((TON_0276 и TON_1569) каждой из гидрогеназ mfh1 и mfh2, амплифицировали из геномной ДНК T. onnurineus NA1 с использованием наборов праймеров (таблица 3) для Flk-mfh1 или Flk-mfh2. Каждый из амплифицированных фрагментов гидролизовали ферментом HincII и лигировали в pUC118. Затем матрицу (рекомбинантную плазмиду Flk-Mfh1_pUC118 или Flk-mfh2_pUC118) подвергали обратной ПЦР с использованием набора праймеров (Ivs-Mfh1 или Ivs-mfh2) (таблица 3), после чего лигировали в кластер P_gdh-hmg_Pfu (Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550). Лигированный продукт переносили в клетки Escherichia coli DH5α. Рекомбинантные плазмиды (Mfh1::P_gdh-hmg_Pfu и mfh2::P_gdh-hmg_Pfu) получали с использованием мининабора для плазмид (Qiagen, Hilden, Germany). И наконец, плазмиды переносили в T. onnurineus NA1 с применением слегка модифицированного метода Sato et al. (Sato, Т., Т. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, Т., Т. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899). Трансформанты скринировали в среде ASW-YT-S в присутствии 10 мкМ симвастатина, и присутствие гена-мишени может быть подтверждено путем анализа на присутствие кластера P_gdh-hmg _Pfu в области-мишени.

7) Влияние кинетики на рост микроорганизмов и продуцирование водорода

Рост микроорганизмов наблюдали визуально. Образцы разводили в стерильной воде, содержащей морскую соль (30,0 г/л), формалин (2,5%) и 4',6'-диамидино-2-фенилиндол (0,01%) (Sato, Т., Т. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899). Разведенные образцы фильтровали через черный поликарбонатный фильтр (размер пор: 0,2 мкм; Whatman), а затем анализировали на оптическом фазово-контрастном микроскопе (Zeiss Axioplan). Состав газа водорода определяли на газовом хроматографе HP 5890 серии II (Hewlett Packard), снабженном колонкой с молекулярными ситами HP-PLOT (Agilent) и детектором TCD. В качестве газа-носителя использовали аргон. Температура печи составляла 40°C. 10 мкл газового образца для анализа брали с помощью газонепроницаемого шприца через бутилкаучуковую пробку. Состав детектируемого газа водорода определяли путем сравнения площади пика с площадью пика калибровочной кривой, построенной с помощью регрессионного анализа с использованием стандартного газа, содержащего 40% водорода в азоте.

(2) Результаты теста

1) Гидрогеназы T. onnurineus NA1

Предварительный геномный анализ Т. onnurineus NA1 указывал на присутствие восьми кластеров генов гидрогеназы (Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948), которые включают пять мембраносвязанных [NiFe]-гидрогеназ (Mbh, TON_1583-1595; Mbx, TON_0486-0498; Mfh1, TON_0273-0278; Mfh2, TON_1566-1573; и Mch, TON_1021-1024), и три цитоплазматических [NiFe]-гидрогеназ (Fru, TON_1559-1562; Sulf I, TON_0533-0544; и Sulf II, TON_0051-0055). В результате проведения сравнительного анализа кластеров генов гидрогеназы и штаммов Thermococcales, секвенирование генома которых было завершено, было обнаружено, что кластеры, Mbh, Mbx, Sulf I и Sulf II присутствовали в избытке в других штаммах Thermococcales (см. Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Characterization of the CO-induced, СО-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524). С другой стороны, кластеры, гомологичные кластерам Mfh1, Mfh2 или Mch, встречаются очень редко, и эти кластеры были обнаружены в штаммах Thermococcales, у которых были недавно определены последовательности геномов, а именно, такие как T. barophilus MP (гомологи Mfh1 и Mch), Thermococcus sp. AM4 (гомологи Mfh1 и Mch). В частности, сравнительный анализ кластеров Mfh1 и Mfh2 в T. onnurineus NA1 показал, что организация генов в обоих кластерах почти аналогична организации генов в T. litoralis (Wu, M., Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. J. Tallon, К. М. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005. Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:е65), Т. barophilus MP (неопределенная последовательность, GenBank рег. № ABSF00000000), Thermococcus sp. AM4 (неопределенная последовательность, GenBank рег. № ABXN00000000) и Pyrococcus abyssi (GenBank рег. № AL096836). Генные кластеры состоят из формиатдегидрогеназной единицы (FDH), преобразующей энергию гидрогеназной единицы (ECH) и H⁺/Na⁺-Mnh-единицы. Помимо FDH, ассоциированных с мембраносвязанными гидрогеназами, в геноме было обнаружено по меньшей мере два FDH-репликата, которые не кластеризуются в мембраносвязанные [NiFe]-гидрогеназы.

2) Экспрессия генов гидрогеназы в формиатсодержащей среде для культивирования

Как показано на фиг.11, T. onnurineus NA1 может расти в присутствии экзогенного формиата, используемого в качестве субстрата, и рост этого штамма в высокой степени коррелирует с продуцированием водорода. В среде 1, в которую был добавлен формиат, количество газа водорода и число клеток увеличивалось по мере увеличения времени культивирования. Для того чтобы идентифицировать гидрогеназы, ответственные за продуцирование водорода в формиатсодержащей среде, был проведен анализ на микромассивах, целью которого было сравнение уровней экспрессии мРНК в генных кластерах гидрогеназы в случае культивирования в формиатсодержащей среде с уровнями экспрессии мРНК в случае культвирования в комплексной среде (YPS). Как показано ниже в таблицах 6 и 7 и на фиг.12А, уровни экспрессии мРНК в 10 ОРС из 20 ОРС в кластере fdh2-mfh2-mnh2 (обозначенном выше “Hyg4-III”) значительно (по меньшей мере в два раза) повышались в формиатсодержащей среде по сравнению со средой YPS. Кроме того, уровни экспрессии 6 ОРС в кластере codh-mch-mnh3 (обозначенном выше “Hyg4-II”) также повышались только в формиатсодержащей среде, включающей 3,0 г дрожжевого экстракта. Кроме того, уровни экспрессии ОРС в кластере fdh2-mfh2-mnh2 варьировались в зависимости от количества дрожжевого экстракта, что дает основание предположить, что количество дрожжевого экстракта коррелирует с ингибированием или активацией катаболизма в индуцированном формиатом метаболизме (таблицы 6 и 7). С другой стороны, уровни экспрессии ОРС в других кластерах генов гидрогеназы были относительно постоянными (mbx, frh и mch) или снижались (mbh, sulfI и mfh1). Интересно отметить, что уровни экспрессии большинства генов (25 генов из 29 ОРС) в кластере fdh1-mfh1-mnh1 (обозначенном выше Hyg4-I) снижались, что дает основание предположить, что экзогенный формиат может усиливать экспрессию fdh2-mfh2-mnh2, но ингибировать экспрессию fdh1-mfh1-mnh1. Результаты количественного OT-ПЦР-анализа, проводимого для крупной субъединицы каждого из кластеров генов гидрогеназы, также соответствовали результатам, полученным с использованием микромассивов. Амплификация крупной субъединицы (TON_1569) гидрогеназы mfh2 в формиатсодержащей среде проходила быстрее, по меньшей мере за два цикла, чем в среде YPS (см. фиг.12B). Полученные результаты дают основание предположить, что кластер fdh2-mfh2-mnh2 может быть восприимчивым к формиату. Интересно отметить, что только кластер fdh2-mfh2-mnh2 имеет ген, идентифицированный как ген предполагаемого переносчика формиата (TON_1573), и его функция заключается во введении формиата.

Таблица 6 Уровни экспрессии ОРС каждого из кластеров генов гидрогеназы
в формиатсодержащей среде по сравнению с уровнем экспрессии
в среде YPS Генный кластер и ОРС Аннотация М+формиат + 0,5 г YE/YPS M+формиат+3 г YE/YPS Кластер гидрогеназы sulfII TON_0051 Гипотетический белок 2,102325 1,996031 TON_0052 Альфа-субъединица гидрогеназы 1,203768 0,802758 TON_0053 Дельта-цепь сульфгидрогеназы II 1,065323 1,367881 TON_0054 Гамма-субъединица гидрогеназы 0,737077 0,849314 TON_0055 Бета-цепь сульфгидрогеназы II 0,867926 0,808351 Кластер fdh1-mfh1-mnh1 TON_0261 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypA 0,727489 0,848653 TON_0262 АТФаза, участвующая в распределении семейства ParA/MinD, Mrp-гомолога в хромосоме 0,810405 0,474952 TON_0263 Протеаза, участвующая в созревании гидрогеназы HycI 0,929162 1,474294 TON_0264 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, участвующий в биосинтезе белка А 0,483945 0,66368

TON_0265 Нуклеотидилтрансфераза, предполагаемая 0,316634 0,585297 TON_0266 Компонент F или формиат-водород-лиаза 0,318627 0,458616 TON_0267 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,450192 1,592257 TON_0268 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 0,575413 0,478743 TON_0269 Предполагаемая субъединица MnhB антипорта мультисубъединицы Na⁺/H⁺ 0,575645 0,850024 TON_0270 Гипотетический белок 0,754546 0,615634 TON_0271 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,658151 0,60018 TON_0272 Предполагаемая субъединица MnhF антипорта Na⁺/H⁺ 0,265459 0,481402 TON_0273 Гипотетический белок 0,251284 0,533794 TON_0274 Компонент I или формиат-водород-лиаза 0,769351 0,759056 TON_0275 Субъединица 6 формиат-водород-лиазы 0,542026 0,622878 TON_0276 Компонент G или формиат-водород-лиаза 0,358736 0,446038 TON_0277 Компонент С или формиат-водород-лиаза 0,741095 0,623746 TON_0278 Компонент В или формиат-водород-лиаза 0,741675 0,678797 TON_0279 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 0,817573 0,613605 TON_0280 Оксидоредуктаза, содержащая железо-серу 0,77206 0,704646 TON_0281 Формиат-дегидрогеназа fdhA, альфа-субъединица 0,366492 0,363246 TON_0282 Предполагаемый регулятор транскрипции 1,517388 1,556418 TON_0283 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypC 1,601742 1,508267 TON_0284 Гипотетический белок hypD, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы длиной 367 аминокислот 1,092018 0,699213 TON_0285 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypD 1,045483 0,489843 TON_0286 Белок, участвующий в созревании гидрогеназы HypF 0,529731 0,665571 TON_0287 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы HypE 0,770546 0,834498 TON_0288 Гипотетический белок 0,798203 2,193867 TON_0289 Цистеин-десульфураза 0,972411 0,894363 Кластер гидрогеназы mbx TON_0486 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 0,912618 0,560754 TON_0487 NADH-дегидрогеназа I, nuoD, субъединица D 0,947824 0,64502 TON_0488 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,74442 0,331352 TON_0489 NADH-дегидрогеназа I, nuoB, субъединица В 0,761859 0,54662 TON_0490 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,514819 0,256304 TON_0491 Гипотетический белок длиной 617 аминокислот 0,445818 0,43555 TON_0492 Субъединица MbxH 0,786868 0,427415 TON_0493 Предполагаемый антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы 0,67054 0,631248

TON_0494 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,682815 1,042934 TON_0495 Субъединица MbxD 0,886482 0,784067 TON_0496 Субъединица MbxC 0,74959 0,923091 TON_0497 Субъединица MbxB 0,905817 0,796591 TON_0498 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая мультисубъединица 0,841502 0,512737 Кластер гидрогеназы sulfI TON_0533 Ответственная за созревание гидрогеназо-специфическая эндопептидаза 0,736449 1,021127 TON_0534 NiFe-гидрогеназа цитозоля, альфа-субъединица 0,650022 0,677196 TON_0535 NiFe-гидрогеназа цитозоля, дельта-субъединица 0,741138 0,667442 TON_0536 Гидрогеназа (гамма-субъединица) 0,576788 0,558566 TON_0537 Бета-субъединица сульфгидрогеназы 0,624364 0,629266 TON_0538 Предполагаемый переносчик формиата 0,714736 0,690887 TON_0539 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 0,852292 1,341748 TON_0540 Белок оксидоредуктазы, содержащий железо-серу 1,063573 0,561844 TON_0541 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 0,811281 0,78328 TON_0542 Оксидоредуктаза, родственная бета-цепи глутамат-синтазы 0,812768 0,926217 TON_0543 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 0,983984 1,160664 TON_0544 Алкоголь-дегидрогеназа 1,029043 0,862232 Кластер codh-mch-mnh3 TON_1016 Предполагаемый регулятор транскрипции семейства ModE 1,219563 1,440116 TON_1017 Домен, связывающийся с 4Fe-4S-ферроредоксином, содержащим железо-серу 1,537494 2,172151 TON_1018 Монооксид углерода-дегидрогеназа, каталитическая субъединица 1,420438 1,274753 TON_1019 Предполагаемый АТФ-связывающий белок 0,698035 0,930505 TON_1020 Гипотетический белок 1,971922 3,839171 TON_1021 Компонент В или формиат-водород-лиаза 0,972559 1,151527 TON_1022 NADH-дегидрогеназа дыхательной цепи, субъединица 1 1,771932 1,186361 TON_1023 Компонент G или формиат-водород-лиаза 1,863412 4,045911 TON_1024 NADH-дегидрогеназа (убихинон), 20 кДа-субъединица 1,353224 3,47523 TON_1025 антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 0,923065 2,35011 TON_1026 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,964696 0,621115 TON_1027 Гипотетический белок 0,932259 0,97379 TON_1028 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,916306 1,019604

TON_1029 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 1,207926 0,928939 TON_1030 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,712484 2,238387 TON_1031 Компонент F или формиат-водород-лиаза 0,955361 2,246413 Кластер frh(F ₄₂₀ -восстанавливающая гидрогеназа)гидрогеназы TON_1559 Альфа-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 1,183388 0,530475 TON_1560 Гамма-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 1,415197 1,018573 TON_1561 Нитрит/сульфит-редуктаза, связывающаяся с 4Fe-4S-ферредоксином, содержащим железо-серу 1,355412 1,07094 TON_1562 Формиат-дегидрогеназа, субъединица FdhD 1,00278 0,973292 Кластер fdh2-mfh2-mnh2 TON_1563 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 4,251498 2,533032 TON_1564 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 3,005736 1,806787 TON_1565 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 2,572148 1,499477 TON_1566 NADH-дегидрогеназа (хинон) 1,807319 0,972802 TON_1567 Компонент В или формиат-водород-лиаза 3,431877 1,536872 TON_1568 Компонент С или формиат-водород-лиаза 2,936933 1,620744 TON_1569 Компонент G или формиат-водород-лиаза 3,631759 1,932512 TON_1570 Формиат-водород-лиаза, субъединица 6 2,69592 2,206621 TON_1571 Компонент I или формиат-водород-лиаза 2,061174 1,799012 TON_1572 Гипотетический белок 1,247346 1,037087 TON_1573 Предполагаемый переносчик формиата 2,315563 1,228123 TON_1574 антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 3,337596 2,209765 TON_1575 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 1,446144 0,801728 TON_1576 Гипотетический белок 1,558306 0,954677 TON_1577 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 1,43188 1,026239 TON_1578 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 1,656445 1,198853 TON_1579 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 1,382536 1,135341 TON_1580 Компонент F или формиат-водород-лиаза 1,804806 1,031391 TON_1581 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, ответственный за биосинтез белка А 1,42751 1,994937 TON_1582 Гипотетический белок 1,086162 0,6947 Кластер гидрогеназы mbh TON_1583 Субъединица MbhB 0,67072 0,367439 TON_1584 Субъединица MbhC 0,715606 0,384515 TON_1585 Субъединица MbhD 0,649744 0,488634 TON_1586 Субъединица MbhE 0,579611 0,376248

TON_1587 Субъединица MbhF 0,660332 0,683508 TON_1588 Субъединица MbhG 0,667072 0,521087 TON_1589 Субъединица MbhH 0,439735 0,343741 TON_1590 Субъединица MbhI 0,555557 0,42006 TON_1591 NiFe-гидрогеназа, небольшая субъединица 0,278923 0,289092 TON_1592 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 1 0,497784 0,493123 TON_1593 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 2 0,355 0,852904 TON_1594 Субъединица MbhM 0,373076 0,289584 TON_1595 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 0,421286 0,597661 М - среда 1; СО - монооксид углерода; YE - дрожжевой экстракт

Таблица 7 Иерархическая кластеризация 112 ОРС, включая кластеры гидрогеназы от Т. onnurineus NA1 Генный кластер и ОРС Аннотация М+формиат+0,5г YE/YPS М+формиат +1г YE/YPS Генный кластер и ОРС fdh1-mfh1-mnh1 TON_0262 АТФаза, участвующая в распределении хромосом, Mrp-гомолог 0,810405 0,474952 Mbx TON_0498 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая мультисубъединица 0,841502 0,512737 Mbx TON_0489 NADH-дегидрогеназа I, nuoB, субъединица В 0,761859 0,54662 Mbx TON_0492 Субъединица MbxH 0,786868 0,427415 Mbx TON_0486 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 0,912618 0,560754 Mbx TON_0487 NADH-дегидрогеназа I, nuoD, субъединица D 0,947824 0,64502 codh-mch-mnh3 TON_1026 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,964696 0,621115 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0285 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypD 1,045483 0,489843 sulfI TON_0540 Белок оксидоредуктазы, содержащий железо-серу 1,063573 0,561844 Frh TON_1559 Альфа-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 1,183388 0,530475 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0269 Предполагаемая субъединица MnhB антипорта мультисубъединицы Na⁺/H⁺ 0,575645 0,850024 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0270 Гипотетический белок 0,754546 0,615634 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0277 Компонент С или формиат-водород-лиаза 0,741095 0,623746 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0279 NADH-убихинон-оксидоредуктаза 0,817573 0,613605 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0280 Оксидоредуктаза, содержащая железо-серу 0,77206 0,704646 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0278 Компонент В или формиат-водород-лиаза 0,741675 0,678797 sulfI TON_0535 NiFe-гидрогеназа цитозоля, дельта-субъединица 0,741138 0,667442 sulfI TON_0538 Предполагаемый переносчик формиата 0,714736 0,690887 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0271 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 0,658151 0,60018 mbx TON_0493 Предполагаемый антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы 0,67054 0,631248 sulfI TON_0537 Бета-субъединица сульфгидрогеназы 0,624364 0,629266 sulfI TON_0534 NiFe-гидрогеназа цитозоля, альфа-субъединица 0,650022 0,677196

mbh TON_1587 Субъединица MbhF 0,660332 0,683508 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0264 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, участвующий в биосинтезе белка А 0,483945 0,66368 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0275 Субъединица 6 формиат-водород-лиазы 0,542026 0,622878 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0286 Белок, участвующий в созревании гидрогеназы HypF 0,529731 0,665571 mbh TON_1595 Субъединица, связывающаяся с 4Fe-4S-кластером 0,421286 0,597661 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0268 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 0,575413 0,478743 mbh TON_1592 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 1 0,497784 0,493123 sulfI TON_0536 Гидрогеназа (гамма-субъединица) 0,576788 0,558566 mbh TON_1585 Субъединица MbhD 0,649744 0,488634 mbh TON_1588 Субъединица MbhG 0,667072 0,521087 SufII TON_0055 Бета-цепь сульфгидрогеназы II 0,867926 0,808351 mbx TON_0495 Субъединица MbxD 0,886482 0,784067 mbx TON_0497 Субъединица MbxB 0,905817 0,796591 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0274 Компонент I или формиат-водород-лиаза 0,769351 0,759056 sulfI TON_0541 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 0,811281 0,78328 sufII TON_0054 Гамма-субъединица гидрогеназы 0,737077 0,849314 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0261 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypA 0,727489 0,848653 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0287 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы HypE 0,770546 0,834498 mbx TON_0496 Субъединица MbxC 0,74959 0,923091 codh-mch-mnh3 TON_1019 Предполагаемый АТФ-связывающий белок 0,698035 0,930505 sulfI TON_0542 Оксидоредуктаза, родственная бета-цепи-глутамат-синтазы 0,812768 0,926217 mbx TON_0494 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,682815 1,042934 sulfI TON_0533 Ответственная за созревание гидрогеназо-специфическая эндопептидаза 0,736449 1,021127 sulfI TON_0543 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 0,983984 1,160664 codh-mch-mnh3 TON_1021 Компонент В или формиат-водород-лиаза 0,972559 1,151527 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0289 Цистеин-десульфураза 0,972411 0,894363 sulfI TON_0544 Алкоголь-дегидрогеназа 1,029043 0,862232 codh-mch-mnh3 TON_1027 Гипотетический белок 0,932259 0,97379 codh-mch-mnh3 TON_1028 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 0,916306 1,019604 frh TON_1562 Формиат-дегидрогеназа, субъединица FdhD 1,00278 0,973292 sufII TON_0052 Альфа-субъединица гидрогеназы 1,203768 0,802758 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0284 Гипотетический белок hypD, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы длиной 367 аминокислот 1,092018 0,699213 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1582 Гипотетический белок 1,086162 0,6947 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1575 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 1,446144 0,801728 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0267 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,450192 1,592257 mbh TON_1593 NiFe-гидрогеназа, крупная субъединица 2 0,355 0,852904 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0265 Нуклеотидилтрансфераза, предполагаемая 0,316634 0,585297 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0272 Предполагаемая субъединица MnhF антипорта Na⁺/H⁺ 0,265459 0,481402

fdh1-mfh1-mnh1 TON_0273 Гипотетический белок 0,251284 0,533794 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0266 Компонент F или формиат-водород-лиаза 0,318627 0,458616 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0276 Компонент G или формиат-водород-лиаза 0,358736 0,446038 mbx TON_0491 Гипотетический белок длиной 617 аминокислот 0,445818 0,43555 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0281 Формиат-дегидрогеназа fdhA, альфа-субъединица 0,366492 0,363246 mbh TON_1589 Субъединица MbhH 0,439735 0,343741 mbh TON_1594 Субъединица MbhM 0,373076 0,289584 mbh TON_1591 NiFe-гидрогеназа, небольшая субъединица 0,278923 0,289092 mbx TON_0490 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,514819 0,256304 mbx TON_0488 Субъединица NADH-дегидрогеназы 0,74442 0,331352 mbh TON_1583 Субъединица MbhB 0,67072 0,367439 mbh TON_1584 Субъединица MbhC 0,715606 0,384515 mbh TON_1586 Субъединица MbhE 0,579611 0,376248 mbh TON_1590 Субъединица MbhI 0,555557 0,42006 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0288 Гипотетический белок 0,798203 2,193867 codh-mch-mnh3 TON_1030 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 0,712484 2,238387 codh-mch-mnh3 TON_1025 Антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 0,923065 2,35011 codh-mch-mnh3 TON_1031 Компонент F или формиат-водород-лиаза 0,955361 2,246413 sufII TON_0051 Гипотетический белок 2,102325 1,996031 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1571 Компонент I или формиат-водород-лиаза 2,061174 1,799012 codh-mch-mnh3 TON_1017 Домен, связывающийся с 4Fe-4S-ферроредоксином, содержащим железо-серу 1,537494 2,172151 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1581 Молибдоптерин-гуанин-динуклеотид, ответственный за биосинтез белка А 1,42751 1,994937 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0263 Протеаза, участвующая в созревании гидрогеназы HycI 0,929162 1,474294 sulfI TON_0539 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 0,852292 1,341748 sufII TON_0053 Дельта-цепь сульфгидрогеназы II 1,065323 1,367881 codh-mch-mnh3 TON_1016 Предполагаемый регулятор транскрипции семейства ModE 1,219563 1,440116 fdh1-mfh1-nmh1 TON_0282 Предполагаемый регулятор транскрипции 1,517388 1,556418 fdh1-mfh1-mnh1 TON_0283 Белок, участвующий в экспрессии/образовании гидрогеназы hypC 1,601742 1,508267 codh-mch-mnh3 TON_1018 Монооксид углерода-дегидрогеназа, каталитическая субъединица 1,420438 1,274753 codh-mch-mnh3 TON_1022 NADH-дегидрогеназа дыхательной цепи, субъединица 1 1,771932 1,186361 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1578 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 1,656445 1,198853 codh-mch-mnh3 TON_1029 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF67 1,207926 0,928939 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1572 Гипотетический белок 1,247346 1,037087 frh TON_1560 Гамма-субъединица кофермент F420-гидрогеназы 1,415197 1,018573 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1577 Антипорт Na⁺/H⁺ мультисубъединицы, предполагаемая субъединица MnhB 1,43188 1,026239

frh TON_1561 Нитрит/сульфит-редуктаза, связывающаяся с 4Fe-4S- ферредоксином, содержащим железо-серу 1,355412 1,07094 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1579 Предполагаемый интегральный мембранный белок семейства DUF68 1,382536 1,135341 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1566 NADH-дегидрогеназа (хинон) 1,807319 0,972802 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1580 Компонент F или формиат-водород-лиаза 1,804806 1,031391 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1576 Гипотетический белок 1,558306 0,954677 codh-mch-mnh3 TON_1020 Гипотетический белок 1,971922 3,839171 codh-mch-mnh3 TON_1023 Компонент G или формиат-водород-лиаза 1,863412 4,045911 codh-mch-mnh3 TON_1024 NADH-дегидрогеназа (убихинон), 20 кДа-субъединица 1,353224 3,47523 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1563 Предполагаемая формиат-дегидрогеназа, альфа-субъединица 4,251498 2,533032 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1564 Белок, связывающийся с 4Fe-4S-кластером 3,005736 1,806787 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1568 Компонент С или формиат-водород-лиаза 2,936933 1,620744 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1567 Компонент В или формиат-водород-лиаза 3,431877 1,536872 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1570 Формиат-водород-лиаза, субъединица 6 2,69592 2,206621 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1569 Компонент G или формиат-водород-лиаза 3,631759 1,932512 fdh2-nfh2-mnh2 TON_1574 антипорт Na⁺/H⁺, предполагаемая субъединица MnhF 3,337596 2,209765 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1565 Субъединица антипорта Na⁺/H⁺ 1,446144 0,801728 fdh2-mfh2-mnh2 TON_1573 Предполагаемый переносчик формиата 2,315563 1,228123

3) Нарушение гена и анализ фенотипов мутантов по нарушению

Транскриптомный анализ дает основание предположить, что Mfh2 может играть важную роль в продуцировании водорода в присутствии экзогенного формиата в T. onnurineus NA1. Однако в связи с активацией нескольких ОРС кластера codh-mch-mnh3 в формиатсодержащей среде или в связи с высоким уровнем экспрессии других генов гидрогеназ, таких как Mbx или Frh, возникает вопрос, может ли сам Mfh2 участвовать в продуцировании водорода в присутствии экзогенного формиата и могут ли другие гидрогеназы действовать по альтернативному пути для Mfh2 посредством образования комплексов в комбинации с формиатдегидрогеназами или рециклинга электронных носителей, таких как FADH₂ или NADH. Таким образом, авторами настоящего изобретения были сконструированы мутанты по нарушению крупной субъединицы гидрогеназы Mfh1 (TON_0276) или Mfh2 (TON_1569). Метод конструирования мутантов по нарушению проиллюстрирован на фиг.13A. Крупную субъединицу каждого из кластеров гена гидрогеназы Mfh1 и Mfh2 подвергали нарушению путем инсерционной инактивации кластера P_gdh-hmg _Pfu посредством гомологичной рекомбинации в области мишени, что приводило к сверхэкспрессии гена hmg-CoA. Нарушение гена-мишени подтверждали путем анализа на присутствие кластера P_gdh-hmg _Pfu с помощью ПЦР-амплификации после скрининга групп-кандидатов в среде YPS, в которую было добавлено 10 мкМ симвастатина (фиг.13B). Так, например, P_gdh-hmg _Pfu может быть амплифицирован в группах-кандидатах с нарушением ( ^Δ mfh1 _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 ), тогда как амплификация крупных субъединиц Mfh2 или Mfh2 не происходила. Полученные результаты показали, что нарушение гена-мишени происходило точно в нужном локусе гена-мишени и что такая система нарушения генов, сообщаемая микроорганизму T. kodakaraensis KOD1 (Sapra, R., K. Bagramyan и M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550), может быть также применена к T. onnurineus NA1.

Поскольку мутанты с нарушением ^Δ mfh1 _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 могут быть получены в среде YPS, то очевидно, что Mfh1 и Mfh2 не играют важной роли в метаболическом поглощении среды YPS. Изменения в росте и морфологии мутантных штаммов гидрогеназы Mfh1, Mfh2 и Mch (^Δ mfh1 _TNA1 , ^Δ mfh2 _TNA1 и ^Δ mch _TNA1) показали, что эти гены необязательно должны присутствовать в среде YPS (фиг.14). Кроме того, штаммы ^Δ mfh1 _TNA1 и ^Δ mch _TNA1 обладают способностью расти и продуцировать водород в формиатсодержащей среде на уровне, аналогичном уровню, наблюдаемому для штамма дикого типа (фиг.11 и 14). Полученные данные показали, что генные кластеры не способны продуцироваться в среде, в которую был введен экзогенный формиат. С другой стороны, мутант ^Δ mfh2 _TNA1 не обладает способностью к росту и не продуцирует водород (фиг.14). Полученные результаты в целом показали, что при подаче формиата в качестве субстрата в росте и продуцировании водорода участвует только гидрогеназа Mfh2.

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Как описано выше, новые гидрогеназы согласно изобретению могут продуцировать большое количество водорода благодаря их специфической восприимчивости к различным субстратам, таким как монооксид углерода, формиат или крахмал. В соответствии со способами получения водорода согласно изобретению большое количество водорода может быть получено просто путем культивирования вышеописанного штамма в специфических условиях культивирования. Таким образом, способы согласно изобретению имеют преимущества, заключающиеся в том, что они являются экономически более выгодными и более эффективными, чем известные способы получения водорода, и могут быть применены для получения водорода даже при высоких температурах.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены ферменты: гидрогеназа и дегидрогеназа, выделенные из Thermococcus onnurineus NA1 и имеющие последовательности, приведенные в описании, а также кодирующие их гены. Описан вектор, содержащий указанные гены, объединенные в кластер FDH2-MFH2-MNH2. Описана клетка-хозяин, содержащая указанный вектор. Предложены способы получения водорода, включающие следующие стадии: приготовления среды в сосуде для культивирования; подачи формиата в газовую фазу, присутствующую в сосуде для культивирования; культивирования рекомбинантной клетки-хозяина или штамма T. onnurineus в сосуде для культивирования; извлечения водорода из сосуда для культивирования. Изобретение позволяет наиболее эффективно получать водород микробиологическим способом в среде, содержащей формиат в газовой фазе. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Выделенная гидрогеназа, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

2. Выделенный ген, кодирующий гидрогеназу по п.1.

3. Ген по п.2, содержащий последовательность оснований SEQ ID NO: 18.

4. Способ получения водорода с помощью Thermococcus spp., включающий стадии:
приготовления среды в сосуде для культивирования;
культивирования Thermococcus spp., имеющего гены, кодирующие гидрогеназу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и дегидрогеназу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, в сосуде для культивирования с формиатом в качестве добавки к среде; и
извлечения водорода из сосуда для культивирования.

5. Способ по п.4, где Thermococcus spp. представляет собой Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: KCTC 10859BP).

6. Способ по любому из пп.4 или 5, где культивирование осуществляют при высокой температуре 80°С.

7. Способ по любому из пп.4 или 5, где культивирование осуществляют в анаэробных условиях.

8. Дегидрогеназа, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

9. Ген, кодирующий дегидрогеназу по п.8.

10. Ген по п.9, содержащий последовательность оснований SEQ ID NO: 22.

11. Рекомбинантный вектор для получения водорода, содержащий гены SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 18 (гены, которые организованы в кластер FDH2-MFH2-MNH2), где указанные гены являются функционально связанными.

12. Прокариотическая клетка для получения водорода, трансформированная рекомбинантным вектором по п.11.

13. Способ получения водорода с использованием трансформанта по п.12, включающий стадии:
приготовления среды в сосуде для культивирования;
подачи формиата в газовую фазу, присутствующую в сосуде для культивирования;
культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и
извлечения водорода из сосуда для культивирования.