СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/50 G01N33/48 

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и микробиологии и может быть использовано для исследования бактериологического материала на наличие липолитической активности методом постановки диффузионных тестов с применением неионных детергентов (твины, тритоны) в качестве субстратов для бактериальных липолитических ферментов.

Изучение липолитических ферментов бактерий представляет интерес как с точки зрения более полной характеристики их участия в метаболизме, так и для оценки вклада отдельных ферментов в адаптацию микробов к различным условиям существования, а применительно к патогенным бактериям в вирулентность возбудителя и иммунологическую эффективность различных субклеточных фракций. Отдельные гидролитические ферменты (липазы, фосфолипазы, эстеразы, протеазы и т.д.) бактериальной клетки могут быть использованы как компоненты субъединичных вакцин.

В настоящее время нет доступных, простых, экономичных, но при этом быстрых и чувствительных способов определения липолитической активности в материале, содержащем фрагменты бактериальной клетки. Поэтому разработка новых и усовершенствование существующих способов определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий остается актуальной задачей.

Известен способ определения липолитической активности, при котором используют среду Зобеля, содержащую 10 грамм пептона, 1 грамм дрожжевого экстракта, 0,05 грамм CaCl₂, 15 грамм бакто-агара и морскую воду с рН 7,6. В данную среду добавляют Твин-20 в конечной концентрации 1% или трибутирин в конечной концентрации 0,25%. После этого среду с добавкой Твина-20 (или трибутирина) разливают по чашкам Петри. После застывания среды вносят исследуемый материал в количестве 150 мкл и чашки инкубируют при 30°С в течение 10 дней. После 10 дней инкубации измеряют диаметр гало (halos) (Mohankumar, A. Purification and characterization of esterase from marine Vibrio fisheri isolated from squid / Mohankumar A., Ranjita P. // Indian journal of marine sciences. - 2010. - V.39, N2. - P.262-269).

Однако данный способ длителен, т.к. необходима инкубация (в течение 10 дней) для накопления микробной массы и достижения эффективной концентрации фермента. Кроме того, данный способ не позволяет определять липолитическую активность в субклеточных фракциях бактерий.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения липолитической активности, в котором в качестве субстрата используется 10% раствор Твина-20. Смесь для определения липолитической активности состоит из 100 мкл 10% раствора субстрата в 50 мМ Трис-HCl-буфера, рН 7,6 со 100 мкл 1М CaCl₂ в 50 мМ Трис-HCl-буфера, 500 мкл концентрированного культурального супернатанта и 2,3 мл Трис-буфера. Исследуемые образцы вносят в среду, нагревают на водяной бане в течение 2 часов при 37°С, охлаждают и проводят измерение оптической плотности через каждые 2 часа в течение 20 часов в кюветах автоматического спектрофотометра при длине волны 400 нм (Lonon, М.К. Production of lipase by clinical isolates of Pseudomonas cepacia / М.K. Lonon, D.E. Woods, D.C. Straus // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol.26, N 5. - P.979-984). Проявление липолитической активности регистрируется по увеличению оптической плотности (мутности) реакционной среды.

Недостатками данного метода являются длительность определения, трудоемкость. Кроме того, требуется специальное оборудование для регистрации результатов.

Цель изобретения - упрощение, повышение доступности, удешевление способа определения липолитической активности.

Поставленная цель достигается тем, что для определения липолитической активности используют среду, содержащую 500 мг агарозы или агара, 50 мкл Твина-20, или 50 мкл Твина-40, или 50 мкл Твина-80, или 50 мкл Тритона Х-305, или 50 мкл Тритона Х-100, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 (до 100 мл). Среду нагревают в течение 5 минут на кипящей водяной бане до растворения агара или агарозы и разливают по чашкам Петри. После застывания среды в ней пробивают лунки и вносят в них исследуемый материал (субклеточные фракции бактерий) в объеме 10-50 мкл, приготовленные из расчета 1-4 мг сухого препарата на 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3.

После внесения исследуемого материала чашку Петри инкубируют при 37°С в течение 12 часов во влажной камере. После инкубации визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом материале: при наличии липолитической активности видны матовые ореолы вокруг лунок на фоне прозрачной среды, при отсутствии липолитической активности ореолы не формируются - среда остается прозрачной.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что среда дополнительно содержит агарозу или агар, при этом среда имеет следующий состав (на 100 мл среды): агароза или агар - 500 мг, неионный детергент - 50 мкл, хлористый кальций - 12,5 мг, 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. После застывания среды в ней делают лунки, в которые вносят исследуемый образец (препараты мочевинных экстрактов, наружных мембран, дезинтегрированных клеток бактерий) в объеме 10-50 мкл на лунку, затем среду с исследуемым образцом инкубируют при 37°С в течение 12 часов, после чего визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом образце: при наличии липолитической активности видны матовые ореолы вокруг лунок, при отсутствии липолитической активности их не будет - среда остается прозрачной. При этом в качестве неионного детергента используют или Твин 20, или Твин 60, или Твин 80, или Тритон Х-100, или Тритон Х-305, а образцы готовят из расчета 1-4 мг сухого вещества на 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так авторами не найден способ определения липолитической активности, который включал бы предлагаемые режимы. Предлагаемый нами способ позволяет использование всех ингредиентов в минимальных концентрациях, не требует оснащения специальной аппаратурой и дорогостоящими реактивами, осуществляется в течение короткого промежутка времени. Таким образом, способ экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, позволяет определять липолитическую активность в субклеточных фракциях.

Данный способ может быть использован в клинических и научно-исследовательских лабораториях для определения липолитической активности в бактериальных субклеточных фракциях.

Таким образом, предлагаемый способ определения липолитической активности соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ определения липолитической активности осуществляется следующим образом: 0,5 г агарозы или агара смешивают с 50 мкл Твина-20, или Твина-60, или Твина-80, или Тритона Х-100, или Тритона Х-305 и с 12,5 мг CaCl₂, в 20 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8.3, затем доводят до 100 мл 0,05 М Трис-HCl буфером рН 8.3, после чего среду нагревают в течение 15 минут до растворения агара или агарозы и разливают по чашкам Петри. Образцы для исследования готовят следующим образом: сухой препарат субклеточных фракций в количестве 1-4 мг растворяют и суспендируют в 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфере рН 8,3. В качестве образцов используют препараты мочевинных экстрактов, наружных мембран, дезинтегрированных клеток (субклеточные фракции).

Субклеточные фракции из V. cholerae, бруцелл и других бактерий получали по методу Lohia, А. в модификации Е.Ю. Маркова (Марков, Е.Ю. Поверхностные структуры и антигены холерного вибриона, бруцелл и туляремийного микроба: Дис. д-ра биол. наук: 03.00.07 / Е.Ю. Марков; Иркутский н.-и. Противочумный институт Сибири и Дальнего Востока МЗ РФ. - Иркутск, 2000. - 313 с.).

Далее в среде пробивают лунки на расстоянии не менее 0,5 см друг от друга и вносят материал в количестве от 10 до 50 мкл на лунку (нагрузка 10-50 мкг по белку). Чашки с внесенным в лунки исследуемым материалом выдерживают во влажной камере при 37°С в течение 12 часов и затем визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемых образцах. При наличии липолитической активности в исследуемом образце вокруг лунок видны матовые ореолы - зоны липолиза субстрата вокруг лунок, при отсутствии липолитической активности ореолов нет, среда вокруг лунок будет прозрачной.

В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат липазы из поджелудочной железы свиньи (готовится раствор из расчета 1 мг сухого препарата на 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3), а в качестве отрицательных контролей - 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 и коммерческий препарата трипсина (готовили раствор из расчета 1 мг сухого препарата трипсина на 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3). Контроли вносили по 10 мкл в соответствующие лунки.

Пример 1. Определяли липолитическую активность дезинтегрированных клеток Vibrio cholerae M-878, как описано выше. Для этого 1 мг дезинтегрированных клеток Vibrio cholerae M-878 суспендировали в 1 мл буфера 0,05 М Трис-HCl рН 8,3. После этого вносили приготовленный таким образом образец дезинтегрированных клеток в объемах 10, 30 и 50 мкл в лунки (по 4 лунки), сделанные в среде, которая содержала (на 100 мл среды): 0,5 г агарозы, 50 мкл Тритона Х-305, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческий сухой препарат липазы, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3, в концентрации 1 мг/мл, и вносили в 2 лунки по 10 мкл. В качестве отрицательного контроля использовали 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3, который вносили в лунку в объеме 10 мкл (2 лунки). После этого чашки Петри ставили в эксикатор и инкубировали в термостате при 37°С 12 часов. После инкубации визуально определяли наличие липолитической активности у исследуемого образца. Вокруг всех лунок с образцами наблюдались матовые ореолы, ширина которых у образцов, внесенных в объеме 10 мкл, составляла 0,50±,02 мм; 30 мкл - 1±0,04 мм; 50 мкл - 1,5±0,04 мм. Вокруг лунок с положительным контролем ширина ореолов равна 5±0,03 мм. Вокруг лунок с отрицательными контролями ореолов нет - зона липолиза отсутствует - среда вокруг лунок прозрачная. Таким образом, исследуемый образец дезинтегрированных клеток Vibrio cholerae M-878 обладает липолитической активностью.

Пример 2. Определяли липолитическую активность дезинтегрированных клеток Vibrio cholerae О 139 И-16, как описано выше: 4 мг дезинтегрированных клеток Vibrio cholerae О 139 И-16 суспендировали в 1 мл 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3. После этого вносили приготовленный таким образом образец в объемах 10, 30, и 50 мкл в лунки, сделанные в среде, которая содержала 0,5 г агара, 50 мкл Твина-20, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческий сухой препарат липазы, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 (1 мг/мл), и вносили в лунку в объеме 10 мкл. В качестве отрицательных контролей использовали 0,05 М Трис-HCl буфер, рН 8,3, который вносили в лунку в объеме 10 мкл, и коммерческий сухой препарат трипсина, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 в концентрации 1 мг/мл и вносили в лунку в объеме 10 мкл. После этого чашки Петри ставили во влажную камеру и инкубировали в термостате при 37°С в течение 12 часов. После инкубации визуально определяли наличие липолитической активности у исследуемого образца. Вокруг всех лунок с образцами наблюдали матовые ореолы, ширина которых у образцов, внесенных в объеме 10 мкл, составляла 1,2±0,03 мм; 30 мкл - 2,4±0,03 мм; 50 мкл - 2,8±0,04 мм. Вокруг лунок с положительным контролем наблюдался ореол, ширина которого была равна 5±0,04 мм. Вокруг лунок с отрицательными контролями ореолов вокруг лунок не наблюдали - зона липолиза отсутствовала - среда вокруг лунок прозрачная.

Таким образом, исследуемый образец - дезинтегрированные клетки Vibrio cholerae О 139 И-16 обладает липолитической активностью.

Пример 3. Определяли липолитическую активность наружных мембран V. cholerae И-563, как описано выше: 1 мг препарата наружных мембран V. cholerae И-563 суспендировали в 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3. После этого вносили приготовленный таким образом образец в объемах 10, 30, и 50 мкл в лунки, сделанные в среде, которая содержала (на 100 мл) 0,5 г агарозы, 50 мкл Тритона Х-305, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческий сухой препарат липазы, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 в концентрации 1 мг/мл и вносили в лунку в объеме 10 мкл. В качестве отрицательных контролей использовали 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 и коммерческий сухой препарат трипсина, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 в концентрации 1 мг/мл и вносили в лунку в объеме 10 мкл. После этого чашки Петри ставили во влажную камеру и инкубировали в термостате при 37°С 12 часов. После инкубации визуально определяли наличие липолитической активности у исследуемого образца. Вокруг лунки с положительным контролем наблюдали ореол (5±0,03 мм). Вокруг лунок с отрицательными контролями ореолов нет - среда вокруг лунок прозрачная. Среда вокруг всех лунок с образцами прозрачна, ореолов нет.

Таким образом, исследуемый образец - наружные мембраны Vibrio cholerae И-563 не обладает липолитической активностью.

Пример №4. Определяли липолитическую активность наружных мембран V. cholerae И-563, как описано выше: 4 мг препарата наружных мембран V. cholerae И-563 суспендировали в 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3. После этого вносили приготовленный таким образом образец в объемах 10, 30, 50 мкл в лунки, сделанные в среде, которая содержала (на 100 мл) 0,5 г агара, 50 мкл Твина-60, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческий сухой препарат липазы, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 (1 мг/мл) и вносили в лунку в объеме 10 мкл. В качестве отрицательных контролей использовали 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3, и коммерческий сухой препарат трипсина, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 в концентрации 1 мг/мл и вносили в лунку в объеме 10 мкл. После этого чашки Петри ставили во влажную камеру и инкубировали в термостате при 37°С в течение 12 часов. Затем определяли наличие липолитической активности образца. Среда вокруг всех лунок с образцами прозрачна, ореолов нет. Вокруг лунки с положительным контролем наблюдали ореол шириной 5±0,03 мм. Вокруг лунок с отрицательными контролями зона липолиза отсутствует - среда вокруг лунок прозрачная.

Таким образом, исследуемый образец - мембраны Vibrio cholerae И-563 не обладает липолитической активностью.

Пример №5. Определяли липолитическую активность мочевинного экстракта Brucella suis И-52, как описано выше: 1 мг препарата мочевинного экстракта Brucella suis И-52 суспендировали в 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3. После этого вносили приготовленный таким образом образец в объемах 10, 30, 50 мкл в лунки, сделанные в среде, которая содержала (на 100 мл) 0,5 г агарозы, 50 мкл Твина-80, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческий сухой препарат липазы, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 (1 мг/мл) и вносили в лунку в объеме 10 мкл. В качестве отрицательных контролей использовали 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 и коммерческий сухой препарат трипсина, который растворяли в буфере Трис-HCl (1 мг/мл) и вносили в лунку в объеме 10 мкл. После этого чашки Петри ставили во влажную камеру и инкубировали в термостате при 37°С в течение 12 часов. После инкубации визуально определяли наличие липолитической активности у исследуемого образца. Вокруг всех лунок с образцами наблюдали ореолы, ширина которых у образцов, внесенных в количестве 10 мкл, составляла 1±0,03 мм; 30 мкл - 1,5±0,02 мм; 50 мкл - 2±0,02 мм. Вокруг лунки с положительным контролем также наблюдали ореол шириной 5±0,02 мм. Вокруг лунок с отрицательными контролями ореолов не наблюдали - среда вокруг лунок прозрачная.

Таким образом, исследуемый образец препарата мочевинного экстракта Brucella suis И-52 обладает липолитической активностью.

Пример 6. Определяли липолитическую активность мочевинного экстракта Brucella suis И-52, как описано выше: 4 мг препарата мочевинного экстракта Brucella suis И-52 суспендировали в 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3. После этого вносили приготовленный таким образом образец в объемах 10, 30, 50 мкл в лунки, сделанные в среде, которая содержала (на 100 мл) 0,5 г агара, 50 мкл Тритона Х-100, 12,5 мг CaCl₂ и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческий сухой препарат липазы, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 (1 мг/мл) и вносили в лунку в объеме 10 мкл. В качестве отрицательных контролей использовали 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 и коммерческий сухой препарат трипсина, который растворяли в 0,05 М буфере Трис-HCl рН 8,3 (1 мг/мл) и вносили в лунку в объеме 10 мкл. После этого чашки Петри ставили во влажную камеру и инкубировали в термостате при 37°С в течение 12 часов. После инкубации визуально определяли наличие липолитической активности в исследуемом образце. Вокруг всех лунок с образцами наблюдали матовые ореолы, ширина которых у образцов, внесенных в объеме 10 мкл, равна 2,2±0,03 мм; 30 мкл - 2,5±0,04 мм; 50 мкл - 2,8±0,03 мм. Вокруг лунки с положительным контролем также наблюдали матовый ореол, ширина которого была равна 5±0,04 мм. Вокруг лунок с отрицательными контролями ореолов нет - зона липолиза отсутствует - среда вокруг лунок прозрачная.

Таким образом, исследуемый образец препарата мочевинного экстракта Brucella suis И-52 обладает липолитической активностью.

Указанный способ определения липолитической активности был использован при анализе 352 образцов - обеззараженных субклеточных фракций холерного вибриона и бруцелл: препаратов дезинтегрированных клеток бактерий, мочевинных экстрактов, белков наружных мембран.

Исследование образцов проводили параллельно по способу-прототипу. Результаты совпали во всех случаях. Таким образом, по точности определения липолитической активности предлагаемый нами способ не уступает прототипу, при этом он экономичнее, доступнее. Простота постановки способа, не требующего специальной аппаратуры и дорогостоящих реактивов, в сочетании с высокой экономичностью позволяет использовать его в любой лаборатории.

Изобретение относится к области биохимии и микробиологии и может быть использовано для определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий. Сущность способа состоит в том, что среда, содержит агарозу или агар (500 мг), неионный детергент (50 мкл), хлористый кальций (12,5 мг), 0,05 М Трис-HCl буфер pH 8,3 (до 100 мл), причем после застывания среды в ней делают лунки, в которые вносят исследуемый образец в объеме 10-50 мкл на одну лунку, затем среду с исследуемым образцом инкубируют при 37°C в течение 12 часов и визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом образце. При наличии липолитической активности наблюдают матовые ореолы вокруг лунки, при отсутствии липолитической активности среда вокруг лунки остается прозрачной. Использование заявленного способа позволяет просто, доступно и экономично определить липолитическую активность субклеточных фракций бактерий. 3 з.п. ф-лы, 6 пр.

1. Способ определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий, включающий приготовление среды, содержащей неионный детергент, хлористый кальций и Трис-HCl буфер, внесение в нее исследуемого образца и определение липолитической активности, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит агарозу или агар, при этом среда имеет следующий состав (на 100 мл среды): агароза или агар - 500 мг, неионный детергент - 50 мкл, хлористый кальций - 12,5 мг, 0,05 М Трис-HCl буфер рН 8,3 - до 100 мл, причем после застывания среды в ней делают лунки, в которые вносят исследуемый образец в объеме 10-50 мкл на лунку, затем среду с исследуемым образцом инкубируют при 37°C в течение 12 ч, после чего визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом образце: при наличии липолитической активности наблюдают матовые ореолы вокруг лунок, при отсутствии липолитической активности ореолов не будет - среда остается прозрачной.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неионного детергента используют или Твин 20, или Твин 60, или Твин 80, или Тритон Х-100, или Тритон Х-305.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве образцов используют препараты мочевинных экстрактов, наружных мембран, дезинтегрированных клеток бактерий.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы готовят из расчета 1-4 мг сухого вещества на 1 мл 0,05 М Трис-HCl буфера рН 8,3.