Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии.
Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка preS1 НВУс20-й по 68-ю аминокислоту.
Сконструирован рекомбинантный ген HBcAg A-pre S1 (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида pGCSI-140 для его экспрессии, а также штамм-продуцент E.coli (pGCSI-140) реком- бинантной капсидной структуры HBcAg Д- HBV preSI(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее 26,7% от суммарного белка E.coli.
Рекомбинантная плазмида pGCS-140 состоит из следующих элементов: ДНК плазмиды рНВс 1315, которая представляет собой вариант плазмиды рНВсЗ, содержащей ген HBcAg с оптимизированным
VJ
Јь О
00
участком инициации трансляции, но с му- тантным геном НВсАд, содержащим пол- илинкерную вставку по 144-й аминокислоте и предназначенным для внедрения чужеродных последовательностей по этому участку, протяженность 6900 п.о.; фрагмент генома HBV из плазмиды рНВ320, соответствующий последовательности между сайтами рестрикции Mstlhgos и BamHl2053 и кодирующий участок preSI (20-68) протяженностью 150 п.о.
Размер плазмиды 7050 п.о., мол.м. 4,5 МД.
В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pGCSI-140 входят следующие гены: ген HBcAg A-preSI (20-68), обеспечивающий синтез конечного продукта; ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.
Ген HBcAg A-preS 1(20-68) находится под контролем тандема промоторов Ptrp.
Плазмида pGCSI-140 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола, неконьюгативна.
Сущность способа конструирования плазмиды pGCS(-140 состоит в том, что фрагмент гена preSI, именуемый HBVpreSI (20-68), протяженностью 150 п.о. внедряют по сайтам рестрикции Clal (по кодону 144-й аминокислоты) в векторную плазмиду рНВс1315 с образованием рекомбинантно- го гена HBcAg A-preSI (20-68). В результате изменения рамки считывания вправо от внедренного фрагмента наводится терминирующий кодон и нуклеотидная последовательность, кодирующая 39 С-концевых аминокислот HBcAg, не транслируется.
Штамм- продуцент HBcAg A-preSI (20- 68) получают трансформацией клеток E.coli К802 рекомбинантной плазмидной ДНК pGCSI-140.
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные,
Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины.
Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования - 37°С, оптимум рН 7,0- 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединения в виде пептона, триптона, аминокислот.
Устойчивость к антибиотикам:устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК экспресс-методом.
Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4975.
П р и м е р.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pGCSI-140.
10 мкг плазмиды рНВс1315, выделенной стандартным методом, расщепляют 10 ед, рестриктазы Cla I в 25 мкл раствора А, содержащего 10 тМ трис-HCI, рН 7,5,50 тМ
NaCI, 10 тМ MgCte и 1 тМ дитиотрейтол (ДТТ) в течение 2 ч. Рестриктазу инактиви- руют 15-минутным прогреванием при 65°С. После очистки на агарозном геле (на бумаге ДЕ-81) известным методом фрагмент ДНК с
мол.м. 4,42 МД (размером 6900 п.о.) растворяют в 20 мкл Н20 (ДНК 1)
50 мкг плазмиды рНВ 320, полученной очисткой на оксиапатите, расщепляют 25 ед. рестриктазы Bgl II и 25 ед. рестриктазы
Есо81 II (Mst II) в 250 мкл раствора Б, содержащего 10 тМ трис-HCI, рН 8,5, 10 тМ MgCl2 и 1 тМ ДТТ, в течение 3 ч при 37°С. После очистки на агарозном геле известным методом фрагмент Bgl II 2534 - Mstlhgos с
мол.м. 0,4 МД (размером 626 п.о.) растворяют в 20 мкл Н20 (ДНК 2).
2 мкг ДНК 2 расщепляют 2 ед рестриктазы Bam HI в 20 мкл раствора А в течение 2 ч при 37°С. Фрагмент Bam HI2053 Mstlligos размером 145 п.о. после очистки на 2 %-ном агарозном геле растворяют в 10 мкл Н20(ДНКЗ).
Заполнение липких концов вектора и клонируемого фрагмента проводят совместно, для чего 0,1 мкг ДНК 1 и 0,05 мкг ДНК 3 инкубируют с 0,бед. ДНП-полимеразы E.coli (фрагмент Кленова) в 10 мкл раствора В, содержащего 50 тМ трис-HCI, рН 7,5,10 тМ MgCl2, 33 ju M dATP, dCTP, dTTP и dGTP, в
течение 1 ч при 12°С. ДНК-полимеразу инак- тивируют 15-минутным прогреванием при 65°С.
После заполнения липких концов за- шивку вектора и клонируемого фрагмента проводят в 12 мкл раствора Всдобавлением 10 ед, Т4 ДНК-лигазы и АТР до конечной концентрации 500 /л М в течение 12 ч при 4°С. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток E.coli RRI, образованных 100 тМ CaCIa (конечная концентрация 5х109 клеток/мл) для трансформации клеток путем рестрикционного анализа и секвенирова- ния плазмидной ДНК, выделенной экс- пресс-методом, Плазмида с ожидаемой рестрикционной картой и нуклеотидной последовательностью получает наименование pGCSI-140.
2.Штамм-продуцент E.coli K802 (pGCSI- 140). Выделение и очистка рекомбинантно- го белка HBcAg A-preSI (20-68).
Штамм-продуцент получают трансформацией клеток E.coli K802 рекомбинантной плазмидой pGCSI-140. Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казами- новые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин 0,02, до оптической плотности 4-5. Клетки собирают центрифугированием и лизируют в трехкратном объеме буфера, содержащего 0,05 М трис-HCI, рН 8,0, 0,15 М NaCI, 0,1% тритон Х100, 0,005 М ЭДТА, при 4°С клетки подвергают трехкратному замораживанию- оттаиванию, добавляют дезоксирибонукле- азу и MgCIa до конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 тМ соответственно и инкубируют 30 мин при 4°С. Лизат осветляют центрифугированием (10 ОООхд, 4°С). НВсАд A-preSI(20-68) очищают следующим образом, Лизат подвергают фракционированию сульфатом аммония. HBcAg A-preSI(20-68) собирают в осадке, полученном при 30% насыщения сульфатом аммония, Осадок растворяют в 0,04 М фосфате натрия, рН 8,0, 0,15 NaCI, 0,1% тритоне Х100 до конечной концентрации белка 25 - 50 мкг/мл, и 6 - 7 мл этого раствора наносят на колонку с Се- фарозой CL4B (2,1x75 см), уравновешенную тем же буфером, но без тритона Х100. Фракции, проявляющие HBcAg-активность собирают и используют либо непосредственно, либо после концентрирования переосаждением 50% сульфатом аммония.
3.Определение HBcAg-активности методом РИД.
Титр HBcAg определяют с помощью радиальной иммунодиффузии.
Для этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против анти-НВс антител человека. В качестве стандарта используют очищенный HBcAg, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл).
Результаты титрования активности методом РИД приведены в табл.1,
4.Определение preSI-активности методом иммуноблотинга. Мол.м. белка HBcAg
A-preSI (20-68).
Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспензируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель, содержащего 2 %-ный додеци л сульфат натрия (ДСН) и 2 %-ный / -меркаптоэтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12 - 18%) размером 150x150x0,75 мм. Электрофорез проводят в
течение 15 ч при силе тока 7 тА. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу. Фильтры инкубируют с моно- клональными анти-preSI антителами мыши
МА18/7 в разведении 1:500 на буфере TBS, содержащем 50 трис-HCI, рН 7,8, 150 тМ NaCI, 0,1 % тритон Х100, 1 % БСА, в течение 15 ч при 20°С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при
20°С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:200. Фильтры отмывают TBS (3 - 5 раз) и проявляют диаминобензидином. Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают при этом появление специфических зон окраски, соответствующих белку с мол.м. 23.2 КД (или длиной 221 аминокислота), что соответствует схеме конструирования. Контрольные л.изаты клеток E.coli K802
(рНВсЗ) таких зон не обнаруживают.
5.Электронно-микроскопическая характеристика рекомбинантных капсидных структур HBcAg A-preS 1(20-68). Препараты очищенного белка HBcAg A-pre (20-68) готовят методом негативного контрастирования с применением 1 %-ного уранилацетата и исследуют на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз. Белок HBcAg A-preSI (20-68) образует капсиды диаметром 25 нм.
6.Определение preSI-активности в составе капсидных структур HBcAg A-preSI(20- 68) методом энзимоиммунологического
анализа на твердой фазе.
В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций. Очищенный белок HBcAg A-pre 51(20-68) разводят до концентрации 10 мкг/мл в 50 тМ МаНСОз - NaaCOa рН 9,5 и вносят в лунки планшетов - по 100 мкл в каждую, Инкубируют 16ч при 37°С, после чего раствор удаляют из лунок. планшеты высушивают. В лунки вносят моноклональные анти-preSI антитела мыши МА18/7 в разведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 2 ч при 37°С планшеты отмывают 5-6 раз дистиллированной водой и вносят по 100 мкл конъюгата
пероксидазы хрена с белком S.aureus в разведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и проводят цветную реакцию. В лунки вносят по 100 мкл 0,25%-ного раствора ортофенилендиамина.2НС1 в 0,1 М цитрате натрия рН 5,0, 0,02% На02, инкубируют 30 мин при 20°С, реакцию останавливают добавлением 100 мкл 0,1 H.HCI. Появление коричневой окраски свидетельствует о наличии preSIактивности. Для количественной оценки активности измеряют оптическую плотность при 492 нм и определяют величину P/N (та 6л .2).
Отсутствие реакции в отрицательном контроле (НВсАд) свидетельствует о специфичности связывания анти-preSI антител рекомбинантными капсидными структурами НВсАд Л-preSI (20-68),
7.Иммуноэлектронная микроскопия капсидных структур с использованием коллоидного золота.
Капсиды HBcAg A-preS 1(20-68) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой форм- варовой пленкой, в течение 15 мин, Сеточку промывают 0,5 мл раствора PBS, содержащего 0,05% Твин 20 (PBS-Твин 20), и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1 %-ного раствора БСА в воде, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20, инкубируют 15 мин в 0,03 мл раствора моно- клональных анти-preSI антител МА18/7 в разведении 1:10, промывают 0,5 мл PBS- Твин 20, инкубируют 20 мин в 0,03 мл антител кролика против иммуноглобулинов мыши (в разведении 1:5), промывают 0,5 мл PBS-Твин 20. Сеточку помещают на 1 ч в 0,03 мл раствора рА-Au, содержащего белок А, который конъюгирован с частицами коллоидного золота диаметром 8-10 нм, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20 и затем 1 мл НаО. Капсиды окрашивают методом негативного контрастирования 0,15 мл 2 %-ного уранилацетата. Все операции выполняются при 20°С. В случае поверхностной локализации соответствующих эпитопов капсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частиц коллоидного золота. В качестве отрицательного контроля использованы капсиды НВсАд, не несущие эпитоп preS 1(20-68). Эти капсиды на образуют комплексов с коллоидным золотом.
8.Иммуногенная активность рекомби- нантных капсид НВсАд Л-preS 1(20-68).
Определяют иммуногенность, рекомбинантными капсидами HBcAg A-preSi(20-68) иммунизируют кроликов. Для этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию. Антиген вводят подкожно. Инъекции антигена повторяют на 14- й и 21-й день и с 28-го дня начинают брать кровь. Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух антигенов: НВсАд (для определения анти-НВс антител), fr-preS (белок оболочки РНК-фага fr, несущий весь участок preS) - для определения анти-preSI антител.
Титры антител на 28 день иммунизации
приведены в табл.3.
Формула изобретения
1.Рекомбинантная плазмидная ДНК pGCSI-140 размером 7049 п.о.{4,52 Мд) кодирующая кор-антиген, лишенный 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В, с экспонированным на его поверхности эпи- топом pSI(20-68), содержащая: ДНК плазми- ды рНВс 1315 размером 6900 п.о.; Bam Hl2053-Mstll 1908-фрагментДНКплазмимиды рН В320 размером 149 п.о., кодирующего участок preSI(20-68) вируса гепатита В, уникальные сайты рестрикции и их координаты: BamHI(O), Sphl(191); Sall(276); Nrul(599), Snal(1871), Afl N1(2098), Psbl(3236),
Scal(3471), Xbal(5176), гены, регуляторные участки; ген HBcAg Л-pre 51(20-68), обеспечивающий синтез рекомбинантных капсидных структур НВсАд А-рге 31(20-68) (координаты 5087-5722); тандем промоторов Ptrp; ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину координаты 2918-3778.
2.Способ конструирования плазмидной ДНК pGCSI-140, заключающийся в том, что
кодирующую последовательность участка preSI размером 149 п.о, вырезают из плазмидной ДНК рНВ320 по рестрикционным сайтам BamHl2053 и Mstlhgos с заполнением липких концов ДНК-полимеразой E.coli и
встраивают в плазмиду рНВс1315 по сайту Clal за 144-й аминокислотой гена НВсАд, что приводит к терминации трансляции, трансформируют рекомбинантной ДНК штамм Escherichia coli и отбирают клоны,
содержащие целевую плазмиду.
3.Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-4975 - продуцент кор-антигена, лишенного, 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В с экспонированным на его
поверхности эпитопом preSI(20-68).
Таблица 1
Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии. Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка preSIHBV x 20 по 68-ю аминокислоту. Сконструирован рекомбинантный ген HBCAg A- preSI (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида pGCSI-140 для его экспрессии, а также штамм-продуцент E.coli/pGSI-140/ реком- бинантной капсидной структуры НВсАд Д- НВVpreS 1(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее 26,7% от суммарного белка. 3 с.п.ф-лы, 3 табл.
Синтез HBcAg A- pre SI (20-68) в бактериях E.coli K802, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК pGCSI-140
Иммунологическая активность рекомбинантных антигенов
Иммуногенность химерных капсид HBcAg A- preSI (20-68)
Таблица 2
Таблица 3
| Борисова Г.П | |||
| и др | |||
| ДАН СССР, 1984, т.279, с.1245 | |||
| Там же, 1988, т.298, с | |||
| Рефлектор для дуговых ламп | 1924 |
|
SU1474A1 |
