АГЕНТ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК КРОВИ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/42 A61P35/00 

Предлагаемая группа изобретений относится к области медицины и может быть использована при лечении людей с онкологическими заболеваниями ионизирующим излучением и химиотерапевтическими препаратами.

Известны способы лечения онкологических больных, включающие лучевую терапию и/или химиотерапию. /Н.Н.Блохин, Н.И.Переводчикова, Химиотерапия опухолевых заболеваний, М., Медицина, 1984, Лучевая терапия в лечении рака. Практическое руководство CHAPMAN & HALL MEDICAL, 2000/.

Однако используемые для лечения онкологических больных ионизирующее излучение и химиотерапевтические препараты повреждают не только опухолевые, но и здоровые быстро делящиеся клетки. Повреждение кроветворных клеток приводит к снижению сопротивляемости организма к различным вредным воздействиям и, кроме того, ухудшает обеспечение организма необходимым для жизнедеятельности кислородом. В связи с этим приходится уменьшать дозы радиации и химиотерапевтических средств, что в конечном счете снижает эффективность лечебных мероприятий.

Известны способы лечения онкологических больных, которые наряду с лучевой и/или химиотерапией включают профилактику лучевых и химиотерапевтических реакций и осложнений. Так для профилактики общей лучевой реакции больному с первого дня облучения назначают пищу, богатую витаминами, и внутримышечно через день витамины B₁, В₆, В₁₂ и С. В процессе облучения в зависимости от общего состояния и состава периферической крови показано переливание консервированной крови, переливание лейкоцитной массы. Из других средств, стимулирующих кроветворение, назначают лейкоген или лейкоцитин, батилол, каферид /И.А.Переслегин, Ю.Х.Саркисян, Клиническая радиология, М., Медицина, 1973, с.222-223/.

Известен широкий спектр препаратов, решающих задачу по стимулированию гемопоэза. Так для этих целей предлагается использовать средства, содержащие пророщенное зерно /патент РФ 2132135/, экстракты череды трехраздельной /патент РФ 2206998/, кипрея узколистого /патент РФ 2206997/, солодкового корня /патент РФ 2206996/, женьшеня /патент РФ 2197868/, а также железосодержащую минеральную воду /патент РФ 2116038/. Недостатком всех этих известных средств является их низкая эффективность.

Известно средство, влияющее на гемопоэз, полученное из крови оленей /патент РФ 2017493, А61К 35/14, 1994/. Так как олени проживают только на определенной, ограниченной территории земного шара, то источник получения препарата ограничен рамками этой территории. Кроме того, поскольку кровь необходимо брать в период наибольшей физиологической активности, то ограничен по времени и срок получения сырья. Сам препарат представляет собой лизированную кровь, частично очищенную от крупных фрагментов посредством фильтрации, однако низкомолекулярные вещества, содержащиеся в крови, в том числе и нежелательные для потребителей, в известном средстве остаются. К их числу относятся токсины, гормоны, желчные пигменты, холестерин, различные неорганические вещества и т.п. Все эти вещества могут содержаться в избытке в крови оленей еще и потому, что у данного вида животных отсутствует желчный пузырь, а именно с желчью и экскретируются главным образом перечисленные вещества. Наконец, самое главное - многокомпонентный препарат чрезвычайно трудно стандартизовать.

Известно, что внутривенное введение гемоглобина стимулирует гемопоэз.

Известно средство, предложенное в патенте США 5631219, А61К 038/16, 1997, где предлагается для стимулирования эритропоэза использовать особо чистый гемоглобин. Изобретение предлагает стимулировать гемопоэз у млекопитающих введением чистых растворов мутантного гемоглобина, полученного по рекомбинантной технологии, извлекаемого из Е.Coli, у которой экспрессирован ген гемоглобина, причем в этот ген введена мутация, обеспечивающая сшивание двух альфа- или двух бета- или нескольких альфа- и нескольких бета- субъединиц в тетрамер гемоглобина с помощью пептидного мостика. Такие мутантные рекомбинантные гемоглобины не диссоциируют на димеры, что повышает время внутрисосудистого существования белка и устраняет почечную токсичность. Недостатком указанного метода является тот факт, что по данным авторов мутантные рекомбинантные гемоглобины или гемоглобиноподобные белки активируют у экспериментальных животных не только эритропоэз, но и белый кровяной росток, что может свидетельствовать либо о токсическом действии этих белков, либо о развитии у животных иммунного ответа на вводимые гемоглобины со столь значительно измененной первичной и четвертичной структурой. Кроме того, метод получения рекомбинантного гемоглобина является трудозатратным и дорогостоящим.

Известно, что протопорфириновый комплекс (т.е. небелковая часть гемоглобина), содержащий железо в трехвалентной (окисной) форме - гемин, также обладает способностью стимулировать эритропоэз при внутривенном введении. Однако выделение гемина требует усилий, и, кроме того, для инъекционной формы требуется его стерильность.

В качестве ближайшего аналога может быть указан патент RU 2186579, описывающий композиции полипептида, включающего цепи гемоглобина, и способ лечения опухолей у больного, страдающего от токсического воздействия химиотерапии и лучевой терапии, а также способы защиты и восстановления кроветворной системы. Данный способ не достаточно эффективен.

Задача, решаемая изобретением, - расширение арсенала средств, применяемых для лечения онкологических больных.

Для решения поставленной задачи предлагаются способы применения модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина для лечения онкологических больных. Отличительной особенностью предлагаемых способов является то, что после облучения пораженного органа ионизирующим излучением либо химиотерапии цитостатиком внутривенно вводят модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин.

Дополнительно предлагается модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин (МГКП) вводить в количестве от 10 до 1000 мг на 1 кг массы пациента, предпочтительно в количестве от 10 до 100 мг на 1 кг массы пациента.

Наиболее оптимальным является доза, составляющая 10 мг/кг модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина с интервалом в 1 день.

Дополнительно предлагается первое введение модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина осуществлять в сроки, не превышающие 2 суток после облучения или введения цитостатика.

Для решения поставленной задачи предлагается применение модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина в качестве агента защиты клеток крови и восстановления кроветворной системы. Заявленный агент имеет пролонгированную циркуляцию в кровеносном русле, что обеспечивает более высокую эффективность способа лечения и снижение отрицательного воздействия облучения или цитостатиков на систему кроветворения. Это выявленное свойство представляется весьма важным, так как оно является одним из определяющих факторов в выживаемости онкологических больных, которые подвергались химио- или лучевой терапии. Увеличение количества клеток крови дает возможность врачу провести больше курсов химиотерапии больным, страдающим онкологическими заболеваниями.

Для решения поставленной задачи также предлагается фармакологическая комбинация для лечения онкологических больных в виде набора, содержащего цитостатик и модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин, предназначенные для раздельного или последовательного введения. Данная комбинация может включать самые различные применяемые в терапии цитостатики. В клинической практике в настоящее время применяют более 60 весьма эффективных цитостатиков. Они представляют собой различные по химическому строению вещества, такие как производные нитрозомочевины, производные хлорэтиламина, производные оксазафосфорина, производные этиленимина, производные метансульфоновой кислоты, аналоги пуринов, аналоги фолата, аналоги пиримидинов, таксаны, соединения платины, камптотецины, антибиотики и другие. И практически все из них проявляют указанное отрицательное воздействие на систему кроветворения, требующее соответствующей коррекции в способе лечения рака. Цитостатические лекарственные средства, как правило, содержатся в виде общепринятых в онкологии терапевтически эффективных доз.

Предпочтительное соотношение в комбинации цитостатика и модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина составляет 1:3-1:50.

При гемосупрессии цитостатиками или облучением ионизирующим излучением первое введение препарата осуществляют непосредственно после введения цитостатика или действия излучения, но предпочтительнее через сутки после указанных воздействий.

В настоящее время в клинической практике применяются различные полимеры модифицированного гемоглобина, например "Гемоксан", разработанный в НИИ переливания крови ГНЦ РАМН, Hemopure® [hemoglobin glutamer - 250 (bovine), производимый компанией Biopure Corporation, Hemolink™ фирмы hemosol Incorporated, Геленпол, разработанный в ИВС РАН совместно с РосНИИГиТ и др.

Полимерный модифицированный гемоглобин, пригодный для целей настоящего изобретения, может представлять собой продукт поликонденсации гемоглобина с модификатором, представляющим собой олигомерное производное глутарового альдегида с глутаминовой кислотой. Данная модификация обеспечивает стабилизацию четвертичной структуры белка. Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина сшивкой его продуктом взаимодействия глутарового альдегида с дикарбоновой аминокислотой, представляющей собой глютаминовую кислоту, описан, например, в патенте RU 2162707.

Доказательство заявленного применения полигемоглобина, модифицированного глютаминовой кислотой (МГКП), иллюстрируют следующие эксперименты.

Предварительно было показано, что МГКП незначительно повышает число эритроцитов и клеточность костного мозга у интактных животных, однако это повышение проявляется в виде тенденции. Иными словами, у интактных животных препарат не вызывает существенной активации эритропоэза.

На прилагаемых таблицах и чертежах представлены результаты определения параметров красной крови, определяющих степень активации эритропоэза, после воздействия МГКП на фоне применения цитостатика - цисплатина и воздействия на животных ионизирующего излучения.

В таблице 1 представлено содержание эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов в периферической крови и клеточности кроветворных органов у крыс после введения им цитостатика в дозе 3 мг/кг веса дважды с суточным интервалом между инъекциями. После получения исходных данных популяцию крыс случайным образом разделяли на 4 экспериментальные группы. Группа №1 является контролем, 14 крыс этой группы получали в/в физиологический раствор в те же сроки и в том же объеме, в каком другим животным вводили в/в МГКП в дозах 10 или 250 мг/кг. МГКП вводили в первый раз в этот же день, что и цисплатин. На 6 и 12 и 20 сутки от начала введения цитостатика и МГКП производили повторный забор крови для анализа тех же показаний, что и в фоновых исследованиях, их динамику оценивали как для каждой крысы, так и по групповым средним. На 12 сутки у половины крыс из каждой группы определяется клеточность кроветворных органов. На 20 сутки производили последнее взятие крови, забой всех оставшихся животных и определение содержания миелокариоцитов в костном мозге голени и спленокариоцитов в селезенке.

При анализе предоставленных данных можно отметить, что, хотя в ряде случаев некоторые гематологические показатели вариабильны, основные тенденции при сравнении группы заключаются в том, что применение МГКП привело к сохранению количества ретикулоцитов на уровне, достоверно превышающем показатели группы цисплатин, причем у группы, которой вводили 10 мг/кг МГКП этот показатель достоверно выше, чем у контроля. Еще более отчетливо этот рост проявился на 12 сутки (разница в 3-4 раза), а также и на 20 сутки.

При сравнении клеточности кроветворных органов у животных всех подопытных групп на 12 и 20 сутки можно отметить увеличение массы селезенки и клеточности селезенки у группы крыс, которой вводили 10 мг/кг веса МГКП на 20 сутки по сравнению с группой цисплатин. Значимое увеличение количества миелокариоцитов в большеберцовой кости на 12 сутки обнаружено у животных, получавших вместе с цисплатином 10 мг/кг МГКП.

В результате анализа данных по критериям клеточности периферической крови и кроветворных органов можно заключить, что МГКП обладает гемостимулирующим действием, причем по эффекту доза препарата 10 мг/кг предпочтительнее.

На фиг.1 представлен график изменения содержания ретикулоцитов (% по отношению к биологическому контролю) в периферической крови крыс при применении МГКП сразу после γ-облучения в дозе 3,5 Гр. На фиг.2 представлен график изменения содержания ретикулоцитов (% по отношению к биологическому контролю) в периферической крови крыс при применении МГКП через сутки после γ-облучения в дозе 3,5 Гр. На фиг.3 представлена динамика изменения содержания молодых эритроцитов (относительно фонового, 100%-ного уровня) у облученных крыс без последующей инъекции МГКП (1) и при применении МГКП сразу (2) и через сутки (3) после облучения.

Работа выполнена на крысах Вистар, самках, массой 200-300 г.

Проведены две серии экспериментов: в первой серии экспериментов опытной группе животных вводили МГКП в дозе 10 мг/кг непосредственно после облучения. Во втором опыте введение МГКП осуществляли через сутки после воздействия радиации в дозе 3,5 Гр. Всего введение МГКП осуществляли трижды с интервалом 2 суток.

Контрольным группам облученных животных в аналогичные сроки вводили физ. раствор. Состояние системы крови оценивали через 3, 7 и 14 суток от начала опыта. Помимо количественных показателей определяли качественный состав эритроцитов методом кислотных эритрограмм.

Облучение животных привело к небольшому снижению числа эритроцитов крови и соответственно содержанию гемоглобина, и соответственно снижению содержания лейкоцитов в течение всего периода наблюдения. При этом введение МГКП практически никак не изменило картину крови. Однако динамика содержания ретикулоцитов в крови крыс, которым вводили МГКП, существенно изменилась (фиг.1 и 2).

На фигуре 1 представлена динамика изменения объема фракции молодых (сверхстойких к лизису) эритроцитов в крови крыс после облучения при разных схемах введения МГКП. При этом исходное (до облучения) содержание сверхстойких клеток (23,6±2,0%) было принято за 100% уровень, с которым и проводилось сопоставление определяемого показателя в разные сроки наблюдения. Приводимые результаты свидетельствуют, что при отсроченном применении препарат не вызывал дополнительного уменьшения объема фракции сверхстойких эритроцитов на третьи сутки после облучения, как это происходило в опытах с введением препарата сразу после облучения. Очевидно поэтому дальнейшее восстановление эритропоэза (к 7 и 14 суткам) у облученных крыс под влиянием препарата происходило энергичнее, чем у животных группы сравнения.

Таким образом, при гемосупрессии, вызываемой ионизирующей радиацией в дозе 3,5 Гр, модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин сохраняет гемостимулирующую активность, особенно при отсроченном на сутки после облучения начале введения препарата.

В табл.2 представлены результаты введения МГКП на формирование эндогенных селезеночных колоний.

Мышей (СВА×C57/6)F₁ самок облучали в дозах 5 или 6 Гр. Облученным мышам вводили в/в МГКП трижды с интервалом в сутки в однократной дозе 20 мг/кг в 0,25 мл физ. раствора. При этом животным одной опытной группе первое введение МГКП осуществляли через 1 час, а второй - через сутки после облучения. Мыши контрольных групп получали в/в 0,25 мл физ. раствора в те же сроки, что и животные первой опытной группы. Через 8 суток мышей умерщвляли, извлекали селезенки и подсчитывали число образовавшихся эндогенных колоний.

Введение мышам модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина через сутки после облучения в дозе 6 Гр приводит к статистически значимому увеличению выхода эндоколоний. Еще более эффективно воздействие МГКП после облучения в меньшей дозе (5 Гр), причем достоверный рост числа эндоколоний наблюдается не только при отсроченном на сутки после действия радиации первом введении препарата животным, но и при применении МГКП непосредственно после облучения. Модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин стимулирует у облученных мышей начальные этапы кроветворения. Так как колониеобразующие единицы селезенки формируют селезеночные колонии преимущественно эритроидного ряда (более 60%), в совокупности с полученными нами данными о способности МГКП вызывать у облученных крыс рост доли молодых эритроцитов и числа ретикулоцитов в периферической крови является свидетельством в пользу предположения, что модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин, стимулируя кроветворение, действует в основном на красный кроветворный росток.

Таблица 1Показатели системы крови у крыс после введения им МГКП в разных дозах и цисплатина (ЦП)ПоказательГруппаСроки исследования (сутки)Фон61220123456Эритроциты, 10¹²/лЦП+МГКП 10 мг/кг6.1±0.1 (24)7.1±0.1 (24)7.5±0.1 (24)7.2+0.3 (12)ЦП+МГКП 250 мг/кг6.1±0.1 (24)7.3±0.1 (24)7.6±0.1 (24)6.9±0.1 (12)Контроль ЦП6.1±0.1 (20)7.3±0.2 (20)7.2±0.1 (20)7.3±0.3 (10)Биол. контроль6.5±0.2 (14)7.1±0.2 (14)7.3±0.2 (14)8.1±0.3 (7)Содержание гемоглобина в 1 эритроците, г ·10^-12ЦП+МГКП, 10 мг/кг28.7 (24)24.2 (24)25.4±0.5*° (24)25,0±0,8 (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг28.4 (24)24.1 (24)24.0±0.3° (24)25,2±0,4 (12)*Контроль ЦП27.0 (20)25.6 (20)22.4±0.4 (20)25,1±0,9 (10)Биол. контроль.27.3 (14)25.3 (14)23.1±0.6 (14)22,6±0,6 (7)Гемоглобин, г/лЦП+МГКП, 10 мг/кг175±3 (24)171±2 (24)189±3*° (24)177±3 (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг174±2 (24)175±2 (24)183±3*° (24)174±3 (12)Контроль ЦП164±3* (20)189±4 (20)167±2 (20)181±5 (10)Биол. контроль.177±3 (14)180±3 (14)168+2 (14)182+3 (7)Ретикулоциты, 10⁹/лЦП+МГКП, 10 мг/кг98±7 (24)70±5*° (24)87±11*° (24)136+15* (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг111±7 (24)68±6° (24)64±9*°⁽²⁴⁾114±8*(12) Контроль ЦП116±11 (20)28±3* (20)18±2 (20)82+17 (10) Биол. контроль.86±14 (14)82±5 (14)87±3 (14)102±13 (7)Лейкоциты, 10⁹/лЦП+МГКП, 10 мг/кг13.2+0.7 (24)16.4±0.8 (24)18.7±1.1 (24)20.4±1.5 (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг14.3±0.7 (24)16.6±1.0 (24)18.7±0.7 (23)17.6+0.6 (12)Контроль ЦП13.4+1.0 (20)16.1±1.2 (20)18.8±1.8 (20)23.5±3.4 (10)Биол. контроль.16.2±1.5 (14)24.3±2.4 (14)27.1±2.8 (14)19.6±1.1 (7)Нейтрофилы, 10⁹/лЦП+МГКП, 10 мг/кг2.7+0.1 (24)4.1±0.2 (24)3.3±0.2 (24)3.7±0.3 (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг2.9±0.2 (24)4.4±0.4 (24)3.5+0.2 (23)3.8±0.2 (12)Контроль ЦП2.9+0.2 (20)4.1±0.4 (20)3.1±0.4 (20)3.7±0.5 (10)Биол. контроль.3.9±0.4 (14)4.9+0.6 (14)3.0+0.4 (14)2.7+0.2 (7)Масса селезенки, гЦП+МГКП, 10 мг/кг  1.88±0.16* (12)2.07±0.10*° (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг  1.61±0.13 (12)1.80±0.13 (12)Контроль ЦП  1.50±0.15 (10)1.46±0.12 (9)Биол. контроль.  1.36+0.07 (7)1.66±0.07 (7)Спленоциты, 10⁹/ селезенкуЦП+МГКП, 10 мг/кг  1.46±0.16 (12)1.67+0.08° (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг  1.36+0.11 (12)1.49±0.07 (12)Контроль ЦП  1.48±0.10 (10)1.39±0.08 (9)Биол. контроль.  1.46±0.20 (7)1.57+0.13 (7)Миелокариоциты, 10⁶/ костьЦП+МГКП, 10 мг/кг  74.2±4.4* (12)69.6±3.9 (12)ЦП+МГКП, 250 мг/кг  63.7±3.1 (12)69.5±3.4 (12)Контроль ЦП  61.2±3.0 (10)66.6±4.9 (10) Биол. контроль.  61.6±3.4 (7)70.4±5.3 (7)Примечание: в скобках указано количество животных, * - достоверные различия с контролем (Р<0.05); ° - достоверные различия с группой «цисплатин» (Р<0.05).

Влияния МГКП на стволовые кроветворные клетки

Таблица 2Среднее количество эндогенных селезеночных колоний (М±m)Первое введение МГКПДоза облучения, Гр56Через 1 час8,5±0,9*2,7±0,6Через 24 часа11,4±1,7*3,3±0,5*Контроль (физраствор)4,2±0,51,7±0,3* - статистически значимые различия с контролем

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается нового агента защиты клеток крови от воздействия цитостатиков или ионизирующих излучений в процессе терапии онкологических заболеваний. Агент характеризуется тем, что включает модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин. Изобретение также относится к фармакологической комбинации, включающей в свой состав модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин и цитостатик, при этом компоненты комбинации предназначены для раздельного или последовательного введения пациенту. Соотношение модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина и цитостатика составляет от 1:3 до 1:50. Заявленная комбинация позволяет снизить наносимый цитостатиком урон кроветворной системе и улучшает параметры кроветворения в организме пациента. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

1. Применение модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина в качестве агента защиты клеток крови и восстановления кроветворной системы для лечения онкологических больных, которым назначена химиотерапия цитостатиком или лучевая терапия ионизирующим излучением.2. Применение по п.1, в котором внутривенно вводят модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин после химиотерапии цитостатиком или после облучения пораженного органа ионизирующим излучением.3. Применение по п.2, в котором первое введение модифицированного глютаминовой кислотой полигемоглобина осуществляют в сроки, не превышающие 2 суток после введения цитостатика.4. Фармакологическая комбинация для лечения онкологических больных в виде набора, характеризующаяся тем, что она содержит в терапевтически эффективных количествах цитостатик и модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин, предназначенные для раздельного или последовательного введения.5. Комбинация по п.1, характеризующаяся тем, что содержит модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин из расчета от 10 до 1000 мг на 1 кг массы пациента.6. Комбинация по п.4 или 5, характеризующаяся тем, что она содержит цитостатик и модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин при их весовом соотношении 1:3-1:50.