ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩИХ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И E.COLI В ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦАХ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для селективного обогащения Escherichia coli и других колиформных микроорганизмов, а также для ускоренного одновременного определения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемой пробе воды, в образцах пищевых продуктов продовольственного сырья, смывов с объектов внешней среды.

Ведущими зарубежными фирмами ООО «ГЕМ», MERCK выпускаются сухие флюорогенные питательные бульоны для колиформных бактерий и Е. coli на основе казеинового пептона с использованием бычьей желчи.

Наиболее близкой по назначению к предлагаемой среде является Fluorocult Brilliant Green 2% Bile (BRILA) Broth, выпускаемый фирмой MERCK (каталог Микробиология 2004/05, стр.401), состоящий из следующих компонентов, г/л:

Pepton 10.0 Lactose 10.0 Ox bile, dried 20.0 Brillant green 0.0133 L-tryptophan 1.0 4-Methylumbelliferyl β-D-glucuronide 0.1

Недостатком этой среды является слабо выраженное свечение (в основном на поверхности среды) в УФ-свете (366 нм).

Задачей изобретения является создание питательной среды, позволяющей исключить вариабельность интерпретации результатов при визуальном наблюдении.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей источник азота - панкреатический гидролизат желатина (ПГЖ) производства ФГУН ГНЦ ПМБ; в качестве ингибиторов роста грам+ микрофлоры - желчь крупного рогатого скота (с содержанием желчных кислот не менее 40%) и бриллиантовый зеленый; в качестве углеводного компонента - лактозу, а также 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) и триптофан при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

Панкреатический гидролизат желатина 10.0±4.0 Лактоза 10.0±3.0 Желчь очищенная 20.0±4.0 Бриллиантовый зеленый 0.0133±0.0033 L-триптофан 1.0±0.3 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) 0.1±0.02

Отличие предлагаемой питательной среды от среды Fluorocul BRILA Broth фирмы MERCK заключается в том, что впервые используют панкреатический гидролизат желатина в качестве белковой основы во флюорогенной среде для быстрого и достоверного обнаружения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемых образцах.

Фермент β-глюкуронидаза Е. coli расщепляет флюорогенный субстрат (MUG) с образованием флюоресцирующего (при воздействии УФ-света) продукта. Триптофан дает возможность проведения индольного теста для окончательного подтверждения и Е. coli.

Панкреатический гидролизат желатина производства ГНЦ ПМБ имеет следующие физико-химические показатели: общий азот 13,5-15,5%; аминный азот 2,5-3,7%; потери при высушивании (105°С, 4 ч) менее 6%; рН (5%-ный раствор) 6,5-7,5; степень расщепления белка 20-30%.

Получение гидролизата желатина включает в себя несколько основных стадий:

- настаивание желатина в холодной воде для набухания в течение 1 ч (гидромодуль 1:10), кипячение и охлаждение до 50°С;

- внесение панкреатина или поджелудочной железы (5% или 40% соответственно от веса желатина);

- подщелачивание раствором едкого натра до рН 8,0-8,2 (в течение всего процесса гидролиза);

- гидролиз при температуре 48-50°С в течение 6 ч;

- осветление гидролизата в кислой зоне (кипячение в течение 10 мин при рН 4,5);

- фильтрация;

- осветление гидролизата в щелочной зоне (кипячение в течение 10 мин при рН 8,0);

- фильтрация;

- высушивание.

Предлагаемый состав питательной среды обеспечивает повышенный уровень интенсивности роста колиформных бактерий и Е. coli, обладает, как видно на чертеже, более выраженной голубой флюоресценцией при ультрафиолетовом облучении микробного роста во всем исследуемом объеме, чем среда - прототип, а также позволяет получить сухую, стандартную среду для ускоренного их определения, сводящую до минимума перестройку производственного процесса.

Питательную среду готовят следующим образом.

Пример 1. Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат желатина 6.0 Лактоза 7.0 Желчь очищенная 16.0 Бриллиантовый зеленый 0.01 L-Триптофан 0.7 4-Метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) 0.08

Навески тщательно суспендируют в 1 л дистиллированной воды, хорошо перемешивают и разливают в пробирки. Стерилизуют автоклавированием при температуре 115°С в течение 15 мин.

Для биологического контроля предлагаемой питательной среды используют культуры Е. coli АТСС 25922, Е. coli 675, Е. coli Ewing (O₁₂₄K₇₂) 227, С. freundii 101/57, Е. aerogenes 10006 из разведения 10^-8, S. aureus Wood-46 и Е. faecalis 775 - из разведения 10^-5 музейных штаммов. Все посевы инкубируют аэробно при температуре 37±1°С в течение 18 ч. Учет результатов проводят визуально по помутнению, образованию газа, голубой флюоресценции среды в УФ-свете (366 нм) и индолообразованию.

Через 18 ч культивирования в результате роста тест-штаммов Е. coli АТСС 25922, Е. coli 675, Е. coli Ewing (O₁₂₄K₇₂) 227, C. freundii 101/57, Е. aerogenes 10006 было отмечено помутнение среды и газообразование. Степень интенсивности голубой флюоресценции, характерной для Е. coli, при ультрафиолетовом облучении микробного роста ярче выражена на предлагаемой питательной среде, чем на среде Fluorocult BRILA Broth. После внесения во флюоресцирующую среду реактива Ковача (индольный тест) наблюдается образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости, что указывает на индолообразование и подтверждает наличие E.coli.

Полученные результаты представлены в таблице.

Пример 2. Для приготовления питательной среды компоненты берут в следующем количественном соотношении, г/л:

Панкреатический гидролизат желатина 10.0 Лактоза 10.0 Желчь очищенная 20.0 Бриллиантовый зеленый 0.0133 L-Триптофан 1.0 4-Метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) 0.1

Готовят среду в соответствии с примером 1. На предлагаемой среде проверяют ростовые свойства тест-культур, как в примере 1. Результаты проверки аналогичны примеру 1.

Пример 3. Питательную среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующем количественном соотношении, г/л:

Панкреатический гидролизат желатина 14.0 Лактоза 13.0 Желчь очищенная 24.0 Бриллиантовый зеленый 0.0166 L-Триптофан 1.3 4-Метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) 0.12

Ростовые свойства тест-штаммов на предлагаемой среде идентичны результатам проверки по примеру 1.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда чувствительна, обладает хорошими ростовыми свойствами, подавляет рост стафилококка и энтерококка. Кроме того, среда обладает более выраженной голубой флюоресценцией при ультрафиолетовом облучении микробного роста во всем исследуемом объеме, чем среда-прототип.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая среда имеет ряд преимуществ:

- при визуальном наблюдении исключается ложная интерпретация результатов; ярко выраженная голубая флюоресценция при ультрафиолетовом облучении микробного роста во всем исследуемом объеме;

- использование высокочувствительной и специфичной среды позволяет одновременно определять колиформные бактерии и Е. coli и сокращает время исследования до 18 ч;

- не меняются стереотипы работы диагностических лабораторий практического здравоохранения;

- повышается уровень доказательной медицины.

Питательная среда содержит в г/л дистиллированной воды: панкреатический гидролизат желатина 10,0±4,0, лактозу 10,0±3,0, желчь очищенную 20,0±4,0, бриллиантовый зеленый 0,0133±0,0033, L-триптофан 1,0±0,3, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) 0,1±0,02. Это исключает ложную интерпретацию результатов при визуальном наблюдении, позволяет одновременно определять колиформные бактерии и E.coli и сокращает время исследования до 18 ч. 1 ил., 1 табл.

Питательная среда для определения общих колиформных бактерий и E.coli в исследуемых образцах, содержащая источник азота, лактозу, желчь очищенную, бриллиантовый зеленый, L-триптофан, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве источника азота она содержит панкреатический гидролизат желатина при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:
панкреатический гидролизат желатина 10,0±4,0 лактоза 10,0±3,0 желчь очищенная 20,0±4,0 бриллиантовый зеленый 0,0133±0,0033 L-триптофан 1,0±0,3 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид (MUG) 0,1±0,02