СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА Российский патент 2014 года по МПК A61N5/06 A61M1/36 A61K31/353 A61K38/19 A61P37/06 A61B17/03 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии. Данный способ может быть использован в трансплантологических центрах при трансплантации почки.

Трансплантация почки является единственным радикальным методом лечения хронической почечной недостаточности в терминальной стадии. При этом количество больных, ожидающих трансплантацию почки, ежегодно увеличивается. Реакция отторжения, как острая, так и хроническая ее формы, является одной из основных причин утраты трансплантата. При развитии острого отторжения несмотря на все достижения в иммуносупрессивной терапии значительно ухудшается прогноз выживаемости трансплантата и сокращается срок его функционирования на всех сроках послеоперационного периода. Именно поэтому особенно актуальна профилактика ее развития.

Действие современных иммуносупрессивных препаратов направлено на снижение активности иммунологического конфликта между трансплантатом и организмом хозяина. Однако тотальное угнетение иммунной системы не вызывает иммунологической толерантности по отношению к трансплантату. Более того, иммуносупрессивные препараты способствуют ингибированию регуляторных механизмов, играющих важную роль в поддержании иммунологической толерантности и естественных факторов иммуносупрессии.

В связи с этим стратегии, направленные на разработку новых альтернативных, адьювантных методов лечения, способствующие сведению к минимуму повреждений донорского органа на фоне снижения общей иммуносупрессии и индукции иммунологической толерантности, являются одним из важнейших и перспективных направлений исследований, способных решить многие проблемы, возникающие в посттрансплантационном периоде.

Известен способ профилактики и лечения отторжения трансплантата почки, включающий проведение плазмафереза и внутривенное введение иммуноглобулина (Bartel G., Schwaiger E., Bohmig G.A. Prevention and treatment of alloantibody-mediated kidney transplant rejection. 2011. Transpl. Int. Vol.24, №4. P. 1142-1155).

Недостатком этого способа является то, что при подобном подходе происходит лишь десенсибилизация пациента, при этом не происходит индукции толерантности к аллоантигенам, в связи с чем сохраняется высокий риск рецидива отторжения.

Наиболее близким является способ профилактики и лечения отторжения почечного трансплантата, включающий проведение экстракорпорального фотофереза путем введения после операции фотосенсибилизатора, выделение концентрата мононуклеарных клеток, разведение его физраствором с последующим ультрафиолетовым облучением полученной суспензии, возвращение ее в кровеносное русло (Kusztal M., Klak R., Krajewska M. et al. Application of extracorporeal photopheresis in kidney transplant recipients: technical considerations and procedure tolerance. Transplant Proc. 2011. Vol.43, №8. P. 2941-2942.).

Недостатком этого способа является недостаточно высокая эффективность, поскольку в результате инкубации без ростового фактора моноциты трансформируются в незрелые дендритные клетки, которые характеризуются относительно низкой миграционной активностью и после реинфузии в условиях дефицита ростовых факторов могут обратно трансформироваться в клетки с фенотипом моноцитов, утрачивая способность к индукции специфической толерантности к аллоантигенам трансплантата. Помимо этого отмечается низкая степень дифференцировки в дендритные клетки.

Помимо этого, время, в течение которого проводится процедура, составляет 2-3 часа, а период инкубации облученных ультрафиолетом клеток отсутствует, вследствие чего очень малая доля моноцитарных клеток трансформируется в дендритные.

Также авторы не регламентируют срок послеоперационного периода, когда следует проводить первый сеанс фотофереза для наиболее эффективной профилактики острого отторжения, что, с одной стороны, при позднем начале лечения повышает риск развития острого отторжения вследствие возникновения выраженного активного иммунологического конфликта, а с другой стороны, при слишком раннем начале лечения может проявляться неэффективностью лечения вследствие того, что недостаточное количество донорских аллоантигенов вступили в контакт с иммунными клетками реципиента.

Авторы рекомендуют проводить от 12-16 сеансов фотофереза в течение 3 месяцев, ориентируясь на скорость клубочковой фильтрации, при достижении которой 60 мл в минуту принимают решение о прекращении процедуры. При этом скорость клубочковой фильтрации является лишь косвенным критерием активности иммунологического конфликта между реципиентом и трансплантатом и недостаточно информативно отражает реальную картину в связи с тем, что этот показатель находится в зависимости от множества других неиммунологических факторов: ишемического и реперфузионного повреждения трансплантата, исходного состояния органа, наличия или отсутствия у реципиента инфекционных осложнения и др. Помимо этого, проведение даже интенсивного курса фотофереза на протяжении трех месяцев может быть недостаточным для формирования толерантности реципиента к аллоантигенам трансплантата.

Задачей предложенного способа является устранение указанных недостатков, повышение эффективности профилактики и лечения развития острого отторжения, увеличение срока функционирования почечного трансплантата за счет повышения толерогенных свойств полученных дендритных клеток в результате трансляционной клеточной терапии.

Указанная задача достигается путем проведения сеансов фотофереза по предложенной методике путем введения после операции фотосенсибилизатора, выделения концентрата мононуклеарных клеток, разведения его физраствором с последующим ультрафиолетвым облучением полученной суспензии, возвращение ее в кровеносное русло. Новым является то, что первый сеанс фотофереза проводят через 3-4 дня после трансплантации, когда в плазме крови реципиента уже присутствует достаточное количество донорских аллоантигенов. Сразу после ультрафиолетового (УФ) облучения суспензии проводят замещение физраствора плазмой крови в том же объеме, а затем осуществляют введение в полученную смесь цитокина - гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор в дозе 80-120 нг/мл. Полученный состав инкубируют в течение 90-120 минут, после чего замещают плазму физраствором в том же объеме с целью удаления цитокина и предотвращения его системного воздействия на реципиента, после чего полученная суспензия возвращается в кровеносное русло. Всего на курс проводят 15 таких сеансов, причем в первые две недели - по два раза в неделю, последующие шесть недель по одному сеансу в неделю, в течение третьего месяца два сеанса, четвертый, пятый и шестой месяц - по одному сеансу в месяц.

В результате применения предложенного метода достигается выраженная иммунологическая специфическая толерантность к аллоантигенам трансплантата, в результате чего значительно снижается активность реакции отторжения, риск развития нефротоксичности ингибиторов кальциневрина вследствие возможности безопасного снижения их дозы, повышается выживаемость трансплантата и срок его функционирования.

Способ осуществляется следующим образом.

На 3-4 сутки после аллотрансплантации почки пациент перорально принимает фотосенсибилизатор, например аммифурин, в дозе 0,6 мг/кг массы тела. Через два часа после этого проводят сеанс фотофереза, который заключается в следующем: выделяют концентрат мононуклеарных клеток. За одну процедуру выделяют от 40 до 100 мл концентрата мононуклеарных клеток. Данный концентрат ресуспендируют в 0,9% растворе NaСl, доводя общий объем до 200 мл. Клеточную суспензию подвергают УФ воздействию при длине волны 380-420 нм. Общая доза экспозиции 0,8-1,2 Дж/см². Затем 0,9% раствор хлорида натрия заменяют равнозначным объемом плазмы крови этого же больного. После этого добавляют в полученную смесь цитокин - гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор (молграмостим) в дозе 80-120 нг/мл. Полученный состав инкубируют при температуре 37 С° в течение 90-120 минут. После этого плазму крови вместе с цитокинами удаляют, клетки повторно разводят физиологическим раствором до 200 мл и реинфузируют пациенту в течение 30 мин.

Последующие сеансы проводят: в первые две недели - два раза в неделю, последующие 6 недель - 1 раз в неделю. Третий месяц - 2 сеанса в месяц. Четвертый, пятый и шестой месяц - по 1 процедуре в месяц. Итого, каждый больной за шесть месяцев получает 15 процедур трансляционной клеточной терапии.

Первый сеанс фотофереза наиболее эффективно проводить на 3-4 сутки, поскольку по прошествии этого времени наблюдается улучшение нарушенной в результате ишемического и реперфузионого повреждения микроциркуляции и происходит достаточное насыщение иммунных клеток реципиента аллоантигенами донора.

Замещение физраствора плазмой крови реципиента, с одной стороны, позволяет наилучшим образом сохранить клетки крови для их последующей реинфузии, а с другой стороны, плазма реципиента, богатая аллопептидами донорского происхождения, позволяет адекватно насытить дендритные клетки в процессе их трансформации из моноцитов и созревания донорскими антигенами.

При инкубации без цитокинов - ростовых факторов, экспрессия молекулы CD14 сохраняется на 90% клеток, что может свидетельствовать о сохранении моноцитарного фенотипа и слабой степени дифференцировки в дендритные клетки. Инкубации моноцитов с ростовыми факторами позволяет резко снизить экспрессию CD14 - эту молекулу экспрессируют порядка 5% клеток. Помимо этого возрастает экспрессия молекул CD80, CD83 и CD86, что свидетельствует об активной трансформации моноцитов в дендритные клетки. При этом наиболее целесообразна стимуляция трансформации моноцитов в дендритные клетки гранулоцит-макрофагальным колониестимулирующим фактором - мощным ростовым фактором, поскольку последний значительно повышает активность дифференцировки клеток и эффективно предотвращает их апоптоз.

Инкубация в течение 90-120 минут является необходимой для трансформации моноцитов в ранние дендритные клетки и насыщения их аллоантигенами в присутствии ростового.

Для того чтобы гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор не попал в системный кровоток реципиента и не оказал негативного системного влияния на течение послеоперационного периода, плазму вместе с этим цитокином после инкубации удаляют и замещают таким же объемом физраствора, получая равнозначный объем суспензии.

Предложенный режим проведения сеансов фотофереза является наиболее оптимальным, поскольку уряжающиеся сеансы на протяжении шести месяцев позволяют устойчиво сформировать клон толерогенных дендритных клеток без негативных явлений, таких как инфекционные осложнения или аллергические реакции.

Пример 1.

Больная А., 42 года, поступила для трансплантации почки в связи с развитием терминальной стадии хронической почечной недостаточности вследствие поликистоза почек. Операция выполнена по стандартной методике. В послеоперационном периоде проводилась стандартная трехкомпонентная иммуносупрессия, включающая циклоспорин А, преднизолон, микофенолата мофетил, индукционная терапия включала анти-СD25 антитела и метилпреднизолон.

На четвертый день после аллотрансплантации почки с целью профилактики развития отторжения трансплантата однократно перорально назначен аммифурин в дозе 54 мг. Через два часа после этого проведен первый сеанс фотофереза. Путем дискретного гравитационного цитоплазмафереза получено 30 мл концентрата мононуклеарных клеток, который разведен в 150 мл в 0,9% раствора хлористого натрия. Данную суспензию подвергли ультрафиолетовому облучению в проточном режиме при длине волны 400 нм и общей дозе экспозиции 1,0 Дж/см², после чего физраствор удалили и заменили его 150 мл плазмы крови с добавлением в данную смесь рекомбинантного препарата цитокина: гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора 18 мкг. Полученный состав инкубировали при температуре 37 C° в течение 100 минут. После этого плазма крови с цитокином была удалена, а клеточный концентрат повторно разведен 150 мл физиологического раствора и суспензия была реинфузирована пациентке.

Всего у данной больной выполнено 15 процедур по схеме предлагаемого способа.

Пациентка была выписана из стационара на 33-е сутки. В течение 1,5 лет наблюдения клинических, лабораторных или морфологических признаков отторжения у пациентки не отмечено.

Пример 2.

Больной Г., 44 года, поступил в хирургическое отделение трансплантологии и диализа с диагнозом хронический гломерулонефрит, терминальная стадия хронической почечной недостаточности, состояние на перитонеальном диализе для трансплантации донорской почки. Выполнена типичная трансплантация трупной донорской почки. Больному назначена стандартная трехкомпонентная иммуносупрессия, включающая такролимус, преднизолон, микофенолата мофетил, а также индукция иммуносупрессии - анти-СD25 антителами и метилпреднизолоном.

Несмотря на проводимую иммуносупрессию у больного в послеоперационном периоде развилась реакция отторжения, которая выражалась в повышении сывороточных концентраций креатинина и мочевины, а также нарушении внутриорганной гемодинамики трансплантата. С целью лечения острого отторжения больному однократно перорально назначен оксаролен-ультра в дозе 53 мг. Через два часа после этого провели первый сеанс фотофереза. Провели дискретный гравитационный цитоплазмаферез с сепарацией 80 концентрата мононуклеарных клеток, который ресуспендировали в 120 мл физраствора, и полученную суспензию подвергли ультрафиолетовому воздействию при длине волны 400 нм и общей дозе экспозиции 1,1 Дж/см². После этого физраствор удалили и заместили его 120 мл плазмы крови. В полученную смесь добавили рекомбинантный гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор 20 мкг и состав инкубировали при температуре 37 C° в течение 95 минут. После этого плазму с цитокинами удалили, а клеточный концентрат развели физиологическим раствором до 200 мл и реинфузировали пациенту. По описанному методу больному проведено в общей сложности 15 сеансов плазмафереза.

Пациент был выписан из стационара на 38-е сутки. За 2,2 года наблюдения клинических и лабораторных признаков рецидива отторжения у пациента не зафиксировано. При протокольных морфологических исследованиях пункционных биоптатов, полученных на 60 и 180 сутки после трансплантации, признаков отторжения нет.

Способ апробирован в отделе трансплантологии, нефрологии и хирургической гемокоррекции ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Предлагаемый метод применен у 15 реципиентов почечного трансплантата. Установлено, что среди пациентов, у которых применен данный метод, значительно реже регистрировались эпизоды острого отторжения, отмечалась значительно более высокая скорость клубочковой фильтрации через полгода через трансплантации, а на протокольных биоптатах крайне редко регистрировались изменения, свойственные хроническому отторжению, чем у больных, не получавших сеансы фотофереза. Полученные хорошие результаты, а также высокая безопасность позволяют рекомендовать его для широкого применения.

В результате применения предложенного метода удалось значительно снизить частоту эпизодов острого отторжения трансплантата, значительно улучшить функцию трансплантата, повысить его выживаемость и срок функционирования.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для профилактики и лечения отторжения почечного трансплантата. Для этого проводят экстракорпоральный фотоферез путем введения фотосенсибиллизатора, выделение концентрата мононуклеарных клеток, разведения его физраствором с последующим ультрафиолетовым облучением полученной суспензии. Дополнительно сразу после ультрафиолетового облучения проводят замещение физраствора плазмой крови в том же объеме. Затем вводят в полученную смесь цитокин - гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор в дозе 80-120 нг/мл. После этого инкубируют полученный состав в течение 90-120 минут. Потом замещают плазму с цитокином физраствором в том же объёме с последующим возвращением полученной суспензии в кровеносное русло. При этом первый сеанс фотофереза проводят на 3-4 сутки после трансплантации почки. Причём первые две недели проводят два сеанса в неделю. Последующие шесть недель осуществляют по одному сеансу в неделю. В течение третьего месяца - два сеанса. Четвертый, пятый и шестой месяцы - по одному сеансу в месяц. Курс составляет 15 сеансов. Способ позволяет значительно снизить частоту эпизодов острого отторжения почечного трансплантата за счет улучшения функции трансплантата, повысить его выживаемость и срок функционирования за счет достижения выраженной иммунологической специфической толерантности к аллоантигенам трансплантата, а именно в результате повышения толерогенных свойств полученных дендритных клеток в результате проводимой трансляционной клеточной терапии. 2 пр.

Способ профилактики и лечения отторжения почечного трансплантата, включающий проведение экстракорпорального фотофереза путем введения после операции фотосенсибилизатора, выделение концентрата мононуклеарных клеток, разведение его физраствором с последующим ультрафиолетовым облучением полученной суспензии, возвращение ее в кровеносное русло, отличающийся тем, что первый сеанс фотофереза проводят на 3-4 сутки после трансплантации почки, при этом дополнительно сразу после ультрафиолетового облучения проводят замещение физраствора плазмой крови в том же объеме, а затем осуществляют введение в смесь цитокина - гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора в дозе 80-120 нг/мл, затем осуществляют инкубацию полученного состава в течение 90-120 минут, замещают плазму с цитокином физраствором в том же объеме с последующим возвращением полученной суспензии в кровеносное русло, на курс 15 сеансов, причем в первые две недели проводят два сеанса в неделю, последующие шесть недель по одному сеансу в неделю, в течение третьего месяца два сеанса, четвертый, пятый и шестой месяц - по одному сеансу в месяц.