ШТАММ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1-ГО ТИПА ИВ741 СУБТИПА АЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.

ВИЧ-инфекция является одним из самых опасных и широко распространенных инфекционных заболеваний. Глобальное распространение, принявшее характер мировой эпидемии, сделало проблему ВИЧ-инфекции центральной проблемой мирового здравоохранения. Возникла необходимость в создании универсальной вакцины. В настоящее время проводятся испытания вакцинных препаратов, созданных на основе изолятов ВИЧ-1, относящихся к субтипу Е, доминирующему в Азии и на Африканском континенте [1, 2]. Помимо субтипа Е существует еще рекомбинантная форма ВИЧ - CRF01_AE. Впервые данная рекомбинантная форма была выделена на территории Юго-Восточной Азии [3, 4]. На территории нашей страны данная форма встречается редко - менее 1%, но учитывая высокую дивергентность ВИЧ, целесообразно для разработки диагностических и вакцинных препаратов использовать штамм субтипа CRF01_AE, циркулирующий на территории Российской Федерации [5, 6].

Задача изобретения - получение штамма вируса иммунодефицита человека, принадлежащего к субтипу АЕ, циркулирующему в настоящее время на территории РФ.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в использовании его для изучения антивирусного действия химиопрепаратов нового поколения и для создания вакцины.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ741 субтипа АЕ для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1186 от 01.07.11 и имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1, хранится в коллекции вирусов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови больного СПИД, не получавшего антиретровирусную терапию. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов больного с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.

Репродукция.

Штамм ВИЧ-1 ИВ741 обладает высокой репродуктивной активностью и реплицируется в лимфоцитах периферической крови, лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и Jurkat. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием и синицитеобразованием. Штамм может поддерживаться длительное время при пассировании на клеточных линиях. Через 5-6 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1000 об/мин вносится к свежим неинфицированным клеткам, в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур в сравнении со штаммом-аналогом ВИЧ-1 LAV, который является первым изолятом ВИЧ-1, выделенным от больного СПИД [7]. Продуктивная активность штамма составляет 5,0-6,0 lg ТЦД50 (таблица 1).

Антигенные свойства.

ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, род Lentivirus. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.

Иммунофлюоресценция. Исследование методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИД, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 55-60% инфицированных клеток.

Иммуноблот. Исследование в иммуноблоте показало, что вирус обладает антигенными детерминантами, характерными для ВИЧ-1: 120/160, 65, 55, 41, 31, 24, 17 кД (таблица 2).

Субтипирование. Генетический анализ области, кодируемой геном pol, проведенный с помощью субтипспецифических праймеров (CCAAAGGTTAAACAATGG, TTAGATTCTTAAATGGCTCC) подходящих для изучения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России, показал, что данный штамм вируса относится к субтипу АЕ.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ741 по цитопатическому действию.

Исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 и Jurkat в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). Клетки инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Далее, инкубировали культуры клеток при 37С° в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим на 6-7 сутки. За титр вируса принимали величину, обратную его максимальному разведению, вызывающему как минимум двухкратное превышение показателя гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Сравнительный анализ показал, что инфекционные титры штамма ИВ741 сопоставимы с инфекционным титром штамма-аналога LAV, что свидетельствует об их сходной активности. Данный инфекционный титр позволяет успешно инфицировать лимфобластоидные клеточные культуры, с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Пример 2. Диагностика антител к ВИЧ-1 методом иммуноблота.

Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 10 сыворотками, полученными от ВИЧ-инфицированных лиц и содержащих анти-ВИЧ антитела. Сыворотки были предварительно охарактеризованы в коммерческой тест-системе фирмы «Биорад» (США). В качестве антигена использован штамм ИВ741 и штамм-аналог LAV. Выявление антител к ВИЧ-1 проводили с помощью нитроцеллюлозных стрипованных мембран (стрип), с нанесенными на них антигенами ВИЧ-1, фирмы «Биорад» (США). Готовую стрипованную мембрану предварительно замачивали на 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т). Сыворотку крови в количестве 20 мкл разводили в 1 мл ФСБ-Т, содержащего 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин) и вносили в лунку со стрипом. После инкубации в течение 1 час при комнатной температуре и отмывки ФСБ-Т вносили конъюгат, разведенный в 1 мл ФСБ-Т. Далее снова проводили инкубацию в течение 1 час при комнатной температуре и после отмывки ФСБ-Т вносили 1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ). Затем инкубировали в темноте до появления четких полос в контрольном стрипе. Реакцию останавливали 1 н. серной кислотой. После промывки стрипа дистиллированной водой его высушивали при комнатной температуре и визуально проводили учет результатов.

Результаты исследований представлены в таблице 2. В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ИВ741 позволяет выявлять антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и, следовательно, может быть использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1, а также для изучения противовирусного действия химиопрепаратов и создания вакцины против ВИЧ.

Пример 3. Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ741 по уровню антигена вируса (р24).

Определение уровня вирусного антигена в вируссодержащей жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа, с использованием коммерческого иммуноферментного набора фирмы Биорад (США) на 96-луночных панелях. В лунки, в которые предварительно был внесены исследуемые образцы, добавляли конъюгат, содержащий биотилинированные поликлональные антитела к р24 ВИЧ-1. После инкубации в течение 1 часа при 37°С панель отмывали трис-солевым буфером и вносили стрептавидин-пероксидазный конъюгат. Проводили инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали панель трис-солевым буфером и затем для визуализации реакции добавляли тетраметилбензидин (ТМБ). После инкубации в течение 30 минут в темноте, при комнатной температуре в лунки для остановки реакции вносили 1 н. серную кислоту. Результаты учитывали с помощью фотометра "Multiscan" при длине волны 630 нм. За положительный контроль принимали не менее чем 3-кратное превышение оптической плотности по сравнению с таковым показателем неинфицированной клеточной линии.

Результаты исследований представлены в Таблице 3. В результате проведенных исследований установлено, что штамм ИВ 741 не уступает по уровню выработки антигена ВИЧ-1, штамму-аналогу LAV и обладает высокой репродуктивной активностью, что позволяет успешно инфицировать им лимфобластоидные клеточные культуры, с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.

Таблица 1 Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ741 на модели клеток МТ-4 и Jurkat Титр, Ig ТЦД50 Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток МТ-4) Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток Jurkat) LAV ИВ741 LAV ИВ741 6,0 6,0 6,0 5,0

Таблица 2 Исследование штамма ИВ741 методом иммуноблота Вирусный антиген Выявленные антитела Контроль (LAV) 160 120 65 55 53 41 31 24 17 ИВ741 160 120 65 55 53 41 31 24 17

Таблица 3 Сравнительный анализ инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ741 по уровню антигена вируса (р24) Контроль клеток Штаммы ВИЧ-1 Контроль (LAV) ИВ741 0,132* 2,862 2, 965 * оптическая плотность

Источники информации

1. Spira S., Wainberg M.A., Loemba H. et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance // J. Antimicrob. Chem. - 2003. - V.51. - P.229-240.

2. Kathy Stover. "In Thailand Clinical Study, HIV Vaccine Regimen Demonstrates Modest Preventive Effect." Medical News Today. MediLexicon, Intl., 25 Sep. 2009. Web. 22 Jun. 2012. http://www.medicalnewstoday.com/releases/165277.php.

3. Gao F., Robertson D.L., Morrison S.G. et al. The heterosexual human immunodeficiency virus type 1 epidemic in Thailand is caused by an intersubtype (A/E) recombinant of African origin// J. Virol. - 1996. - V.70. - P.7013-7029.

4. McCutchan F.E., Hegerich P.A., Brennan T.P. et al. Genetic variants of HIV-1 in Thailand// AIDS Res. Hum. Retroviruses. - 1992. - V.8. - P.1887-1895.

5. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. Genetic heterogeneity of HIV type 1 in Russia: identification of H variants and relationship with epidemiological data. AIDS 1996; 12:1687-1690.

6. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. HIV type 1 subtype E in Russia. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1997; 13:725-727.

7. Barre-Sinoussi F., Mugeyre M., Dauguet C. Isolation of a T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for AIDS // Science. - 1983. - Vol.220. - P.868-871.

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-типа ИВ741 выделен на территории РФ от больного не получавшего АРВ-терапию. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ НИИ им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России, номер депонента №1186. Принадлежит к варианту ВИЧ субтипа АЕ. Обладает стабильной репродуктивной активностью. Инфекционный титр составляет 5-6 lg ТЦД 50. Полученный штамм является удобной природной моделью для изучения антивирусной (специфической) активности химиопрепаратов нового поколения, а также для создания вакцины/ 1 ил., 3 табл.

Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ741 субтипа АЕ для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1186.